1. 引言
脓毒症是机体对感染引起的炎症反应失衡的危重疾病之一，具有高发病率和病死率的特点[1]，胃肠道目前已成为脓毒症MODS最易受损的器官之一，胃肠功能障碍在脓毒症患者中发病率高且影响多个器官功能[2]。中药通过改善胃肠功能，提高免疫力，可以预防脓毒症的进展，改善脓毒症患者的预后[3]。临床上已有脓毒症胃肠功能障碍选用半夏泻心汤进行临床治疗[4]，但相关作用机制的研究极少，此研究拟挖掘关键活性成分及核心靶点分子对接探究半夏泻心汤治疗脓毒症胃肠功能障碍的作用机制，以期为相关实验和临床应用提供科学参考。
2. 材料与方法
2.1. 筛选半夏泻心汤活性成分及预测作用靶点
半夏泻心汤的活性成分通过中医系统药理数据库与分析平台TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)数据库以口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%、类药性(drug likeness, DL) ≥ 0.18且半衰期(Half-life, HL) ≥ 4为条件进行筛选，相应SMILE name通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索获得，相应药物作用靶点通过Swiss Target Prediction数据库(http://swisstargetprediction.ch/)检索获得，将所得靶点合并去重，得到半夏泻心汤的作用靶点。
2.2. 筛选脓毒症胃肠功能障碍疾病靶点基因
使用人类基因GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，以“sepsis”及“Gastrointestinal dysfunction”为关键词分别进行检索，查询疾病相关靶点基因，利用Venny网站
(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)将两者相关疾病靶点基因取交集，获取本次研究脓毒症胃肠功能障碍疾病靶点基因。
2.3. 筛选半夏泻心汤治疗脓毒症胃肠功能障碍潜在治疗靶点
使用Venny网站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)将半夏泻心汤的作用靶点及脓毒症胃肠功能障碍靶点基因依次录入，取交集获得半夏泻心汤治疗脓毒症胃肠功能障碍的潜在治疗靶点。
2.4. 筛选核心靶点
在STRING 12.0数据库(https://cn.string-db.org/)中导入470个潜在治疗靶点，限定研究物种为“Homo sapiens”，置信度 > 0.4，剩余参数均选择默认值，构建药物与疾病蛋白互作网络(protein-protein intera-ction, PPI)网络，利用Cytoscape 3.10.2软件Network Analyzer插件进行拓扑分析，根据每个基因的度值(Degree)参数得到核心靶点。
2.5. 筛选关键活性成分
将半夏泻心汤的药物组成、活性成分和未去重的作用靶点、潜在治疗靶点及疾病信息导入Excel表格并制作“中药–活性成分–潜在治疗靶点–疾病”关系表和节点属性表，将上述两表分别导入Cytoscape 3.10.2软件中，使用Network Analyzer插件功能进行拓扑分析，获得“中药–活性成分–潜在治疗靶点–疾病”网络，根据网络节点等级值(Degree)、中心度值(Betweenness Centrality, BC)和亲中心度值(Closeness Centrality, CC)筛选出半夏泻心汤治疗脓毒症胃肠功能障碍中半夏、黄连、黄芩、甘草、干姜、人参、大枣7味药各自排名靠前的成分为关键活性成分。
2.6. 潜在治疗靶点富集分析
在DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)中导入470个潜在治疗靶点，物种选择“Homo Sapiens”，Select Identifier选择“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，执行基因本体(gene ontology, GO)富集分析以及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析。
2.7. Lipid and Atherosclerosis信号通路图绘制
将潜在治疗靶点输入至UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)，设置检索条件，From database为“Gene Name”，To database为“UniProtKB”，Restrict by orga-nism为“Homo sapiens [9606]”进行检索并剔除重复值，通过KEGG网站(https://www.genome.jp/kegg/)进行检索，获得Lipid and atherosclerosis信号通路图。
2.8. 分子对接
在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取关键活性成分2D结构的SDF格式，在MOE (2022.2)软件进行能量极化处理导入小分子库备用；在PDB数据库(https://www.rcsb.org/)获取核心靶点的3D结构，在MOE软件剔除水分子及氢化处理。通过MOE软件将上述处理后的核心靶点蛋白及小分子库进行对接，获得分子对接结合能，通过PyMol软件对部分分子对接进行可视化分析。
3. 结果
3.1. 半夏泻心汤活性成分与作用靶点
根据检索条件，通过TCMSP数据库获得半夏泻心汤活性成分177个，其中半夏、黄连、黄芩、干姜、甘草、人参、大枣分别为11个、10个、32个、4个、77个、20个、23个，依次导入Swiss Target Prediction数据库检索，去重得到作用靶点1186个。
3.2. 脓毒症胃肠功能障碍疾病靶点基因
在GeneCards数据库，以“sepsis”和“Gastrointestinal dysfunction”分别为关键词查询相关靶点基因，结果显示脓毒症9232个、胃肠功能障碍3698个，利用Venny网站制作韦恩图(见图1)，得到两者的交集靶点即本次研究脓毒症胃肠功能障碍疾病靶点基因2918个。
Figure 1. Venn diagram of the target gene for sepsis gastrointestinal dysfunction
图1. 脓毒症胃肠功能障碍疾病靶点基因韦恩图
3.3. 半夏泻心汤治疗脓毒症胃肠功能障碍潜在治疗靶点
将筛选过后的半夏泻心汤作用靶点1186个及脓毒症胃肠功能障碍疾病靶点基因2918个通过Venny网站制作韦恩图(见图2)，得到两者的共同靶点即潜在治疗靶点470个。
3.4. 核心靶点
对PPI网络进行拓扑分析(见图3)，并根据Degree值进行排序，排名前9绘制柱状图(见图4)，结果显示蛋白激酶(AKT1)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素6 (IL6)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为核心靶点。
Figure 2. Wayne diagram of potential therapeutic targets
图2. 潜在治疗靶点韦恩图
Figure 3. PPI network diagram
图3. PPI网络图
Figure 4. Bar chart of the Degree value of the core target
图4. 核心靶点Degree值条形图
3.5. 关键活性成分
“中药–活性成分–潜在治疗靶点–疾病”关系表和节点属性表导入至Cytoscape 3.10.2软件，使用Network Analyzer插件功能对其进行拓扑分析，构建“中药–活性成分–潜在治疗靶点–疾病”网络(见图5)。拓扑分析中Degree、BC和CC反映网络中节点核心度的高低。综合Degree、BC与CC值排序筛选出关键活性成分为7-Methoxy-2-methyl isoflavone、1-Monolinolein、Palmidin A、conif-erin、Gomisin B、beta-sitosterol、sitosterol (见表1)。
Table 1. Analysis of key active ingredient parameters of Banxia Xingxin Decoction
表1. 半夏泻心汤关键活性成分参数分析
Molecule name |
Chinese name |
Betweenness Centrality |
Closeness Centrality |
Degree |
7-Methoxy-2-methyl isoflavone |
7-甲氧基-2-甲基异黄酮 |
0.010706 |
0.399745 |
81 |
1-Monolinolein |
1-单亚油酸甘油酯 |
0.005546 |
0.388854 |
61 |
Palmidin A |
掌叶大黄二蒽酮A |
0.004268 |
0.387415 |
57 |
coniferin |
松柏苷 |
0.00462 |
0.386938 |
57 |
Gomisin B |
戈米辛B |
0.003692 |
0.386462 |
56 |
beta-sitosterol |
β-谷甾醇 |
0.001695 |
0.386462 |
56 |
sitosterol |
谷甾醇 |
0.001705 |
0.384098 |
53 |
Figure 5. Network diagram of “TCM-active ingredients-potential therapeutic targets-diseases”
图5. “中药–活性成分–潜在治疗靶点–疾病”网络图
3.6. 潜在治疗靶点富集分析
GO富集分析共得到生物过程1358个(P < 0.01)、细胞组成149个(P < 0.01)和分子功能292个(P < 0.01) (见图6)；KEGG富集分析共得到190条通路(P < 0.01) (见图7)。其中生物过程包括蛋白质磷酸化、炎症应答、凋亡过程的负调节、MAPK级联反应的正调节等；细胞组成包括细胞质膜、细胞质、膜筏、细胞质的核周区域等；分子功能有结合酶、ABC转运蛋白、相同的蛋白质结合等。KEGG通路主要有癌症通路(Pathways in cancer) (相关基因数107)、脂质与动脉粥样硬化通路(Lipid and atherosclerosis) (相关基因数68)等。
Figure 6. GO enrichment analysis bar chart
图6. GO富集分析条形图
Figure 7. Bubble diagram of KEGG pathway enrichment depth analysis
图7. KEGG通路富集深度分析气泡图
3.7. Lipid and Atherosclerosis信号通路图
通过UniProt数据库及KEGG网站，绘制Lipid and atherosclerosis信号通路图(见图8)，图中红色靶点为潜在治疗靶点，其中蛋白激酶(AKT)、一氧化氮合酶3 (NOS3)、白细胞介素-6 (IL-6)、核因子κB (NF-Κb)、肿瘤坏死因子(TNF)等靶点与Lipid and atherosclerosis信号通路密切相关。
Figure 8. Lipid and atherosclerosis signaling pathway
图8. Lipid and atherosclerosis信号通路图
3.8. 分子对接
将处理后的核心靶点与小分子库在MOE软件进行分子对接(见表2)，结合能与结合效果成反比，结果表明结合能均<−4 kcal/mol，提示核心靶点与关键活性成分结合效果较好，结合能越小结合效果越好，通过PyMol软件对AKT1靶点与关键活性成分的分子对接结果进行处理，绘制构象图(见图9)。
Table 2. Molecular docking part binding energy (kCal·mol−1)
表2. 分子对接部分结合能(kCal·mol−1)
Molecule name |
AKT1 |
TNF |
IL6 |
GAPDH |
7-Methoxy-2-methyl isoflavone |
−6.98 |
−5.01 |
−5.55 |
−6.48 |
1-Monolinolein |
−6.65 |
−5.89 |
−6.15 |
−6.73 |
Palmidin A |
−6.50 |
−5.96 |
−5.85 |
−6.83 |
coniferin |
−6.74 |
−5.36 |
−5.66 |
−6.17 |
Gomisin B |
−5.65 |
−5.33 |
−5.93 |
−7.66 |
beta-sitosterol |
−5.54 |
−5.40 |
−5.56 |
−6.99 |
sitosterol |
−6.05 |
−5.04 |
−5.52 |
−6.67 |
注：A为AKT1与7-Methoxy-2-methyl isoflavone，B为AKT1与1-Monolinolein，C为AKT1与Palmidin A，D为AKT1与coniferin，E为AKT1与Gomisin B，F为AKT1与beta-sitosterol，G为AKT1与sitosterol。
Figure 9. Conformational diagram of the docking of AKT1 with the key active ingredient molecule
图9. AKT1与关键活性成分分子对接构象图
4. 讨论
脓毒症胃肠功能障碍患者机体各种炎症因子和毒素会影响胃肠道微循环障碍、肠道黏膜屏障缺损等，加重患者病情，同时肠道黏膜受损时，肠道释放大量促炎因子，加重组织器官受损[5]，因此积极有效地改善患者胃肠道功能是治疗脓毒症的关键所在，对于防治脓毒症患者多器官功能障碍有重要意义。
目前，中焦气机紊乱，气血阴阳失调被中医学者认为是脓毒症胃肠功能障碍的主要病机，表现为胃肠运化传导失司、气血津液化生失常[6]。半夏泻心汤辛开苦降、平调寒热的特性可以恢复气机运动和气血生化，纠正中焦气机逆乱的疾病状态，是调理气机逆乱的经典用方[7]。
通过构建“中药–活性成分–潜在治疗靶点–疾病”发现7-Methoxy-2-methyl isoflavone、1-Monolinolein、Palmidin A、coniferin、Gomisin B、beta-sitosterol、sitosterol等可能成为半夏泻心汤发挥作用的重要成分。其中，大量研究表明，β-谷甾醇对人类和动物具有积极的抗炎和免疫调节等作用[8]。同时β-谷甾醇显示出对消化系统疾病的保护作用[9]，缓解过敏症状和肠道炎症，降低致敏小鼠血清特异性免疫球蛋白IgG和组胺水平，改善肠道屏障功能和重塑肠道微生物群[10]。
通过Cytoscape3.10.2软件构建PPI网络，结果表明AKT1、TNF、IL6、GAPDH可能是半夏泻心汤治疗脓毒症胃肠功能障碍的关键靶点基因。AKT1是丝氨酸和苏氨酸激酶(AKT) 3种不同亚型其中之一的多功能激酶，AKT通路被激活后可以抑制功能细胞的凋亡，降低炎症和氧化应激的水平，具有调控胃肠动力及改善脓毒症引发的多器官功能损伤的能力[11]。TNF主要来源于单核巨噬细胞，通过激活中性粒细胞等对侵入性及炎症性刺激做出免疫应答和炎症反应，是炎症的最初启动者及免疫的核心调节因子，TNF-α激活机体的免疫和炎症反应从而参与脓毒症的发病机制[12]，研究发现，降低患者TNF-α等炎症指标，可以缓解肠道黏膜炎症，促进胃肠功能恢复[13]。IL6在宿主防御感染和组织损伤中发挥着至关重要的作用，同时具有促炎与抗炎作用，被称为是一种处在自身免疫炎症十字路口的细胞因子，IL6被证实是预测脓毒症最敏感的标志物[14]，是脓毒症患者住院死亡的独立危险因素，同时也是脓毒症急性期炎症反应的一个重要介质。IL6等炎症因子的异常活动，会引起胃肠道内环境紊乱，影响肠道菌群的结构及分布，是肠屏障功能障碍的常见炎症指标[15]。GAPDH功能多样性，在机体的表达与B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等数量相关，通过参与过氧化氢酶的成熟，调节TNF-α核酶活性及TNF合成，在机体炎症调节中发挥作用，介导的促炎级联反应可发生在严重损伤和脓毒症之后，成为阻断炎症的一个潜在的药物靶点[16]。GAPDH与各种肠道上皮成分具有多种相互作用，可以修复受损的紧密连接，对肠道屏障功能完整性产生影响[17]。
KEGG富集分析显示半夏泻心汤治疗脓毒症胃肠功能障碍的潜在治疗靶点以癌症通路、脂质与动脉粥样硬化通路相关性最丰富，与炎症反应、免疫调节、细胞凋亡等有关。其中癌症通路可以通过内在或外在因素来提高NF-κB活性，NF-κB是炎症、应激反应及细胞死亡的核心因素[18]。脂质和动脉粥样硬化通路中血浆脂质和脂蛋白在脓毒症期间代谢发生显著变化，脂蛋白具有重要的免疫功能，包括清除炎症介质、去除细菌病原体相关的分子模式等，影响脓毒症的自然病程和长期后遗症[19]。同时脂质和动脉粥样硬化与肠道菌群、内皮功能相互影响[20]。
综上，通过网络药理学及分子对接结果发现半夏泻心汤治疗脓毒症胃肠功能障碍关键活性成分可能为7-M-ethoxy-2-methyl isoflavone、1-Monolinolein、Palmidin A、coniferin、Gomisin B、beta-sitosterol、sitosterol，通过AKT1、TNF、IL 6、GAPDH等靶点作用于Pathways in cancer、Lipid and atherosclerosis等途径进行调控，本次研究结果在中药治疗脓毒症胃肠功能障碍方向具有一定理论价值，以期后续实验验证。
NOTES
*通讯作者。