1. 引言
脓毒症是严重感染、创伤等患者病程中出现的一种严重并发症，是ICU患者的主要死亡因素[1]。脓毒症心功能障碍(sepsis induced myocardial dysfunction, SIMD)是因脓毒症所致的心肌抑制，表现为心脏收缩功能减弱，心脏扩大、射血分数下降等[2]。研究表明，SIMD患者的病死率高达70%~90%，明显高于无SIMD脓毒症患者病死率的20%。因此，防治SIMD对于脓毒症患者至关重要[3]。桂枝去芍药加麻辛附子汤源于张仲景《金匮要略·水气病脉证并治》篇，“心下坚，大如盘，边如旋杯，水饮所作，桂枝去芍药加麻辛附子汤主之。”表明其主要适用于寒水内停，心阳失旷之证。临床研究发现其治疗病机以心肺肾阳气亏虚、水饮内停为主的心肺急症取得了明显效果[4]。然而目前尚未有关于桂枝去芍药加麻黄附子细辛汤治疗SIMD的系统研究。网络药理学通过整合生物学，药理学等知识构建“药物–成分–靶点–疾病”网络[5]。中药因其成分复杂、系统庞大，对研究造成了困难，网络药理学为其提供了新的有效途径[6]。分子对接能有效预测蛋白与配体之间的亲和能力和结合模式，进一步验证成分与靶点之间的相互作用关系及作用机制[7]。本研究通过网络药理学和分子对接技术初步探究了桂枝去芍药加麻辛附子汤治疗SIMD的作用机制，为桂枝去芍药加麻辛附子汤治疗SIMD的后续研究和临床治疗提供了理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 研究思路
本研究基于网络药理学及分子对接探索桂枝去芍药加麻辛附子汤治疗SIMD的药物成分与作用机制研究思路见于图1。
2.2. 桂枝去芍药加麻辛附子汤活性成分检索
将桂枝去芍药加麻辛附子汤中各药物利用计算机系统生物学实验室TCMSP数据库(TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索，获得每味药物的有效成分，根据药代动力学原理以口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%、类药性(drug likeness, DL) ≥ 0.18、药物半衰期(Half-life, HL) ≥ 4为条件筛选桂枝去芍药加麻辛附子汤的活性成分，并通过检索文献对其他作用明显或含量较多的活性成分予以补充。
2.3. 靶点信息检索及交集靶点构建
从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中查询得到活性成分相关信息，将相关信息导入Swiss Target Prediction预测成分作用靶点，并在GeneCards (https://www.genecards.org/)输入“Septicemia induced myocardial injury”进行人类基因检索得到疾病作用靶点。将成分作用靶点与疾病作用靶点使用Venny网站(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)构建交集，获得桂枝去芍药加麻黄细辛附子汤治疗SIMD的交集靶点。
Figure 1. Flowchart of the mechanism research process of cinnamon twig decoction without peony combined with ephedra and aconite and Asarum decoction in the treatment of SIMD
图1. 桂枝去芍药加麻辛附子汤治疗SIMD机制研究流程图
2.4. “药物–成分–靶点–疾病”网络构建
将2.2、2.3项中搜集得到的活性成分、药物作用靶点、疾病作用靶点以及交集靶点数据在Excel中制作“药物–成分–靶点–疾病”关系表和节点属性表，将以上两表数据导入Cytoscape 3.10.2中生成网络图，使用Network Analyzer插件对网络进行拓扑分析，构建“药物–成分–靶点–疾病”网络图。根据桂枝去芍药加麻辛附子汤中每味药物活性成分的关联度排名筛选出关键活性成分。
2.5. 蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction, PPI)网络构建
将桂枝去芍药加麻辛附子汤治疗SIMD的交集靶点导入STRING数据库(https://www.string-db.org/)，选择物种为人类(Homo sapiens)，下载生成的PPI结果文件。将结果文件导入Cytoscape软件，使用Network Analyzer插件对结果进行拓扑学分析，进一步构建PPI可视图，并筛选度值前20的靶点进一步分析，根据其度值制成柱状图，并根据度值排名确定核心靶点。
2.6. 基因本体(Gene Ontology, GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书
(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析
将交集靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)中进行GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析。其中GO功能富集分析主要包括生物过程(Biological process, BP)、细胞组成(Cellular component, CC)以及分子功能(Molecular function, MF)。筛选GO富集分析前10项结果制成可视化柱状图；筛选KEGG富集分析前20通路制成可视化气泡图。
2.7. 分子对接
从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载关键活性成分的2D结构PDB格式文件，再从RCSB PDB网站(https://www.rcsb.org/)中搜索得到核心靶点的化学结构，在Uniprot网站(https://www.uniprot.org/)对其化学结构进行搜索，选择并下载其3D结构。利用MOE软件，对转化为PDB格式的关键活性成分分子和核心靶点蛋白进行对接模拟计算，结合能 ≤ −5.0 kJ·mol−1证明关键活性成分分子与核心靶点蛋白对接较好。
3. 结果
3.1. 桂枝去芍药加麻辛附子汤活性成分检索
通过TCMSP数据库根据条件检索得到桂枝去芍药加麻辛附子汤活性成分共142个，其中桂枝5个，生姜4个，大枣23个，甘草68个，麻黄17个，细辛7个，附子18个，其具体信息见表1 (除生姜外每味中药仅列出OB排名前5的化合物)。
Table 1. Information table of the cinnamon twig decoction without peony combined with ephedra and aconite and asarum decoction
表1. 桂枝去芍药加麻辛附子汤活性成分信息表
Mol ID |
化合物名称 |
OB (%) |
DL |
FASA- |
HL |
来源 |
MOL001736 |
(-)-taxifolin |
60.51 |
0.27 |
0.41 |
14.37 |
桂枝 |
MOL011169 |
Peroxyergosterol |
44.39 |
0.82 |
0.24 |
4.06 |
桂枝 |
MOL000359 |
sitosterol |
36.91 |
0.75 |
0.22 |
5.37 |
桂枝 |
MOL006129 |
6-methylgingediacetate2 |
48.73 |
0.32 |
0.25 |
5.44 |
生姜 |
MOL001771 |
poriferast-5-en-3beta-ol |
36.91 |
0.75 |
0 |
5.07 |
生姜 |
MOL012940 |
Spiradine A |
113.52 |
0.61 |
0.27 |
15.71 |
大枣 |
MOL012992 |
Mauritine D |
89.13 |
0.45 |
0.03 |
4.91 |
大枣 |
MOL003410 |
Ziziphin_qt |
66.95 |
0.62 |
0.24 |
10 |
大枣 |
MOL000211 |
Mairin |
55.38 |
0.78 |
0.26 |
8.87 |
大枣 |
MOL012980 |
Daechuine S6 |
46.48 |
0.79 |
0.3 |
6.09 |
大枣 |
MOL002311 |
Glycyrol |
90.78 |
0.67 |
0.28 |
9.85 |
甘草 |
MOL004891 |
shinpterocarpin |
80.3 |
0.73 |
0.32 |
6.5 |
甘草 |
MOL005017 |
Phaseol |
78.77 |
0.58 |
0 |
9.64 |
甘草 |
MOL004841 |
Licochalcone B |
76.76 |
0.19 |
0 |
17.02 |
甘草 |
MOL004810 |
glyasperin F |
75.84 |
0.54 |
0 |
15.64 |
甘草 |
MOL005190 |
eriodictyol |
71.79 |
0.24 |
0.38 |
15.81 |
麻黄 |
MOL004328 |
naringenin |
59.29 |
0.21 |
0.4 |
16.98 |
麻黄 |
MOL000098 |
quercetin |
46.43 |
0.28 |
0.38 |
14.4 |
麻黄 |
MOL001460 |
Cryptopin |
78.74 |
0.72 |
0.21 |
21.25 |
细辛 |
MOL012140 |
4,9-dimethoxy-1-vinyl-$b-carboline |
65.3 |
0.19 |
0.27 |
9.85 |
细辛 |
MOL001558 |
sesamin |
56.55 |
0.83 |
0.31 |
13.44 |
细辛 |
MOL002962 |
(3S)-7-hydroxy-3-
(2,3,4-trimethoxyphenyl)chroman-4-one |
48.23 |
0.33 |
0.24 |
16.64 |
细辛 |
MOL000422 |
kaempferol |
41.88 |
0.24 |
0 |
14.74 |
细辛 |
MOL002421 |
ignavine |
84.08 |
0.25 |
0.32 |
28.93 |
附子 |
MOL002398 |
Karanjin |
69.56 |
0.34 |
0.26 |
13.15 |
附子 |
MOL002415 |
6-Demethyldesoline |
51.87 |
0.66 |
0.12 |
13.14 |
附子 |
MOL002397 |
karakoline |
51.73 |
0.73 |
0.15 |
11.1 |
附子 |
MOL002422 |
isotalatizidine |
50.82 |
0.73 |
0.14 |
11.59 |
附子 |
MOL000358 |
beta-sitosterol |
36.91 |
0.75 |
0.23 |
5.36 |
生姜、桂枝 |
MOL000449 |
Stigmasterol |
43.83 |
0.76 |
0.22 |
5.57 |
麻黄、生姜 |
MOL004576 |
taxifolin |
57.84 |
0.27 |
0.39 |
14.41 |
麻黄、桂枝 |
3.2. 靶点信息检索及交集靶点构建
将有效成分通过PubChem检索后将其信息在Swiss Target Prediction数据库查询，去重后共获得桂枝去芍药加麻辛附子汤药物成分作用靶点1172个，在GeneCards中查询得到疾病作用靶点2379个。将药物靶点与疾病靶点使用Venny网站构建交集，获得桂枝去芍药加麻辛附子汤的交集靶点，共418个(图2)。
Figure 2. Venn diagram of drug component targets and disease targets
图2. 药物成分作用靶点与疾病作用靶点韦恩图
3.3. “药物–成分–靶点–疾病”网络构建
将活性成分、药物作用靶点、疾病作用靶点以及交集靶点数数据通过Excel处理后导入Cytoscape软件，进行可视化处理后得到“药物–成分–靶点疾病”网络(图3)。网络中圆形节点代表药物成分，矩形节点代表作用靶点，边代表节点之间的相互作用关系，根据中药活性成分中每位药物的关联度排名确定关键活性成分为甘草查尔酮A (licochalcone A)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、6-甲基姜二醇双乙酸2 (6-methylgingediacetate2)、2,7-二去乙酰基-2,7-二苯酰–云南紫杉宁F (2,7-Dideacetyl-2,7-dibenzoyl-taxayunnanine F)、细辛素(ZINC05223929)，其关联度信息见表2。
Figure 3. Network diagram of “drug-ingredient-target-disease”
图3. “药物–成分–靶点–疾病”网络图
Table 2. Information table for correlation analysis of key active ingredients
表2. 关键活性成分关联度分析信息表
Mol ID |
有效成分 |
中文名 |
节点名称 |
来源药物 |
Degree |
MOL000497 |
licochalcone A |
甘草查尔酮A |
GC59 |
甘草 |
59 |
MOL002406 |
2,7-Dideacetyl-2,7-
dibenzoyl-taxayunnanine F |
2,7-二去乙酰基-2,7-
二苯酰–云南紫杉宁F |
FZ6 |
附子 |
55 |
MOL000358 |
beta-sitosterol |
β-谷甾醇 |
GZ2 |
桂枝 |
54 |
MOL006129 |
6-methylgingediacetate2 |
6-甲基姜二醇双乙酸2 |
SJ2 |
生姜 |
54 |
MOL000358 |
beta-sitosterol |
β-谷甾醇 |
MH5 |
麻黄 |
53 |
MOL000358 |
beta-sitosterol |
β-谷甾醇 |
DZ9 |
大枣 |
53 |
MOL009849 |
ZINC05223929 |
细辛素 |
XX7 |
细辛 |
47 |
3.4. 蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction, PPI)网络构建
利用STRING网站绘制PPI蛋白互作网络图(图4)，下载结果文件，将结果文件导入Cytoscape软件，利用Network Analyzer插件进行拓扑分析，据此进行可视化处理，重新构建PPI可视化网络图(图5)。网络中共有418个节点，10,900条边，节点的大小与颜色由靶点的度值决定，节点越大，颜色越深，说明节点在网络中的度值越大。根据拓扑分析结果筛选度值排名前20的靶点，将靶点的度值制成可视化柱状图(图6)，根据度值选定核心靶点为AKT1 (丝氨酸/苏氨酸激酶1)、TNF (肿瘤坏死因子)、IL6 (白介素-6)、GAPDH (甘油醛-3-磷酸脱氢酶)。
Figure 4. PPI network diagram
图4. PPI网络图
Figure 5. PPI visualization network diagram
图5. PPI可视化网络图
Figure 6. Visual bar chart
图6. 可视化柱状图
3.5. 基因本体(Gene Ontology, GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书
(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析
Figure 7. Intersection target GO enrichment analysis bar chart
图7. 交集靶点GO富集分析柱状图
通过DAVID数据库对418个交集靶点进行GO功能富集分析，共筛选得到1746个条目，其中BP 1306个、MF 288个、CC 152个。在P值排名前20的条目中，BP主要涉及磷酸化、炎症反应、凋亡过程的负调控、对脂多糖的反应、细胞增殖的积极调节、细胞迁移的积极调节等；CC主要包括等离子膜、细胞质、细胞外泌体、膜筏、细胞外区域等；MF主要涉及三磷酸腺苷结合酶结合、相同的蛋白质结合、酶结合、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白质结合等。KEGG信号通路富集分析共得到197条通路，P值排名前20的条目主要涉及癌症中的通路、脂质与动脉粥样硬化、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、流体剪切应力与动脉粥样硬化、细胞凋亡等，表明桂枝去芍药加麻辛附子汤治疗SIMD主要通过调节上述多条通路发挥治疗作用。按P值排序，BP、CC、MF选取排名前10的项目进行可视化展示(图7)。KEGG选取排名前20的项目进行可视化展示(图8)。
Figure 8. Intersection target KEGG enrichment analysis bubble plot
图8. 交集靶点KEGG富集分析气泡图
3.6. 分子对接
将4个核心靶点(TNF, IL6, AKT1, GADPH)与5个关键活性成分(licochalcone A, beta-sitosterol, 6-methylgingediacetate2, 2,7-Dideacetyl-2,7-dibenzoyl-taxayunnanine F, ZINC05223929)进行分子对接，得到的靶点–成分对接结果如表3所示，将其数据导入微生信网站中形成热图如图9所示，4个核心靶点与5个关键成分均形成氢键稳定结合。将部分对接结果进行进一步可视化展示(图10)。
Table 3. Molecular docking information table
表3. 分子对接信息表
序号 |
蛋白名称 |
PDB ID |
化合物名称 |
结合能 |
1 |
AKT1 |
1h10 |
licochalcone A |
−5.6626 |
2 |
AKT1 |
1h10 |
2,7-Dideacetyl-2,7-dibenzoyl-taxayunnanine F |
−5.8829 |
3 |
AKT1 |
1h10 |
beta-sitosterol |
−6.0385 |
4 |
AKT1 |
1h10 |
6-methylgingediacetate2 |
−5.2084 |
6 |
AKT1 |
1h10 |
ZINC05223929 |
−5.5183 |
7 |
TNF |
4zch |
licochalcone A |
−6.3323 |
8 |
TNF |
4zch |
2,7-Dideacetyl-2,7-dibenzoyl-taxayunnanine F |
−6.9633 |
9 |
TNF |
4zch |
beta-sitosterol |
−6.1124 |
10 |
TNF |
4zch |
6-methylgingediacetate2 |
−5.1705 |
12 |
TNF |
4zch |
ZINC05223929 |
−6.4622 |
13 |
IL6 |
1alu |
licochalcone A |
−6.1666 |
14 |
IL6 |
1alu |
2,7-Dideacetyl-2,7-dibenzoyl-taxayunnanine F |
−6.5425 |
15 |
IL6 |
1alu |
beta-sitosterol |
−6.0017 |
16 |
IL6 |
1alu |
6-methylgingediacetate2 |
−5.5869 |
18 |
IL6 |
1alu |
ZINC05223929 |
−5.456 |
19 |
GADPH |
1u8f |
licochalcone A |
−6.4168 |
20 |
GADPH |
1u8f |
2,7-Dideacetyl-2,7-dibenzoyl-taxayunnanine F |
−8.6655 |
21 |
GADPH |
1u8f |
beta-sitosterol |
−7.4395 |
22 |
GADPH |
1u8f |
6-methylgingediacetate2 |
−6.4263 |
24 |
GADPH |
1u8f |
ZINC05223929 |
−6.3704 |
Figure 9. Molecular docking scoring heatmap
图9. 分子对接评分热图
Figure 10. Visualization of partial molecular docking results
图10. 部分分子对接结果可视化图
4. 讨论
脓毒症心肌功能障碍(sepsis-induced myocardial dysfunction, SIMD)在脓毒症患者中十分常见，对于脓毒症患者的预后具有严重的不良影响。尽早防治SIMD对脓毒血症患者极为重要[8]。桂枝去芍药加麻辛附子汤是《金匮要略》中的经典方剂，可调和营卫，外解风寒，内化水饮。尤其适用于治疗心肺肾阳气亏虚、水饮内停所致的心功能障碍[4]。因此，桂枝去芍药加麻辛附子汤在治疗SIMD上具有良好的应用前景。
本研究采用网络药理学方法得到桂枝去芍药加麻辛附子汤活性成分142个，相关靶点1172个，SIMD疾病靶点2379个，药物–疾病交集靶点418个，活性成分甘草查尔酮A、β-谷甾醇、6-甲基姜二醇双乙酸2、2,7-二去乙酰基-2,7-二苯酰–云南紫杉宁、细辛素等可能是桂枝去芍药加麻辛附子汤治疗SIMD的关键成分。已有研究表明，甘草查尔酮A可通过抑制NF-κB激活，激活PPARγ/Nrf2/HO-1通路，缓解线粒体氧化应激等机制发挥对心肌细胞损伤的保护作用作用[9] [10]。β-谷甾醇主要可以使细胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等因子生成减少起到抗炎作用[11]；还能影响巨噬细胞NO、ROS的产生及炎症介质的表达，进而使血浆总胆固醇、低密度脂蛋白、C反应蛋白含量降低，血管细胞黏附因子的表达下调，改善主动脉根部粥样病变的面积[12]；还可以对乌头碱、哇巴因及心肌缺血引起的心率失常有明显抑制作用[13]。6-甲基姜二醇双乙酸2属于黄酮类物质。研究显示，黄酮类物质不仅可以抑制炎症细胞功能以及抑制促炎细胞因子和趋化因子的表达，发挥抗炎作用和抗氧化活性[14]，还具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化和保护心脏的作用[15] [16]细辛素主要与环氧化酶(COX)-2有关，发挥抗炎作用[17]；总而言之，桂枝去芍药加麻辛附子汤的核心成分可以通过多种途径发挥抗炎、改善粥样斑块、抑制心律失常、保护心肌等作用治疗SIMD。
通过PPI网络拓扑分析得到的前4位核心靶点包含AKT1 (丝氨酸/苏氨酸激酶1)，TNF (肿瘤坏死因子)，IL6 (白介素-6)，GAPDH (甘油醛-3-磷酸脱氢酶)，推测其可能是桂枝去芍药加麻辛附子汤治疗SIMD的关键靶点。其中AKT1属于蛋白激酶B (AKT)，具有丰富表达，调节心肌细胞代谢、生长和存活的作用，研究发现，激活AKT1可以减轻缺氧/再灌注损伤、促进缺氧心肌细胞存活[18]；还可以通过激活NF-κB信号通路，诱导炎症反应的发生[19]。TNF途径可抑制心肌和内皮细胞凋亡[19]，并且作为一种具有强烈炎性介质诱导作用的物质，与炎症密切相关[20]。IL6为免疫反应调节因子，是炎症反应的主要调控者[19]。肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和白细胞介素(IL)是脓毒症发展过程中的中心介质，其失调可以造成心肌结构破坏、前负荷增加、心肌收缩功能抑制，使心功能障碍加重，可作为临床实践中脓毒症的监测指标[21]。GAPDH主要参与体液免疫反应和NF-κB信号传导[22]。总之，桂枝去芍药加麻辛附子汤通过调节AKT1、TNF、IL6、GAPDH等关键作用靶点，多途径发挥对SMD的治疗作用。
KEGG富集分析发现排名靠前的通路主要涉及癌症中的通路、脂质与动脉粥样硬化、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、流体剪切应力与动脉粥样硬化、细胞凋亡等方面。癌症中的通路有多种途径可与炎症联系协调起来，例如通过关键的协调因子如转录因子(NF-κB) [23]。脂质与动脉粥样硬化通路验证了桂枝去芍药加麻辛附子汤核心靶点可能通过影响脂质代谢改善心脏供血来改善心肌损伤。AGE-RAGE信号通路的激活能够破坏细胞的氧化还原平衡，调节各种细胞死亡途径以及氧化应激反应[24]，以此改善心肌损伤。细胞凋亡通路表明核心靶点可能通过阻止心肌细胞凋亡改善心肌损伤。流体剪切力与动脉硬化信号通路可以血管内皮细胞功能，研究发现，流体剪切力可通过促进血管紧张素转换酶II生成，抑制内皮细胞增殖和炎症反应，促进NO生成，对心力衰竭的发生发展进行调节[25]。
总而言之，本研究基于网络药理学和分子对接的方法，初步探究了桂枝去芍药加麻辛附子汤的活性成分以及其治疗SIMD的作用机制，得出药物核心成分甘草查尔酮A、β-谷甾醇、6-甲基姜二醇双乙酸2、2,7-二去乙酰基-2,7-二苯酰–云南紫杉宁、细辛素可与核心靶点AKT1、TNF、IL-6、GADPH良好结合，通过癌症中的通路、脂质与动脉粥样硬化、AGE-RAGE信号通路等多通路协同治疗SIMD，为桂枝去芍药加麻辛附子汤治疗SIMD的进一步临床治疗和实验研究奠定了基础。
NOTES
*通讯作者。