1. 引言
耐盐碱微生物是极端微生物的重要类群，能在氯化钠浓度超3%且pH值高于8.5的强碱性环境中正常代谢，在盐湖生态系统、人工盐田、盐渍化农田基质及碱性水体沉积物等典型高盐碱生境中形成稳定群落。如中国松嫩平原盐碱地(pH 8.5-10.5，盐分1%~5%)分离到多种耐盐碱芽孢杆菌[1]；埃及Wadi Natrun湖(pH 10-11，盐分20%~30%)是嗜盐碱古菌的重要来源[2]；美国大盐湖(盐分15%~28%)分离到耐盐菌Halomonas和Salinibacter [3]。在海洋生态系统中，藻类与细菌长期共生、协同进化[4]，微藻生长环境周边的藻际环境中存在着藻菌相互影响的微观区域，在此生长的细菌被称为藻际细菌[5]。藻类生长过程中会分泌氨基酸类、脂质、维生素及酶类等多种代谢产物[6]。本课题组成功从球等鞭金藻藻液中分离得到一株藻际细菌副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)。微细菌(Microbacterium spp.)是广泛存在于环境中的一种黄色棒状，革兰氏阳性杆菌[7]。副氧化微杆菌可从重金属污染土壤、植物和石油污染湖泊中分离出来，部分能通过表达Cr(VI)还原酶降低有毒重金属六价铬，还能释放挥发性硫化物促进植物生长[8]。
全基因组测序(Whole Genome Sequencing)是通过高通量测序手段解析生物体全部遗传信息的生物技术，能够完整揭示物种的基因组特征和功能元件[9]。在微生物研究领域，基因组解析流程主要涵盖核酸提取与测序、序列拼接与组装、基因组序列补全、开放阅读框识别以及实施功能注释等核心步骤，最终通过比较基因组学揭示菌株间的进化关系[10]。这项技术可系统性阐明盐碱耐受微生物的遗传特征及其环境适应机理，为相关研究奠定重要数据基础。
2. 耐盐碱微生物的核心适应机制
2.1. 渗透压调节
嗜盐碱菌类发展出精密的渗透压调控体系，主要通过KCl型(依赖胞内盐分积累机制)和有机渗透物型(基于相容性溶质合成机制)两种策略适应环境[11]。1972年，澳大利亚学者确立“相容性溶质”概念，它是一类能维持细胞渗透压平衡且不干扰细胞关键代谢进程，保护生物大分子结构与功能的有机小分子[12]。耐盐微生物构建以相容性溶质为核心的渗透调节系统，通过合成通路与运输网络精准调控渗透保护因子，建立稳定胞内渗透微环境。面临渗透胁迫时，启动应激调控网络，触发水合屏障重构机制，稳定蛋白质折叠中间态，建立跨膜渗透压梯度补偿系统[13]。借助高效液相色谱分析手段或是凭借核磁共振检测技术，研究人员成功分离并鉴定出大量的相容性溶质，主要涵盖氨基酸类(如谷氨酸、谷氨酰胺)、氨基酸衍生品类(包含四氢嘧啶、甘氨酸甜菜碱、羟基四氢嘧啶)、多糖类(例如海藻糖)以及聚醇类(以甘油为典型代表) [14]。
2.2. 细胞膜与细胞壁修饰
细胞膜是抵御盐碱胁迫的第一道屏障，其脂质组成的变化直接影响膜的流动性和稳定性。耐盐碱微生物通过增加磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol, PG)和心磷脂(Cardiolipin)的比例，增强膜表面负电荷密度，排斥高盐环境中的Na+，减少钠离子内流。部分极端嗜盐碱古菌(如Halalkalicoccus)通过合成醚脂(Ether lipids)和GDGTs替代传统酯脂，增强膜的热稳定性及抗离子渗透能力。一些微生物还可通过膜蛋白(如NhaC家族)主动排出胞内Na+，维持胞内低钠环境，嗜碱菌则通过增强膜上H+-ATPase的活性，维持胞内pH稳态。微生物会通过增加脂肪酸链长度和降低不饱和度，减少膜流动性，防止高盐环境下的过度渗透，盐胁迫诱导去饱和酶基因(如desA)表达下调，抑制不饱和脂肪酸合成[15]。
细胞壁也会发生改变以适应盐碱环境。增厚肽聚糖层可增强机械强度，抵抗细胞脱水；分泌胞外多糖吸附Na+和缓冲pH变化，减轻盐碱胁迫对细胞壁的损伤[16]。部分耐盐碱菌合成特殊多糖(如硫酸化多糖)嵌入肽聚糖层，增强抗逆性[17]。
2.3. 无机盐离子的调节
离子键在耐盐碱细菌维持细胞壁结构稳固方面起着关键作用。一定浓度的Na+是保障细胞壁完整性、维持细胞正常生理功能不可或缺的要素，但细胞内Na+浓度过高会产生负面效果，所以细胞必须建立Na+排出机制，维持细胞内环境稳定[18]。当细菌处于高盐环境，细胞水势下降，水分流失，无机离子涌入，菌体细胞积累无机盐离子，同时衍生出“盐排入”“盐排出”等适应性策略[19]。耐盐细菌能够借助能量依赖性机制，将细胞内高浓度的Na+释放到细胞外，营造细胞内低Na+浓度的环境。此外，K+在耐盐菌应对盐胁迫的过程中也发挥着极为关键的作用。
此外，抗氧化系统中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽(GSH)协同清除因为盐碱胁迫造成的活性氧(ROS)。
3. 材料与方法
3.1. 实验菌株分离鉴定
实验菌株采用稀释涂布平板法从球等鞭金藻藻液中筛出，共筛选出21种藻际细菌，预实验得到一株能明显耐受盐碱的细菌并经过三次平板划线分离出纯菌，命名为Microbacterium paraoxydans IGS-10 (IGS-10)。采用16S rRNA基因序列分析技术，经NCBI数据库BLAST工具完成同源性比对后，运用MEGA 6.0生物信息学软件基于邻接法(Neighbor-Joining)构建菌株系统发育树。采用甘油冷冻保护剂制备菌种保藏管，置于-80℃超低温生物储存箱中进行长期低温保藏。
3.2. 实验方式
3.2.1. 菌株的培养
从−80℃冰箱取出实验用菌IGS-10，用破冰器取出适量菌液接种在2216E固体培养基上，全部操作均于无菌操作台中、酒精灯火焰旁开展。完成接种的平板随即放入已设定温度为30℃的生化培养箱内，培养时长控制在2至3天。培养结束后，将平板转移至4℃的冰箱里储存，留作后续实验备用。
3.2.2. IGS-10在不同浓度盐碱下的生长量
从4℃的冰箱内取出适量菌体，接种至装有3~5 mL 2216E液体培养基的试管中。紧接着，把完成接种的试管置于恒温摇床，在温度30℃、转速120 rpm的条件下，培养12至18小时。待菌液的OD值达到1.0时，留存备用。以氢氧化钠与氯化钠为原料，配制50 mL体系、不同pH值和盐浓度的2216E液体培养基。往各培养基中加入0.1 mL OD值为1.0的上述菌液，随后将其放置在30℃、120 rpm的恒温摇床内培养。每间隔12小时，于无菌操作台中，从各培养基里分别取5 mL充分混匀的菌液，运用可见分光光度计，测定菌液在600 nm波长处的吸光度，以此表征细菌的生长态势。
3.2.3. 基因组测序组装分析
首先在2216E液体培养基中实施活化培养(30℃, 120 rpm, 24 h)，离心收集菌体后采用CTAB法提取高质量基因组DNA。使用超声破碎仪(Covaris)将DNA随机片段化至350~500 bp，经末端修复、加尾处理后衔接A/B适配体构建Illumina文库。通过磁珠筛选排除适配体自连产物，利用BluePippin系统(2% Agarose Cassette)精确筛选含异源适配体的目标片段。经0.1 M NaOH溶液变性处理获得单链模板，通过桥式PCR扩增建立测序簇。经Illumina NovaSeq与PacBio Sequel II平台实施双维测序，原始数据经FastQC质控后采用SPAdes v3.15进行denovo组装，获得完成图级基因组。基因组测序交由上海美吉生物科技有限公司完成。
3.2.4. 耐盐碱基因分析
把获取到的基因数据与NR数据库进行比对。这里的NR，即Non-Redundant Protein Database (非冗余蛋白数据库)，由NCBI (National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心)构建并持续维护。完成比对后，NR注释的结果会通过表格呈现，针对每个样本里的各个基因，详细展示注释信息，涵盖基因的功能描述以及具体的比对详情。
4. 结果
4.1. 菌株分离与鉴定
如图1所示，分离得到的菌株，表面湿润，有一定的光泽度，黄色透明，颜色较为鲜艳且均匀，透明度较高，透过光线可以较为清晰地看到菌落内部结构。
如图2所示，16S rRNA序列与Microbacterium paraoxydans相似度最高，系统发育树显示其归属于副氧化微杆菌属。
4.2. IGS-10在不同浓度盐碱下的生长量
如图3所示，菌株IGS-10在0%~4% NaCl浓度范围内未表现出显著生长抑制效应。具体表现为：在低盐度(0%~2%)条件下，菌体于24 h内迅速进入对数生长期并达到最大生物量(OD600 ≈ 2.0)，随后进入
稳定期；而当盐度提升至2%~4%时，菌株虽出现短暂的生长迟滞(延滞期延长至12~18 h)，但其仍能通过代谢适应性调整，在48 h内完成增殖过程(OD600 ≈ 1.75)。进一步实验表明，该菌株对NaCl的耐受阈值可达6%，而8% NaCl则显著抑制其生长(OD600 < 0.5)，表明其具备中高盐度环境适应能力。IGS-10在pH 7~10范围内均能保持稳定的生长活性，各处理组生长曲线斜率与生物量积累量(OD600终值 > 1.8)高度一致。值得注意的是，即使在强碱性条件(pH 11)下，菌株仍可维持缓慢但持续的生长趋势(48 h内OD600达0.8~1.2)，表明其胞内pH稳态系统具有高效调控能力。
综上，IGS-10在宽幅盐度(0%~6% NaCl)及碱性(pH 7~10)环境下的稳定生长特性，充分证明该菌株具备显著的盐碱双重胁迫耐受机制，为其在盐碱地生物修复或高盐废水处理中的应用提供了理论基础。
4.3. IGS-10基因组概述
借助Illumina测序平台，对菌株基因实施质控分析流程。经质控筛选出符合既定标准的Clean data，
Figure 1. Morphology of strain IGS-10
图1. 菌株IGS-10形貌
Figure 2. Evolutionary tree of experimental bacteria
图2. 实验用菌的进化树
Figure 3. Growth amount of IGS-10 under different concentrations of NaCl and different pH
图3. IGS-10在不同浓度NaCl及不同pH下的生长量
随后运用从头组装技术，基于这些高质量数据构建出基因组序列。在获取基因组序列后，对其展开全面的基因特征预测工作。具体涵盖了对编码基因、tRNA、rRNA、持家基因、sRNA以及串联/散在重复序列的预测分析，具体见表1。
Table 1. IGS-10 genome profile statistics
表1. IGS-10基因组概况统计
Sample Name |
Genome Size (bp) |
Chrom No. |
GC Content (%) |
CDS No. |
tRNA No. |
rRNA No. |
16S rRNA No. |
sRNA No. |
House-Keeping Gene No. |
IGS-10 |
3837508 |
1 |
70.35 |
3666 |
47 |
6 |
2 |
13 |
31 |
4.4. IGS-10耐盐碱基因
通过NR注释结果，我们分析得到以下和IGS-10耐盐碱相关的基因，主要包括离子转运系统、相容性溶质代谢(海藻糖合成、甜菜碱合成)等相关基因，具体见表2。
Table 2. IGS-10 saline-alkali tolerance genes
表2. IGS-10耐盐碱基因
基因缩写 Gene abbreviation |
菌株IGS-1010 |
基因编号 Gene ID |
起终位置 Starting and ending
position |
长度Length (bp) |
功能描述 Function description |
mnhA/mrpA |
gene0085 |
87979-90951 |
2973 |
Na+/H+反转运子亚基A |
mnhC/mrpC |
gene0086 |
90951-91538 |
588 |
Na(+)/H(+)反转运子亚基C |
mnhD/mrpD |
gene0087 |
91535-93088 |
1554 |
Na(+)/H(+)反转运子亚基D |
mnhE/mrpE |
gene0088 |
93085-93678 |
594 |
Na(+)/H(+)反转运子亚基E |
mnhF |
gene0089 |
93675-93944 |
270 |
单价阳离子/H+反转运复合物亚基F |
mnhG |
gene0090 |
93941-94330 |
390 |
单价阳离子/H(+)反转运子亚基G |
nhaA |
gene1196 |
1232201-1233376 |
1176 |
Na+/H+反向转运子NhaA |
gene1486 |
1542897-1541611 |
1287 |
Na+/H+反向转运子NhaA |
nhaK |
gene2517 |
2603975-2602209 |
1767 |
Na +/H +逆向转运 |
gene3111 |
3210316-3208586 |
1731 |
阳离子：质子转运体 |
chaA |
gene0045 |
53010-51862 |
1149 |
钙：质子转运体 |
kdpA |
gene0362 |
390398-388719 |
1680 |
钾转运ATP酶亚基KdpA |
kdpB |
gene0361 |
388717-386582 |
2136 |
钾转运ATP酶亚基KdpB |
kdpC |
gene0360 |
386558-385953 |
606 |
钾转运ATP酶亚基KdpC |
kdpD |
gene0359 |
385956-383404 |
2553 |
DUF4118结构域蛋白 |
kdpE |
gene0358 |
383407-382736 |
672 |
响应监管机构 |
betB |
gene0495 |
537631-539010 |
1380 |
含FHA结构域的蛋白 |
gene2804 |
2909984-2908413 |
1572 |
APC家族渗透酶 |
glyA |
gene1076 |
1096851-1098125 |
1275 |
丝氨酸羟甲基转移酶 |
betI |
gene0533 |
585220-584591 |
630 |
TetR/AcrR家族转录调控因子 |
gene1152 |
1184103-1183501 |
603 |
TetR/AcrR家族转录调控因子 |
gene1124 |
1154900-1154289 |
612 |
TetR/AcrR家族转录调控因子 |
gene1166 |
1198446-1199033 |
588 |
TetR/AcrR家族转录调控因子 |
opuA |
gene0122 |
127632-128492 |
861 |
ATP结合盒结构域蛋白 |
opuBD |
gene0124 |
129178-129903 |
726 |
ABC转运蛋白渗透酶亚基 |
gene0123 |
128489-129181 |
693 |
ABC转运蛋白渗透酶亚基 |
opuC |
gene0125 |
129949-130866 |
918 |
ABC转运蛋白底物结合蛋白 |
opuD |
gene0271 |
287893-289857 |
1965 |
BCCT家族转运体 |
otsA |
gene1622 |
1682746-1684206 |
1461 |
海藻糖-6-磷酸合成酶 |
otsB |
gene1623 |
1684268-1685068 |
801 |
海藻糖磷酸酶 |
treY |
gene3690 |
3799109-3801457 |
2349 |
麦芽糖低聚海藻糖合成酶 |
treZ |
gene3691 |
3801471-3803225 |
1755 |
麦芽糖低聚海藻糖海藻水解酶 |
离子转运系统主要包括Mrp、Nha、Cha、Kdp转运蛋白的基因：mnh基因编码的膜转运蛋白属于阳离子/质子反转运蛋白家族，这些反转运蛋白由七个疏水性膜结合蛋白亚基组成，对细菌在高盐环境中生存和生物被膜形成等生理功能有重要作用。这种蛋白通过调节细胞内的Na+和H+稳态，帮助细菌维持细胞内外的离子平衡，从而适应高盐、高碱等极端环境。nhaA基因表达产物NhaA蛋白系典型的pH依赖性Na+/H+逆向转运膜蛋白，其通过电化学梯度驱动的跨膜逆向转运机制，催化胞内Na+外排与H+内流的耦合交换反应。该转运体在细胞碱胁迫应答及离子平衡调节中发挥关键作用，其构象转换过程严格受跨膜质子动力势调控。nhaK基因编码NhaK蛋白能够利用ATP水解产生的能量逆浓度梯度运输钠离子，从而维持细胞内低钠离子浓度。细菌的kdpA、kdpB和kdpC基因编码的蛋白质共同构成了KdpFABC膜复合物，该复合物在细菌的钾离子运输和稳态维持中发挥着关键作用。
Figure 4. Prediction and classification of IGS-10 transporters
图4. IGS-10转运蛋白预测分类
Figure 5. Betaine synthesis
图5. 甜菜碱合成
转运蛋白(transport proteins)是膜蛋白的一大类，介导生物膜内外的化学物质以及信号交换。如图4所示，IGS-10中和主要主动转运蛋白相关的基因有351个，和电化学电位驱动的转运体相关的基因有150个，运输系统相关的基因有52个。这些蛋白能够识别并转运特定的离子(如Na+、K+等)，以维持细胞膜两侧的电位差、pH值和细胞内外的离子平衡，从而保护细胞免受损害，确保细胞的正常生理功能。
IGS-10在相容性物质合成相关的基因主要包括甜菜碱和海藻糖。嗜盐菌中甘氨酸甜菜碱的生物合成存在两条代谢通路：胆碱代谢途径与甘氨酸连续甲基化途径[20]。(A)胆碱转化通路以胆碱为起始物质，通过胆碱脱氢酶(BetA)与甜菜碱乙醛脱氢酶(BetB)的连续催化，经两次氧化反应将胆碱转化为甜菜碱；(B)甘氨酸甲基化通路则通过甘氨酸肌醇甲基转移酶(GSMT)与肌氨酸二甲基甘氨酸甲基转移酶(SDMT)的三步N-甲基化作用，逐步修饰甘氨酸生成甜菜碱。值得注意的是，IGS-10菌株中betA、betB基因分别调控胆碱脱氢酶与甜菜碱乙醛脱氢酶的表达，而glyA和betI基因则分别对应甘氨酸肌醇甲基转移酶、肌氨酸二甲基甘氨酸甲基转移酶的编码基因。α/β水解酶(Alpha/Beta Hydrolase，简称ABH)是一个包含多种酶的超家族。具体合成途径见图5。
opuD基因负责编码一种甘氨酸甜菜碱转运蛋白，该蛋白在结构上与大肠杆菌BetT胆碱转运体及CaiT肉碱载体存在显著序列保守性。其核心作用在于协助微生物从外部环境中吸收甘氨酸甜菜碱，这类渗透调节物质通过稳定细胞膜结构显著增强微生物在高渗透压等极端环境中的抗逆能力。opuA基因则表达ATP结合盒(ABC)转运超家族成员，该转运系统依赖底物结合蛋白完成渗透调节物质的跨膜运输过程。
opuBD基因产物属于外膜蛋白中的OpuB亚类，这类跨膜蛋白不仅参与维持细胞膜稳态，还在微生物应对环境胁迫及耐药机制中扮演重要调控角色。opuC基因编码的相容性溶质转运复合体由三个关键亚基构成：具有底物识别功能的OpuCC结合蛋白，以及形成跨膜通道的OpuCB/OpuCD异源二聚体。该ABC型转运系统通过ATP水解供能，能够在渗透压剧烈波动时选择性摄取多种相容性溶质分子，从而维持细胞内外的渗透平衡。
海藻糖属于非还原性二糖，由两个葡萄糖分子经由α，α-1，1-糖苷键相互连接构成。作为细胞相容性溶质的类别之一，在盐胁迫环境下，海藻糖能够对细菌体内的蛋白质、酶以及细胞膜等生物大分子起到保护作用，使其结构与功能得以稳定维持。就IGS-10细菌而言，其编码产生海藻糖的相关基因涵盖otsA、otsB以及treY-treZ等。其中，otsA是编码海藻糖合成关键酶的重要基因之一，它与otsB共同构成一个操纵子，在海藻糖的合成进程中承担关键作用。treY基因编码麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)，treZ基因编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)，这两种酶在海藻糖的生物合成路径中均有参与。具体来说，TreY蛋白负责催化麦芽寡糖与海藻糖之间的连接反应，从而生成麦芽寡糖基海藻糖；而TreZ蛋白则对该中间产物进一步催化水解，最终促使海藻糖生成。
Figure 6. IGS-10 saline-alkali resistance mechanism
图6. IGS-10耐盐碱机理
4.5. IGS-10耐盐碱机制分析
IGS-10面对碱性环境时，其通过三重策略协同调控胞内pH：首先激活H+主动转运系统或强化胞内H+滞留能力，直接中和碱性环境对质子梯度的破坏；其次启动有机酸合成通路(如乳酸、乙酸、丙酸)，通过酸性代谢产物的分泌与胞内碱性物质发生中和反应；同时将部分碱性物质经生物转化修饰为中性化合物(如脱氨反应)，降低其化学活性。此外，通过动态调整细胞膜脂质组成与膜蛋白分布，增强膜结构致密性，形成针对碱性离子的选择性屏障，有效减少外源碱性物质渗透对DNA、酶系统等生物大分子的损伤。
IGS-10在高盐胁迫应对方面，细菌通过合成相容性溶质建立渗透保护体系：1) 氨基酸类(谷氨酸、脯氨酸)通过可逆性浓度调节参与渗透压平衡，兼具代谢中间体功能；2) 糖类衍生物(海藻糖、蔗糖)凭借羟基网络形成结构化水合层，协同调节渗透压与能量储备；3) 甜菜碱类利用两性离子特性在不干扰酶活性的前提下调节离子平衡。这些溶质通过浓度梯度驱动实现胞内外渗透压动态平衡，同时通过分子伴侣功能稳定蛋白质三级结构，保障关键酶活性及代谢通路运行。
IGS-10主要通过四种转运蛋白和产生相容性物质以及一些有机酸来面对盐碱的胁迫，具体机制见图6。
5. 结论
本研究成功从球等鞭金藻藻际环境中筛选并鉴定出一株耐盐碱菌Microbacterium paraoxydans IGS-10，通过生理学、基因组学及功能基因分析揭示了其适应盐碱胁迫的分子机制。IGS-10在NaCl浓度0%~6%和pH 7-10条件下均能高效增殖，其耐受阈值显著高于多数非嗜盐微生物，表明其具备应对高盐碱环境的独特生理策略。全基因组分析显示，IGS-10携带多个耐盐碱相关基因簇：1) mnh、nhaA、chaA及kdp基因家族编码的离子转运蛋白通过调控Na+/H+交换、K+吸收及ATP依赖的离子外排系统维持胞内离子动态平衡；2) otsA/B和treY/Z基因驱动的海藻糖合成途径与betA、betB、glyA、betI、opu家族基因介导的甜菜碱合成摄取系统协同作用，积累相容性溶质以缓冲渗透压。在高盐环境中，IGS-10通过“盐排出”策略与“溶质积累”策略(如海藻糖和甜菜碱的合成)共同作用，有效平衡细胞内外渗透压；在碱性条件下，相容性溶质的缓冲效应维持胞内pH稳态。本研究首次从藻际环境分离获得具有双耐性(耐盐、耐碱)的副氧化微杆菌，其基因组中鉴定的功能基因为解析微生物极端环境适应机制提供了新靶点，在环境修复(盐碱地改良)领域具有重要应用潜力。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。