摘要: 为筛选高辣高红色素的优异辣椒种质，本研究以35份辣椒种质资源作为实验材料，运用高效液相色谱(HPLC)技术，开展辣椒素类物质及辣椒红素含量的精准评价。检测方法呈现出良好线性关系，确保分析结果准确可靠。35份辣椒种质辣椒素类物质含量方面，热辣6号含量最高，为33.24万SHU，小黄椒、A56和A61的辣椒素类物质含量在10~20万SHU，30份种质的辣椒素类物质含量均 < 10万SHU；在干物质辣椒红素含量方面，35份辣椒种质中含量 > 200 mg/kg的有6份，分别为遵辣1号、四平头、门巴辣椒、A59、遵义4号和A47，辣椒红素含量100~200 mg/kg的辣椒种质有8份，其他21份辣椒种质资源辣椒红素含量均 < 100 mg/kg；辣椒素类物质与辣椒红素含量之间的相关性不显著。研究揭示了不同辣椒种质在辣椒素类物质和辣椒红素含量上的显著差异，为辣椒育种提供了丰富的遗传资源，对选育高辣高红色素含量的品种奠定基础。
Abstract: In order to screen out excellent pepper germplasms with high capsaicinoids and high capsanthin content, 35 pepper germplasm resources as experimental materials were evaluated, and the contents of capsaicinoids and capsanthin were detected by high-performance liquid chromatography (HPLC) technology in the study. The detection method showed a good linear relationship, ensuring the accurate and reliable analytical results. Among the 35 pepper germplasms, Rela 6 had the highest capsaicinoids content, reaching 332,400 SHU. The capsaicinoids contents of Xiaohuangjiao, A56 and A61 ranged from 100,000 to 200,000 SHU, while the capsaicinoids content of 30 germplasms were all less than 100,000 SHU. In terms of the capsanthin content in dry matter, six of the 35 germplasms had capsanthin content exceeding 200 mg/kg, namely Zunla 1, Sipingtou, Menba Pepper, A59, Zunyi 4, and A47. Eight germplasms had capsanthin content ranging from 100 to 200 mg/kg, while the remaining 21 germplasms had capsanthin content less than 100 mg/kg. The correlation between capsaicinoids and capsanthin content was not significant. The study revealed significant differences in the contents of capsaicinoids and capsanthin among different pepper germplasms, providing rich genetic resources for pepper breeding and laying the foundation for the development of varieties with high capsaicinoids and high capsanthin content.
1. 引言
辣椒是我国种植面积最大的蔬菜，近十年来每年种植面积在210万hm2左右[1] [2]，已成为人们日常餐桌上不可或缺的调味品。辣椒的辣味源于其富含辣椒素类物质，主要包括辣椒素和二氢辣椒素，二者的比例约占辣椒素总含量90% [3]-[5]，辣椒素类物质具有显著的生物活性，在食品、军事、医药、化工合成等行业被广泛应用[6]-[9]。辣椒果实因含类胡萝卜素而颜色多样，辣椒红素是红色辣椒果实中类胡萝卜素的主要成分，其含量占成熟期红色辣椒果实色素含量的60%以上[10]-[12]。辣椒红素作为一种提取的天然色素，具有安全、颜色鲜亮、保色期长等特性，用于食品、医药和化妆品的添加剂，发展前景广阔[13] [14]。
辣椒品种众多，但适用于深加工的品种还比较匮乏，尤其缺少高辣高红素的专用型品种，随着辣椒深加工行业的发展和消费者对天然、健康和功能性食品需求的增加，辣椒素类物质和辣椒红素的市场需求必定持续增长。由于辣椒素类物质和辣椒红素的含量在不同辣椒品种间存在显著差异，且受遗传背景、环境条件和栽培技术等多种因素的影响[15]。因此，精准评价不同辣椒种质资源中辣椒素类物质和辣椒红素的含量与组成，对于辣椒种质资源的有效利用和品种改良具有重要意义。
本研究旨在通过对35份辣椒种质资源中辣椒素类物质和辣椒红素的含量进行精准评价，揭示不同种质资源间的含量差异，筛选出高辣椒素和高辣椒红素的优异种质，培育高产、高辣椒素和高辣椒红素的辣椒专用型品种，为工业提取辣椒素和辣椒红素提供原材料。
2. 实验材料与方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 辣椒种质资源材料
实验中的35份辣椒种质资源(表1)均由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所冬季瓜菜研究中心辣椒课题组收集和保存。
Table 1. Pepper germplasm resources
表1. 辣椒种质资源
序号 |
种质名称 |
种质类型 |
来源地 |
序号 |
种质名称 |
种质类型 |
来源地 |
1 |
D4 |
一年生辣椒 |
云南 |
19 |
A36 |
一年生辣椒 |
海南 |
2 |
门巴辣椒 |
一年生辣椒 |
西藏 |
20 |
A38 |
一年生辣椒 |
海南 |
3 |
樟树港 |
一年生辣椒 |
湖南 |
21 |
A39 |
一年生辣椒 |
海南 |
4 |
二荆条 |
一年生辣椒 |
四川 |
22 |
A40 |
一年生辣椒 |
海南 |
5 |
丘北辣椒 |
一年生辣椒 |
云南 |
23 |
A43 |
一年生辣椒 |
海南 |
6 |
北京红 |
一年生辣椒 |
新疆 |
24 |
A46 |
一年生辣椒 |
海南 |
7 |
铁皮椒 |
一年生辣椒 |
新疆 |
25 |
A47 |
一年生辣椒 |
海南 |
8 |
益都红 |
一年生辣椒 |
山东 |
26 |
A48 |
一年生辣椒 |
海南 |
9 |
大红袍 |
一年生辣椒 |
四川 |
27 |
A51 |
一年生辣椒 |
海南 |
10 |
四平头 |
一年生辣椒 |
新疆 |
28 |
A53 |
一年生辣椒 |
海南 |
11 |
望都辣椒 |
一年生辣椒 |
河北 |
29 |
A54 |
一年生辣椒 |
海南 |
12 |
CM334 |
一年生辣椒 |
广东 |
30 |
A56 |
一年生辣椒 |
海南 |
13 |
遵义4号 |
一年生辣椒 |
贵州 |
31 |
A57 |
一年生辣椒 |
海南 |
14 |
遵辣1号 |
一年生辣椒 |
贵州 |
32 |
A59 |
中国辣椒 |
海南 |
15 |
小黄椒 |
一年生辣椒 |
山西 |
33 |
A61 |
中国辣椒 |
海南 |
16 |
红龙12 |
一年生辣椒 |
新疆 |
34 |
热辣6号 |
中国辣椒 |
海南 |
17 |
CF19 |
一年生辣椒 |
海南 |
35 |
热辣9号 |
中国辣椒 |
海南 |
18 |
A34 |
一年生辣椒 |
海南 |
|
|
|
|
2.1.2. 辣椒果实
实验辣椒材料种植于海南省儋州市宝岛新村试验场五队，取成熟的辣椒果实，带回实验室，去除果柄。用于测定辣椒红素的样品，去除辣椒种子后，果实快速切碎部分速冻于液氮中，另一部分置于50℃的烘箱中烘干至恒重，测含水量，每个重复9个果实，三次重复；用于测定辣椒素和二氢辣椒素的样品，置于50℃的烘箱中烘干至恒重，用低温电动打粉机粉碎，粉末置于自封袋中待用。
2.1.3. 标准品及实验耗材
标准品辣椒红素(纯度 ≥ 90.0%)购于sigma公司，辣椒素(纯度 ≥ 98%)、二氢辣椒素(纯度 ≥ 98%)购于上海源叶生物科技有限公司。甲醇、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、叔丁基甲醚为Fisher scientific色谱纯。Agilent1260高效液相色谱仪，辣椒红素色谱柱：YMC Carotenoid C30 (4.6 mm × 250 mm，粒径3 μm)，辣椒素和二氢辣椒素色谱柱：Cosmosil C18 (4.6 mm × 250 mm，粒径5 μm)。
2.2. 实验方法
2.2.1. 标准溶液的配制与标准曲线的制作
辣椒素和二氢辣椒素标准溶液的配制：用万分之一天平分别称取辣椒素和二氢辣椒素标准品0.0510 g、0.0510 g于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解，分别配制成辣椒素和二氢辣椒素含量均为5000 mg/L的标准储备液，再取5 mL辣椒素、2.5 mL二氢辣椒素于10 mL棕色容量瓶中，甲醇定容，配制成辣椒素浓度2500 mg/L、二氢辣椒素浓度1250 mg/L的混合标准母液，使用甲醇将混合标准溶液依次稀释，配制成不同浓度的混合标准溶液，经0.22 μm有机滤膜过滤至2 mL棕色样品瓶中，将不同浓度的混合标准液进样分析，以峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标制作标准曲线。
辣椒红素标准溶液的配制：用二氯甲烷和正己烷(8:2)溶解后，再用乙酸乙酯稀释4倍配制成母液，使用乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷(6:4:1)依次配制成不同浓度的标准溶液，经0.22 μm有机滤膜过滤至2 mL棕色样品瓶中，将不同浓度的标准液进样分析，以峰面积为纵坐标，标准液浓度为横坐标制作标准曲线。
2.2.2. 辣椒素类物质测定
根据厉志伟[3]方法测定辣椒果实中辣椒素和二氢辣椒素的含量，使用万分之一天平称取2.5 g粉末于50 mL离心管中，加入30 mL甲醇，摇匀后放入超声波仪中超声30 min，期间摇匀2~3次，4000 rpm/min离心5分钟，将上清转移到新的50 mL离心管中，沉淀重新加20 mL甲醇，摇匀后超声20 min，期间摇匀2次，4000 rpm/min离心5分钟，将两次上清液合并，甲醇定容至50 mL，0.22 μm有机滤膜过滤至2 mL棕色样品瓶中，待测。HPLC的测定条件为：波长280 nm，柱温35℃，流动相甲醇：水(70:30)，流速1 mL/min，进样量10 μL，运行时间20 min。
2.2.3. 辣椒红素的测定
根据王琴飞等[16]方法测定辣椒果实辣椒红素的含量，辣椒果实液氮研磨后称取0.2 g左右于2 mL离心管中，加入400 μL预冷的超纯水混匀后，再加入100 μL饱和氯化钠溶液和50 μL正己烷，涡旋仪上震动混匀1 min，4℃ 4000 rpm/min离心2 min，加入200 μL二氯甲烷，涡旋仪上震动混匀1 min，4℃ 4000 rpm/min离心2 min，加入800 μL乙酸乙酯，涡旋仪上震动混匀1 min，4℃ 4000 rpm/min离心5 min，取上清液用0.22 μm有机滤膜过滤至2 mL棕色样品瓶中，待测。HPLC的测定条件为：流动相甲醇：叔丁基甲醚为(80:20)，流速1.0 mL/min，检测波长450 nm，进样量20 μL，柱温30℃。
2.3. 数据分析
数据处理和分析采用excel软件，辣椒素类物质和辣椒红素含量之间的相关性分析采用SPSS软件中的Pearson方法。
3. 结果与分析
3.1. 检测方法的线性关系
辣椒素和二氢辣椒素的标准曲线(图1、图2)，线性关系较好，相关系数R2均达到0.9999。辣椒素和二氢辣椒素的色谱图(图3)基线平稳，峰形对称性好，能够确保分析结果的准确性。
辣椒红素的标准曲线(图4)，线性关系良好，相关系数R2达到了0.9995，可以进行样品的分析。
Figure 1. The standard curve of capsaicin
图1. 辣椒素的标准曲线
Figure 2. The standard curve of dihydrocapsaicin
图2. 二氢辣椒素的标准曲线
Figure 3. Chromatograms of capsaicin and dihydrocapsaicin standards
图3. 辣椒素和二氢辣椒素标准品的色谱图
Figure 4. The standard curve of capsanthin
图4. 辣椒红素的标准曲线
3.2. 辣椒种质资源辣椒素类物质的含量分析
35份辣椒种质资源辣椒素类物质HPLC分析发现(图5)，辣椒素类物质最高的辣椒种质是热辣6号，含量为33.24万SHU，其次为热辣9号，辣椒素类物质含量为27.21万SHU，两份辣椒种质均为中国辣椒类型，在一年生辣椒种质中，辣椒素类物质含量较高的是小黄椒，为15.62万SHU，其他一年生辣椒辣椒素类物质含量均低于10万SHU。
Figure 5. Capsaicinoids content in pepper germplasm resources
图5. 辣椒种质资源辣椒素类物质含量
3.3. 辣椒种质资源辣椒红素的含量分析
35份辣椒种质资源辣椒红素HPLC分析发现(图6)，辣椒红素干物质含量最高的是遵辣1号，为284.8 mg/kg，最低的小黄椒，未检测出有辣椒红素。辣椒红素含量 > 200 mg/kg的辣椒种质有6份，分别为遵辣1号、四平头、门巴辣椒、A59、遵义4号和A47；辣椒红素含量100~200 mg/kg的辣椒种质有8份，分别为CM334、益都红、A36、A61、樟树港、A39、红龙12和铁皮椒；其他21份辣椒种质资源辣椒红素含量均低于100 mg/kg。
Figure 6. Capsanthin content in pepper germplasm resources
图6. 辣椒种质资源辣椒红素含量
3.4. 辣椒素类物质与辣椒红素含量相关性分析
对辣椒素类物质与辣椒红素含量进行相关性分析(表2)，结果表明二者间的相关性不显著。
Table 2. Correlation analysis between capsaicinoids and capsanthin content
表2. 辣椒素类物质与辣椒红素含量相关性分析
|
|
辣椒素类物质 |
辣椒红素 |
辣椒素类物质 |
皮尔森相关 |
1 |
−0.016 |
显著性(双尾) |
|
0.928 |
数量 |
35 |
35 |
辣椒红素 |
皮尔森相关 |
−0.016 |
1 |
显著性(双尾) |
0.928 |
|
数量 |
35 |
35 |
4. 讨论
近年来，随着人们生活水平的提高和消费需求的多样化，对高辣、高辣椒红素辣椒品种的需求日益增加。然而目前我国高辣、高辣椒红素辣椒品种选育相对滞后，缺乏系统性的种质资源精准评价和优异基因挖掘，育种效率低，难以满足产业发展的需求[17]。因此，开展高辣、高辣椒红素辣椒种质资源的精准评价和新品种选育研究，对于提升我国辣椒产业核心竞争力，促进农民增收致富，保障国家食品安全和人民健康具有重要意义。
本研究对35份辣椒种质资源的辣椒素类物质和辣椒红素含量进行了精准评价，辣椒素、二氢辣椒素及辣椒红素标准曲线呈现出良好的线性关系，相关系数高，且色谱图基线平稳、峰形对称，确保了分析结果的准确性与可重复性，测定方法方便、快捷[3] [13]。
35份辣椒种质间辣椒素类物质的含量差异极为显著。热辣6号和热辣9号等中国辣椒类型的种质具有较高的辣椒素类物质含量，这为育种者培育高辣的辣椒品种提供了宝贵的遗传材料。深入挖掘这些种质的遗传特性，通过常规育种与分子育种技术将高辣性状导入其他综合性状优良的品种中，培育出满足深加工产业需求的高辣辣椒品种，将会推动辣椒加工产业的创新发展[18]。一年生辣椒种质中，小黄椒的辣椒素类物质含量相对突出，其他一年生辣椒含量较低，说明同类型的栽培种之间也存在丰富的辣度遗传多样性，为下一步辣椒的定向辣度育种提供了广阔空间。这种多样性的存在可能与不同辣椒种质的地理起源、进化历史以及人工选择方向密切相关[19]。
同样，不同辣椒种质间辣椒红素含量差异也较为显著。遵辣1号辣椒红素干物质含量最高，大部分种质的辣椒红素含量较低，这种现象表明辣椒红素合成在不同种质中受到复杂的遗传调控[20]。可能与果实成熟度、生长环境等因素相关联，后续如何通过精准调控环境条件或筛选合适种质在特定区域种植，以提高辣椒红素产量与质量，是值得研究的方向。随着辣椒基因组测序完成和分子生物学的发展，辣椒红素生物合成调控取得了很大突破[21]，将为深入研究辣椒红素合成的遗传影响因素提供了技术保障。
从辣椒素类物质和辣椒红素含量的综合评价来说，二者间的相关性不显著，这与尚迪等[22]研究结果一致。从数据分析来看，高辣种质多是中国辣椒类型，高红种质多集中在一年生辣椒类型，想要选育出高辣椒素类物质、高辣椒红素的新品种，还需要广泛收集优异的种质资源，并深入评价并通过种间杂交，才能选育出满足辣椒深加工产业需求的新品种。
基金项目
海南省科技计划三亚崖州湾科技城联合项目(320LH067)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1630032022009)；2019年海南省基础与应用基础研究计划(自然科学领域)高层次人才项目(2019RC315)。
NOTES
*通讯作者。