HECTD3在上皮性卵巢癌中的表达及对铂耐药的影响

Expression of HECTD3 in Epithelial Ovarian Cancer and Its Effect on Platinum Resistance

摘要: 目的：探讨HECTD3基因在卵巢癌组织中的表达，对上皮性卵巢癌铂耐药现象的影响及预后价值。方法：采用免疫组化法检测我院上皮性卵巢癌组织中HECTD3蛋白的表达情况，比较HECTD3蛋白表达与患者临床病理特征之间的相关性，利用HPA、GEPIA2和Kaplan-Meier Plotter数据库分别分析HECTD3蛋白在卵巢癌组织中的表达和预后价值；GSEA和CIBERSORT算法分别分析HECTD3高低表达组主要富集通路和HECTD3表达卵巢癌中主要免疫细胞的免疫浸润关系。结果：HECTD3蛋白在上皮性卵巢癌组织中高表达，且其高表达与卵巢癌的复发，尤其是铂耐药复发相关。Kaplan-Meier Plotter预后分析提示HECTD3基因高表达的患者预后更差(P < 0.05)。富集分析结果显示，HECTD3高低组差异基因主要富集在雌激素信号转导途径、IL6/JAK/STAT3信号通路等。CIBERSORT算法分析发现HECTD3基因与肿瘤微环境中中性粒细胞、CD4+记忆静息T细胞的浸润程度呈正相关(P < 0.05)。结论：在卵巢癌组织中，HECTD3蛋白的表达显著上调，它或许通过调控IL-6/JAK/STAT3信号通路以及影响肿瘤微环境中免疫细胞的浸润，进而加剧卵巢癌患者的铂类药物耐药复发，最终对患者的预后产生不利影响。

Abstract: Objective: To investigate the expression of HECTD3 gene in ovarian cancer, its impact on the development of platinum resistance, and its prognostic significance. Methods: Immunohistochemistry was employed to examine the expression of HECTD3 protein in epithelial ovarian cancer tissues obtained from our hospital. The association between HECTD3 protein expression and patients’ clinical pathological features was evaluated. Additionally, we utilized the HPA, GEPIA2, and Kaplan-Meier Plotter databases to analyze the expression levels and prognostic significance of HECTD3 protein in ovarian cancer tissues. Furthermore, GSEA analysis was conducted to identify the key pathways enriched in HECTD3 high and low expression groups, while the CIBERSORT algorithm was applied to investigate the relationship between HECTD3 expression and immune cell infiltration in ovarian cancer. Results: HECTD3 was highly expressed in epithelial ovarian cancer, with elevated expression associated with recurrence, particularly platinum-resistant recurrence. Kaplan-Meier analysis indicated that patients with high HECTD3 expression had poorer prognosis (P < 0.05). Enrichment analysis revealed that differentially expressed genes in HECTD3 were primarily involved in estrogen signaling and IL6/JAK/STAT3 pathways. CIBERSORT analysis demonstrated a positive correlation between HECTD3 expression and the infiltration of neutrophils and CD4+ memory resting T cells in the tumor microenvironment (P < 0.05). Conclusion: HECTD3 protein is significantly upregulated in ovarian cancer tissue, potentially exacerbating platinum resistance through modulation of the IL-6/JAK/STAT3 signaling pathway and influencing immune cell infiltration in the tumor microenvironment, ultimately adversely affecting patient prognosis.

1. 引言

上皮性卵巢癌是一种常见的女性生殖系统恶性肿瘤，其往往起病隐匿，早期诊断困难，从而导致多数患者就诊时已进展至晚期，这使得卵巢癌被列为癌症死亡的第五大主要原因[1]。尽管现有的手术治疗、以铂类为基础的化疗和维持治疗的治疗模式已取得了显著的进展，但是想要获取更好的临床预后仍需依赖于综合诊疗方案的进一步发展[2]。目前铂类药物为基础的化疗仍是一线治疗方案，且大多数患者最初对铂类化疗反应敏感，这些最初对铂敏感的患者在经历多次复发及化疗后，往往会发展成继发性铂类耐药，进而导致其无进展生存期显著缩短[3]。最终铂类药物耐药性的发展成为了影响所有卵巢癌患者预后的一个关键因素。为了提高卵巢癌诊疗的效率，积极识别与肿瘤细胞增殖和迁移相关的候选基因具重大的实践意义。但铂类耐药的分子基础在很大程度上仍未确定，因此相关特定基因、通路的鉴定有望改善铂类难治性肿瘤治疗情况和防止铂耐药的出现。

泛素化作为一种常见的翻译后修饰，动态调节维持细胞稳态的相关蛋白。在泛素化过程中，泛素与靶蛋白底物偶联，从而实现对底物蛋白的降解、易位或激活[4] [5]。泛素化过程的失调与多种癌症的发生有关[6]。E3泛素连接酶能够靶向部分癌蛋白或抑癌蛋白启动级联反应，从而在不同肿瘤中充当促癌因子或抑癌因子参与相关癌症通路[7] [8]。E3连接酶可分为三个家族：RING E3s、HECT E3s和RBR E3s [9]，其中HECTD3是近年来新发现的一种属于HECT家族E3连接酶，在羧基末端具有HECT催化结构域[10]。研究表明HECTD3在乳腺癌中高表达，并与caspase-8相互作用阻止caspase-8活化，从而抑制顺铂诱导的凋亡与不良预后相关[11]。同时在食管鳞状细胞癌中，HECTD3可靶向作用于caspase-9抑制其活化促进癌细胞生长[12]。HECTD3在不同的肿瘤中通过靶向不同蛋白的泛素化与多聚泛素化影响肿瘤的进展。本研究采用免疫组化联合生物信息学方法探索HECTD3在上皮性卵巢癌的表达、进展及局部免疫微环境中的作用。

2. 材料与方法

2.1. 数据库资料

GEPIA2 (GEPIA2 (http://gepia2.cancer-pku.cn/#general))是一个能够对TCGA和GTEx数据库的肿瘤和正常样本进行基因表达分析的交互式的在线网络分析平台。我们利用该平台获得了HECTD3的表达与预后数据信息。使用Kaplan-Meier Plotter数据库(网址：http://kmplot.com)分析HECTD3对卵巢癌患者生存的影响[13] [14]。同时，我们使用the human protein atlas(HPA)数据库(The Human Protein Atlas)获得HECTD3免疫组织化学染色图像。从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)下载卵巢癌患者的转录组RNA-seq数据和相应的临床数据。

2.2. 临床样本来源

49例卵巢癌组织，取自2018年1月至2022年12月青岛大学附属医院妇科行手术治疗的上皮性卵巢癌患者。本研究所有标本使用均获得青岛大学附属医院伦理委员会批准(QYFYWZLL28375)。

2.3. 免疫组织化学染色

采用免疫组化法检测HECTD3在癌组织中的表达，具体步骤操作如下：(1) 石蜡组织切片.(2) 脱蜡水化：用二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ依次脱蜡10 min，按照顺序放梯度乙醇(100%、95%、85%、75%)每个梯度5 min，后继续用蒸馏水冲洗。(3) 抗原修复：在0.01 mol/L柠檬酸缓冲中用微波炉对抗原进行修复，取出染色盒自然冷却到室温后放在5%BSA工作液进行封闭。(4) 封闭：滴加3%山羊血清覆盖组织，室温孵育45~60 min。(5) 一抗孵育：加入HECTD3抗体(工作浓度为1∶100)，37℃恒温箱内孵育30 min后，4℃湿盒内过夜(14~16 h)。(6) 染色、观察：滴加对应种属二抗，在室温孵育40 min 后，PBS荡洗3次，DAB显色，及时终止。(7) 复染：滴加苏木素完全覆盖组织复染1 min，蒸馏水水洗。(8) 梯度乙醇脱水，晾干后中性树胶封片，光镜下观察结果。结果判读阳性染色标准为：在细胞膜或浆内出现棕黄色颗粒。在高倍镜(×400)下计数5个视野，分别对阳性细胞数所占比例进行分级评分，评分标准为：0分为阴性，染色细胞数<10%；1分为弱阳性染色细胞数占10%~25%；2分为阳性，染色细胞数25~50%，3分为强阳性，染色细胞数为 > 50% [15]。染色强度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分；以染色强度评分乘以阳性细胞所占百分比评分为IRS (范围为0~9分)，IRS < 5分判定为是HECTD3蛋白低表达，IRS ≥ 5分判定为是HECTD3蛋白高表达。

2.4. 基因富集分析

Hallmark和C7基因组v6.2集合从Molecular Signatures Database下载。所有样本的全转录组信息用于Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)分析，且只有NOM (p < 0.05)和FDR (q < 0.06)的基因组被认为是显著的。

2.5. 免疫相关性分析

采用Cell-type Identification By Estimating Relative Subsets Of RNA Transcripts (CIBERSORT)算法分析HECTD3与肿瘤环境中T细胞、NK细胞、巨噬细胞以及其他免疫细胞的相关性。

2.6. 统计学方法

使用SPSS27.0统计软件进行数据处理分析，采用χ²检验或Fisher确切概率法分析HECTD3不同表达水平组与临床病理特征的差异。采用Spearman检验分析HECTD3与卵巢癌免疫浸润的相关性。P < 0.05为有统计学差异。

3. 结果

3.1. HECTD3在上皮性卵巢癌组织中的表达

通过探索HECTD3蛋白的IHC染色结果显示，在卵巢癌中HECTD3蛋白质水平上调。使用HPA数据库查阅HECTD3在卵巢癌组织和正常卵巢上皮组织的表达，发现其在6位患者癌组织中呈现高中度染色，在3个正常卵巢组织中为低中度染色(图1(A)，图1(B))。同时利用免疫组织化学染色法对我院49例上皮性卵巢癌组织进行染色。HECTD3主要表达在细胞质，少数胞核也有表达，且59% (29/49)在上皮性卵巢癌组织中高表达(图1(C)~(F))。

Figure 1. Expression of HECTD3 protein in epithelial ovarian cancer. (A) (B) The staining of HECTD3 in normal ovarian tissue and ovarian cancer tissue in the HPA database respectively; (C) The staining intensity of HECTD3 was brown (3 marks); (D) The staining intensity of HECTD3 was yellow (2 marks); (E) HECTD3 staining intensity light yellow (1 mark); (F) HECTD3 no staining (0 mark)

图1. 上皮性卵巢癌组织中HECTD3蛋白表达。(A) (B) 分别为HECTD3在HPA数据库正常卵巢组织与卵巢癌组织中的染色情况；(C) HECTD3染色强度为棕褐色(3分)；(D) HECTD3染色强度为黄色(2分)；(E) HECTD3染色强度为淡黄色(1分)；(F) HECTD3无着色(0分)

3.2. HECTD3表达与上皮性卵巢癌患者预后的相关性

根据GEPIA2分析平台检索结果显示，共424例病例数，HECTD3高表达组212例，HECTD3低表达组212例；HECTD3高表达组较HECTD3低表达组卵巢癌患者总生存期(OS)低(图2(A))，而两者无病生存期(DFS)没有差异(图2(B))。使用Kaplan-Meier Plotter 网站分析HECTD3表达与卵巢癌患者无进展生存期(PFS)和OS的关系。PFS的分析中满足条件的病例数有1207例，高表达患者767例，低表达患者440例；高表达患者死亡风险比HR = 1.26 (1.08~1.47)，logrank P = 0.0026 (图2(C))。OS分析中满足条件病例数为1533例，高表达患者967例，低表达患者566例；HR = 1.16 (0.99~1.37)，logrank P = 0.062，没有显著统计学差异(图2(D))。GEPIA2与Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果均提示HECTD3高表达是卵巢癌患者不良预后的危险因素。

(A) (B)

(C) (D)

Figure 2. Correlation between the expression of HECTD3 and prognosis in patients with epithelial ovarian cancer. (A) (C) The effect of HECTD3 expression on OS in patients with epithelial ovarian cancer; (B) DFS; (D) PFS

图2. HECTD3表达与上皮性卵巢癌患者预后的相关性。(A) (C) HECTD3表达对上皮性卵巢癌患者OS的影响；(B) DFS；(D) PFS

3.3. HECTD3表达与上皮性卵巢癌临床病理特征的关系

在检测的49例上皮性卵巢癌组织芯片中，59% (29/49)的组织标本呈HECTD3高表达。卡方检验结果显示是否复发、复发类型与HECTD3的表达水平密切相关(P < 0.05)。其中HECTD3表达水平与临床病理因素包括年龄、初始肿瘤大小、FIGO分期、初诊CA125、腹水、网膜转移、淋巴转移、BRCA状态均无关(表1)。

Table 1. Correlation between the expression of HECTD3 in epithelial ovarian cancer tissues and clinicopathological features of patients

表1. 上皮性卵巢癌组织中HECTD3的表达与患者临床病理特征的相关性

参数		例数	HECTD3表达水平(例)		χ^2	P值
		低表达	高表达
总数		49	20	29
初诊年龄	≤60	27	13	14	1.338	0.247
	>60	22	7	15
FIGO分期	I + II	11	3	8	0.475^*	0.491
	III + IV	38	17	21
血清CA125 (U/ml)	≤600	21	11	10	2.035	0.154
	>600	28	9	19
腹水量(ml)	≤1000	33	15	18	1.135^*	0.287
	>1000	16	4	12
初始肿瘤长径(cm)	≤10	30	13	17	0.203	0.652
	>10	19	7	12
网膜转移	阴性	20	6	14	1.637	0.201
	阳性	29	14	15
淋巴结转移	阴性	18	7	11	0.044	0.834
	阳性	31	13	18
复发	无	12	9	3	5.491^*	0.019
	有	33	10	23
复发类型	铂敏感	15	8	7	-	0.020
	铂耐药	18	2	16

注：^*表示采用连续校正卡方，^--表示采用Fisher确切概率法。

3.4. HECTD3高低表达组差异基因富集分析

通过对HECTD3高表达组和HECTD3低表达组进行GSEA富集分析。HECTD3高表达组中的基因主要富集在雌激素信号转导、IL6/JAK/STAT3、IFN-γ信号通路及细胞增殖相关通路(图3(A)，图3(B))，对于HECTD3低表达组基因主要富集在DNA修复，MYC基因调节亚组及氧化磷酸化通路(图3(C))。对于MSigDB定义的C7基因组，在高HECTD3表达组中富集了单核细胞早期免疫激活、胸腺细胞发育等多个免疫基因集，而在HECTD3低表达组富集到较少免疫相关基因(图3(B))。

3.5. HECTD3与免疫浸润的关系

为了深入验证HECTD3表达与免疫微环境中免疫细胞之间的相关性，我们用CIBERSORT算法对肿瘤浸润免疫细胞亚群的构成比例进行分析，并在癌组织样本中绘制涵盖21种免疫细胞分布图谱(图4(A))。经过差异性和相关性分析总共6种肿瘤浸润性免疫细胞与HECTD3的表达呈现出显著相关性。其中与中性粒细胞、CD4记忆静息T细胞与HECTD3表达呈正相关。嗜酸性粒细胞、γδT细、NK细胞、浆细胞与HECTD3表达呈负相关(图4(B))。

(A) (B)

(C) (D)

(E) (F)

Figure 3. Differential gene enrichment analysis of HECTD3 high-low expression group. (A) Top 1~6 HALLMARK gene sets enriched in high HECTD3 samples are shown. Each line represents a gene set in a unique color. Upregulated genes are on the left near the origin; downregulated genes are on the right. Only gene sets with NOM P < 0.05 and FDR q < 0.06 are included. (B) Top 7~11 HALLMARK gene sets enriched in high HECTD3 samples are displayed. (C) Gene sets enriched in low HECTD3 samples within the HALLMARK collection are presented. (D) Top 1~6 immune gene sets (C7 collection) enriched in high HECTD3 samples are shown. (E) Top 7~11 immune gene sets (C7 collection) enriched in high HECTD3 samples are displayed. (F) Gene sets enriched in low HECTD3 samples within the C7 collection are presented

图3. HECTD3高低表达组差异基因富集分析。(A) 高HECTD3表达样本在HALLMARK集合中富集前1~6个基因集。在图中，每一条线均代表一个特定的基因组，以独特的颜色标示。其中，上调的基因被绘制在靠近坐标原点的左侧，而下调的基因则位于x轴的右侧。为确保结果的显著性，我们仅考虑NOM P值小于0.05且FDR q值小于0.06的基因组。(B) 高HECTD3表达样本在HALLMARK集合中富集前7~11个基因集。(C) 低HECTD3表达的样本在HALLMARK中富集的基因集。(D) 高HECTD3表达的样本富集C7集合中的基因集，即免疫基因集。图中仅显示前1~6主要基因组。(E) 高HECTD3表达样本在C7集合中富集前7~11个基因集。(F) 低HECTD3表达的样本在C7集合中富集的基因集

4. 讨论

卵巢癌作为妇科最常见的恶性肿瘤之一，具有着较高的病死率和复发率[16]。卵巢癌的发生发展过程涉及众多癌基因的异常激活和抑癌基因的表达缺失，但截至目前具体分子机制尚不清晰。虽然近年来卵巢癌在诊断、手术治疗及维持治疗方面有了很大的进展，但其仍有着较高的复发率，患者预后较差[17]。因此探寻更有效的卵巢癌诊断与治疗相关的基因靶点，对于预防患者肿瘤复发和改善患者的预后具有至关重要的意义。

本研究通过采用生物信息学与免疫组化法联合分析HECTD3在卵巢癌中的表达变化，结果显示59%组织标本HECTD3呈高表达，表明HECTD3可能在癌症的进展中发挥重要作用。其多数呈胞浆表达，少数呈核表达，这符合HECTD3作为一个泛素化连接酶主要在胞质中发挥作用的特点。在HPA数据库中HECTD3在多数癌组织中高表达，相比之下在正常卵巢组织中则呈现中低表达，这与本研究所得结果是相一致的。据此可推断，HECTD3基因确实与卵巢癌的发展有着密切联系。同时本组发现HECTD3高表达者的PFS与OS比低表达者短。同时相关性分析显示在卵巢癌中HECTD3的高表达与癌症的复发及复发类型有关。

为了进一步分析其促进复发相关的分子机制，本研究将TCGA数据库所有患者分为HECTD3高表达组与低表达组进行差异基因富集分析发现，HECTD3高表达组功能主要富集在雌激素反应、IL6/JAK/STAT3信号通路、IFN-γ信号通路及细胞增殖相关通路。雌激素信号转导在包括高级别浆液性、低级别浆液性、子宫内膜样卵巢癌及颗粒细胞瘤在内的几种主要组织型中发挥重要功能[18]。国外学者对52项流行病学研究进行meta分析显示绝经后妇女长期使用激素替代疗法患卵巢癌的相对风险(RR)增加了1.20 (P < 0.0001)。且这种风险增加与浆液性(RR = 1.53)和子宫内膜样癌(RR = 1.42)亚型显著相关[19]。

(A)

(B)

CIBERSORT

(C)

Figure 4. Association of HECTD3 with immune invasion. (A) Bar plot showing the proportion of 21 types of immunity in ovarian tumor samples. The column name of the figure is the sample ID. (B) The proportions of 21 immune cell types in ovarian tumor samples with low or high HECTD3 expression were analyzed relative to the median HECTD3 expression level, and significance was assessed using the Wilcoxon rank-sum test. (C) The scatter plot showed that the proportion of 6 TIC types was correlated with the expression of HECTD3 (P < 0.05). The blue lines in each plot fit a linear model indicating that the proportionality of immune cells correlated with HECTD3 expression, and the Pearson coefficient was used to test for correlation

图4. HECTD3与免疫浸润的关系。(A) 条形图显示卵巢肿瘤样品中21种免疫的比例。图的列名为样品ID；(B) HECTD3低表达或高表达的卵巢肿瘤样本中21种免疫细胞相对于HECTD3表达水平中位数的比例分化，并使用Wilcoxon秩和检验进行显著性检验；(C) 散点图显示6种TIC的比例与HECTD3表达相关(P < 0.05)。每个图中的蓝线拟合线性模型，指示免疫细胞的比例趋向性与HECTD3表达相关，并且Pearson系数用于相关性检验

更有研究表明ERK级联介导的顺铂激活雌激素受体ERα和17β-雌二诱导的ERα激活抑制癌细胞凋亡减弱了顺铂诱导的细胞毒性，促进铂类耐药现象的产生。同样雌激素治疗或ER或雌激素相关受体表达增加通常与癌症中较高的顺铂耐药性相关[20] [21]。在卵巢癌的进展过程中，LI6/JAK/STST3通路往往出现异常激活的现象[22]。有学者观察到，患者血清和腹水中IL-6水平升高预示不良的临床预后。此外在IL-6高表达在卵巢癌顺铂耐药细胞系和从顺铂耐药卵巢癌患者中提取的原代细胞中。体外研究进一步揭示，在降低IL-6水平后能够恢复耐药的卵巢癌细胞对顺铂的敏感性[23]-[25]。在体外和体内研究中均发现IL-6水平与STAT3的激活之间存在直接联系。一方面STAT3通路介导卵巢肿瘤细胞中IL-6的自分泌产生。另一方面IL-6水平升高又可以激活周围细胞中的STAT3，从而增加这些细胞产生IL-6和其他细胞因子。这一反馈机制促进肿瘤细胞产生更多的IL-6，从而创造一个支持肿瘤生长和转移的炎性肿瘤环境，也同时促使腹膜转移和腹水的产生[26]。有研究证实，HECTD3的DOC结构域可以与STAT3结合后通过K27链促进STAT3的非降解泛素化，进而通过STAT3磷酸化与激活来实现对Th17细胞的调节影响免疫反应[27]。另外持续激活状态的STAT3也同时继续参与紫杉醇与铂类药物的耐药[28]-[30]。同时在HECTD3高低表达基因组均富集到紫外线应激反应的基因集合，提示其在DNA损伤后参与损伤修复或凋亡。DNA修复反应的已被证实参与修复卵巢癌铂类药物引起的DNA损伤，减少细胞凋亡[31]。同时我们研究结果表明HECTD3可能通过影响T细胞功能(如GSE30083)、炎症信号(如GSE9988)和免疫记忆(如GSE13485)，共同导致免疫逃逸或过度炎症，促进肿瘤生长与铂耐药现象的发生。

肿瘤微环境(TME)是影响是复发和化疗耐药的潜在因素[32]。独特的卵巢癌TME涉及卵巢癌细胞和基质细胞之间大量相互连接和复杂的高级串扰网络，作为癌症相关脂肪细胞、成纤维细胞、间皮细胞和免疫细胞，包括巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞、多形核中性粒细胞、髓源性抑制细胞和肿瘤浸润淋巴细胞，以及细胞外基质和腹水的成分，它们通过促进细胞生长、分化和侵袭性的信号分子在支持肿瘤进展与耐药中发挥重要作用[33]-[36]。几项研究表明，在肿瘤进展的初期阶段，中性粒细胞展现出抗肿瘤效应，而在肿瘤进入发展的侵袭阶段，中性粒细胞往往会削弱适应性抗肿瘤免疫反应，并根据微环境信号转而发挥更为显著的促肿瘤的作用[37] [38]。另外对患者标本的综合meta分析显示，中性粒细胞/淋巴细胞比值增加与铂类耐药和较差的患者生存率相关[39]。嗜酸性粒细胞、γδT细、NK细胞、浆细胞均可以肿瘤微环境中通过释放细胞毒性颗粒，如主要碱性蛋白、释放穿孔素和颗粒酶等直接识别和杀伤肿瘤细胞。因此HECTD3也可能通过调节免疫微环境中的免疫细胞参与卵巢癌的进展及铂耐药过程。

针对铂类耐药的卵巢癌，已探索了多种治疗策略，包括PARP抑制剂、抗血管生成剂、免疫检查点抑制剂与化疗的联合应用，这些治疗方案已初见成效。然而为更有效地对患者进行个体化治疗，需要更多的研究来确定能够更好地对患者进行分层的相关生物标志物。本研究认为HECTD3的表达升高通过增加肿瘤耐药性而影响患者预后，故未来结合针对该分子的靶向药物有望提升卵巢癌的治疗效果。HECTD3相关通路IL-6/JAK/STAT3、IFN-γ信号通路与免疫细胞的浸润的深入研究有可能为克服卵巢癌耐药开辟一条新的途径。

基金 项目

北京科创医学发展基金(KC2023-JX-0288-RM66)。

NOTES

^*通讯作者。