摘要: 目的：采用网络药理学和分子对接技术，对防己茯苓汤治疗脓毒症AKI的作用机制进行预测性研究。方法：先通过TCMSP数据库收集防己茯苓汤中药物组成的活性成分，SwissTargetPrediction搜索活性成分所作用的靶点蛋白。再通过GeneCards、PharmGKb、数据库、TTD数据库收集脓毒症AKI靶点蛋白，选择药物成分以及对应的靶点蛋白，利用Cytoscape构建药物–成分–靶点–疾病网络，将药物–疾病交集靶点录入STRING分析后导入Cytoscape软件，进一步构建PPI网络图。在DAVID平台获取交集靶点的作图数据，在微生信平台进行GO富集分析和KEGG通路分析。最后使用MOE和Pymol进行分子对接和渲染。结果：筛选出防己茯苓汤活性成分126种及药物靶点993个，疾病靶点3301个，防己茯苓汤治疗脓毒症AKI作用靶点448个，其中联苯双酯、(E)-1-(2,4-二羟基苯基)-3-(2,2-二甲基色烯-6-基)丙-2-烯-1-酮、四脉银胶菊素A、
β-谷甾醇、茯苓酸A为治疗疾病的核心成分，AKT1、TNF、TP53、CASP3、MAPK3为治疗疾病的核心靶点。GO富集分析得到1742个结果，主要富集于蛋白质磷酸化、磷酸化作用、炎症反应、ATP结合、蛋白丝氨酸激酶活性等过程，KEGG通路分析得到189条通路，主要通路为癌症通路、脂质和动脉粥样硬化、乙型肝炎等。分子对接验证了药物成分和疾病靶点蛋白有良好的结合能力。其中核心靶点TP53与
β-谷甾醇的结合能最小，为−7.95 kg/mol。结论：本研究采用网络药理学和分子对接技术，预测性地研究了防己茯苓汤通过多成分–多靶点–多通路治疗脓毒症AKI的机制，为临床治疗脓毒症AKI提供了证明，并为进一步提高该类病症的临床治疗效果提供了参考。
Abstract: Objective: To predict the mechanism of action of Fangji Fuling Decoction in treating sepsis-induced AKI by using network pharmacology and molecular docking technology. Methods: The active ingredients of Fangji Fuling Decoction were first collected through the TCMSP database, and the target proteins acted by the active ingredients were searched by SwissTargetPrediction. Then, the target proteins of sepsis-induced AKI were collected through GeneCards, PharmGKb, database, and TTD database, and the drug ingredients and corresponding target proteins were selected. The drug-ingredient-target-disease network was constructed using Cytoscape. The drug-disease intersection targets were entered into STRING analysis and then imported into Cytoscape software to further construct the PPI network diagram. The mapping data of the intersection targets were obtained on the DAVID platform, and GO enrichment analysis and KEGG pathway analysis were performed on the Microbiological Information Platform. Finally, MOE and Pymol were used for molecular docking and rendering. Results: A total of 126 active ingredients and 993 drug targets, 3301 disease targets of Fangji Fuling Decoction were screened, and 448 targets of Fangji Fuling Decoction in the treatment of sepsis AKI were found, among which bifendate, (E)-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-(2,2-dimethylchromen-6-yl)prop-2-en-1-one,guaiacin A, β-sitosterol, and pachymic acid A were the core components for the treatment of diseases, and AKT1, TNF, TP53, CASP3, and MAPK3 were the core targets for the treatment of diseases. GO enrichment analysis obtained 1742 results, which were mainly enriched in protein phosphorylation, phosphorylation, inflammatory response, ATP binding, protein serine kinase activity, etc. KEGG pathway analysis obtained 189 pathways, and the main pathways were cancer pathways, lipids and atherosclerosis, hepatitis B, etc. Molecular docking verified that the drug components and disease target proteins had good binding ability. Among them, the binding energy of the core target TP53 with β-sitosterol was the smallest, which was −7.95 kg/mol. Conclusion: This study used network pharmacology and molecular docking technology to predictively study the mechanism of Fangji Fuling Decoction in treating sepsis AKI through multiple components, multiple targets, and multiple pathways, which provided evidence for the clinical treatment of sepsis AKI and provided a reference for further improving the clinical treatment effect of this type of disease.
1. 引言
脓毒症是由于长期严重感染所致的会威胁生命的全身炎症反应综合征。当免疫系统受到干扰时，机体更易形成长期炎症，与此同时，体内的内毒素可进一步加剧炎症反应，最终导致脓毒症的形成[1]。脓毒症可导致多器官功能障碍和感染性休克，严重者甚至会出现多器官衰竭[2] [3]。急性肾损伤(AKI)是重症脓毒症患者常见的病死率高治愈率低的危重并发症，在我国重症医学科，脓毒症AKI病死率高达30%~35% [3] [4]，给治疗带来极大困难。
根据脓毒症AKI少尿甚至无尿的临床表现，可将其看作是“温病”、“热病”、“温毒”、“走黄”、“内陷”类疾病与“关格”、“水肿”、“溺毒”、“癃闭”类疾病的并病[5]。大量临床研究总结出了脓毒症治疗的“三证三法”[6]，对症治疗即可达到抗炎抗菌作用，但其治疗机制尚不明确。中医药在治疗复杂疾病方面具有优势，本研究探讨防己茯苓汤治疗脓毒症AKI的作用机制，为中医药治疗该疾病提供了理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 防己茯苓汤药物有效活性成分的筛选及其靶点预测
防己茯苓汤药物组成：防己、茯苓、黄芪、桂枝、甘草。在TCMSP平台(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)对全部中药成分进行检索，筛选条件为：OB (口服生物利用度) ≥ 30、DL (类药性) ≥ 0.18，获得符合条件的中药成分的InChIKey号，然后在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取上述有效成分的2D结构图或SMILES号，录入SwissTargetPrediction数据库(http://swisstargetprediction.ch/)，获得对应药物靶点，最后在Excel表格中将全部成分靶点汇总去重。
2.2. 构建“药物–成分–靶点–疾病”网络关系
在Excel表中建立防己茯苓汤药物组成、药物成分、预测靶点的Network表和Type表，将其录入CytoScape3.10.1软件中，构建“药物–成分–靶点–疾病”网络关系图。采用Analyze Network功能分析“药物–成分–靶点–疾病”网络图，计算每个节点的Degree值，并按照降序排列，得到每个药物排名第1位的活性成分作为分子对接中小分子库来源。
2.3. 脓毒症急性肾损伤靶点筛选
通过GeneCards数据库(https://www.pharmgkb.org/)、PharmGKb数据库(https://www.pharmgkb.org)、OMIM数据库(https://www.omim.org/)、TTD数据库(https://db.idrblab.net/ttd/)检索疾病的靶点蛋白，检索词为“sepsis ‘and’ acute kidney injury”、“sepsis-associated acute kidney injury”、“sepsis-induced acute kidney injury”，使用微生信平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)制作Venny图，取并集获得疾病的靶点蛋白。
2.4. 药物和疾病靶点基因预测
在Venny2.1平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)中将防己茯苓汤的药物有效活性成分靶点与脓毒症AKI靶点蛋白导入，取交集靶点。
2.5. 构建蛋白质–蛋白质互作网络(PPI)
将上述交集靶点导入STRING数据库(https://cn.string-db.org/)，设置物种为“Homo sapiens”，可见药物有效活性成分中蛋白质–蛋白质相互作用图，设置置信度 ≥ 0.4后导出文件。将交集靶点导入Cytoscape3.10.1软件(https://cytoscape.org/download.html)，使用CytoNCA插件选择中介中心性(Betweenness)、紧密中心性(Closeness)、度中心性(Degree)，计算后进行PPI网络分析。在PPI网络关系图中采用Analyze Network功能获得Degree值，并利用Degree值从大到小的顺序设置颜色深浅与形状大小，最终得到核心靶点网络图。
2.6. GO富集分析与KEGG富集分析
在DAVID平台上(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)，导入药物与疾病交集靶点蛋白文件，基因标识符选择“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，物种设置为“Homo Sapiens”。对其进行基因本体论(Gene Ontology, GO)富集分析与京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析，在生物学过程(biological process, BP)、细胞组分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF) 3个维度进行分析，寻找主要信号通路和基因功能，将GO富集分析结果导入微生信平台，选择富集条形图进行绘制。对基因产物在细胞中的代谢途径及基因代谢产物进行KEGG分析，将KEGG富集分析结果导入微生信平台，选择富集气泡图进行绘制。结合富集气泡图结果，利用Uniprot数据库和KEGG平台，绘制主要信号通路图。
2.7. 分子对接
在PubChem数据库分别获得每味药物有效活性成分的2D结构图，下载SDF格式。利用MOE建立药物有效活性成分的小分子库，并进行能量最小化。取PPI网络图中Degree值较大的靶点蛋白，在Uniport数据库(https://www.uniprot.org/)中依次检索这些靶点蛋白，选择“resolution”较小的人源蛋白分子作为进行可视化展示的蛋白，再通过RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)检索下载核心靶点蛋白结构的3D图。将核心蛋白的3D结构图依次拖入MOE (https://www.chemcomp.com/Products.htm)中，进行去水、加氢处理后开始分子对接，得到其中结合能较高的配体相互作用图，最后使用Pymol (https://pymol.org/)对其进行可视化。
3. 结果
3.1. 防己茯苓汤药物有效活性成分的筛选及其靶点预测
从TCMSP、PubChem数据库和SwissTargetPrediction获取防己茯苓汤药的有效成分和靶点信息，防己茯苓汤中的5味药共含有效成分126个，去重后有效成分靶点共计993个；包括防己成分3，对应靶点202；茯苓成分11，对应靶点336；黄芪成分18，对应靶点670；桂枝成分2，对应靶点115；甘草成分92，对应靶点792；部分关键有效活性成分见表1。
Table 1. Active ingredients of Fangji Fuling Decoction (partial)
表1. 防己茯苓汤有效活性成分(部分)
来源 |
MOL ID |
有效成分 |
中文名 |
OB/% |
DL |
防己 |
MOL002333 |
Tetraneurin A |
四脉银胶菊素A |
35.4 |
0.31 |
茯苓 |
MOL000290 |
Poricoic acid A |
茯苓酸A |
30.61 |
0.76 |
黄芪 |
MOL000387 |
Bifendate |
联苯双酯 |
31.1 |
0.67 |
黄芪 |
MOL000211 |
Mairin |
丁子香萜 |
55.38 |
0.78 |
桂枝 |
MOL000358 |
beta-sitosterol |
β-谷甾醇 |
36.91 |
0.75 |
桂枝 |
MOL000359 |
sitosterol |
谷甾醇 |
36.91 |
0.75 |
甘草 |
MOL004815 |
(E)-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-(2,2-
dimethylchromen-6-yl)prop-2-en-1-one |
(E)-1-(2,4-二羟基苯基)-3-(2,2-二甲基色烯-6-基)丙-2-烯-1-酮 |
39.62 |
0.35 |
3.2. 构建“药物–成分–靶点–疾病”网络关系
使用Cytoscape3.10.1绘制“药物–活性成分–靶点–疾病”网络图，见图1。周围5个方形节点为防己茯苓汤组成药物，圆形节点为各个药物的有效成分，中间绿色节点为药物和疾病的交集靶点，绿色面积越大，表示防己茯苓汤存在的治疗脓毒症急性肾损伤的有效靶点越多。与较多交集靶点相连的活性成分可能为防己茯苓汤治疗脓毒症急性肾损伤疾病的核心成分。药物活性成分中，Degree值最高的作为分子对接使用的小分子库来源，见表2。
Figure 1. “Drug-ingredient-target-disease” network relationship
图1. “药物–成分–靶点–疾病”网络关系
Table 2. Active ingredient molecule library
表2. 有效活性成分分子库
MOL ID |
成分名称 |
中文名 |
Degree |
来源 |
MOL000387 |
Bifendate |
联苯双酯 |
125 |
黄芪 |
MOL004815 |
(E)-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-(2,2-
dimethylchromen-6-yl)prop-2-en-1-one |
(E)-1-(2,4-二羟基苯基)-3-(2,2-
二甲基色烯-6-基)丙-2-烯-1-酮 |
63 |
甘草 |
MOL002333 |
Tetraneurin A |
四脉银胶菊素A |
63 |
防己 |
MOL000358 |
beta-sitosterol |
β-谷甾醇 |
62 |
桂枝 |
MOL000290 |
Poricoic acid A |
茯苓酸A |
60 |
茯苓 |
3.3. 脓毒症急性肾损伤靶点筛选
通过GeneCards数据、PharmGKb数据库、OMIM数据库、TTD数据库检索关键词，分别获得疾病靶点基因3210个、111个、264个和2个。将4个数据库录入Venny图后，得到疾病潜在靶点3301个，见图2。
Figure 2. Targets for acute kidney injury in sepsis
图2. 脓毒症急性肾损伤靶点
3.4. 药物和疾病靶点基因预测
将防己茯苓汤药物有效活性成分与脓毒症急性肾损伤疾病靶点蛋白导入Venny2.1在线制作平台，获得药物与疾病共同靶点448个，见图3。
Figure 3. Targets at the intersection of drugs and diseases
图3. 药物和疾病交集靶点
3.5. 构建蛋白质–蛋白质互作网络(PPI)
将药物和疾病的交集靶点导入STRING数据库，得到药物作用的蛋白质间相互作用图。为了得到防己茯苓汤治疗脓毒症急性肾损伤的核心靶点，设定筛选条件：Closeness > 0.001、Betweenness > 469.074、Degree > 50.346，最终得到了符合要求的88个关键靶点，并利用这些靶点构建PPI网络，包括88个节点、2429条边，根据Degree值设置靶点的大小及颜色，可视化的展示预测靶点治疗脓毒症AKI的可能性大小，见图4。Degree值排名前20位的靶点蛋白见表3。
Figure 4. Protein-protein interaction network (PPI)
图4. 蛋白质–蛋白质互作网络(PPI)
Table 3. Topological parameters of Fangji Fuling Decoction against sepsis-induced AKI (top 20)
表3. 防己茯苓汤抗脓毒症AKI的拓扑学参数(前20)
Gene symbol |
Degree |
Betweenness |
Closeness |
AKT1 |
261 |
9627 |
0.00159 |
TNF |
260 |
8141 |
0.00158 |
IL6 |
253 |
7747 |
0.00156 |
TP53 |
232 |
5794 |
0.00152 |
IL1B |
226 |
5200 |
0.00150 |
ALB |
218 |
8266 |
0.00149 |
EGFR |
215 |
5621 |
0.00147 |
SRC |
215 |
9362 |
0.00147 |
STAT3 |
211 |
2969 |
0.00147 |
CTNNB1 |
199 |
5969 |
0.00147 |
JUN |
195 |
2691 |
0.00143 |
CASP3 |
194 |
3039 |
0.00143 |
BCL2 |
193 |
2805 |
0.00143 |
NFKB1 |
188 |
2675 |
0.00142 |
HSP90AA1 |
188 |
3428 |
0.00142 |
HIF1A |
188 |
2578 |
0.00142 |
MAPK3 |
173 |
2973 |
0.00138 |
MMP9 |
169 |
2134 |
0.00138 |
ESR1 |
167 |
3751 |
0.00137 |
PPARG |
167 |
4057 |
0.00138 |
3.6. GO富集分析与KEGG富集分析
在DAVID平台对交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG功能富集分析，其中BP 1290条，涉及对蛋白质磷酸化、磷酸化作用、炎症反应等；CC 155条，涉及质膜、细胞溶质等；MF 297条，涉及ATP结合、蛋白丝氨酸激酶活性等；选取排名前10的条目进行可视化，见图5。KEGG富集分析结果有189条。通路涉及癌症通路、脂质和动脉粥样硬化、乙型肝炎等；选取排名前25的进行可视化，见图6。
Figure 5. GO enrichment analysis BP, CC, MF
图5. GO富集分析BP、CC、MF
Figure 6. KEGG enrichment analysis bubble chart
图6. KEGG富集分析气泡图
3.7. MAPK Signaling Pathway图
利用Uniprot数据库和KEGG平台，绘制MAPK signaling pathway图，见图7。图中红色靶点为潜在治疗靶点，可直观看到丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 (AKT1)、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤蛋白p53 (TP53)、半胱天冬酶3 (CASP3)、丝裂原活化蛋白激酶3 (MAPK3)等靶点与MAPK signaling pathway密切相关。
Figure 7. MAPK signaling pathway
图7. MAPK signaling pathway
3.8. 分子对接
在PDB检索人源蛋白分子，在structure中筛选“resolution”较小的分子，分别选择PDB ID为“3cqu”、“7jra”、“1xqh”、“2j30”、“2zoq”的分子分别作为AKT1、TNF、TP53、CASP3、MAPK3的蛋白分子来源。在MOE中进行分子对接，对接能以表格和热图形式展示如下，见表4、图8。保存结合能较低的药物分子构象，结合能越低代表药物结合效果越好，将小分子与蛋白分子共同导入Pymol渲染“对接位点图”，将对接结果可视化，分子对接结果及配体相互作用图见图9。
Table 4. Binding energy of key targets and active ingredients
表4. 关键靶点与活性成分结合能
|
结合能/(kj·mol) |
靶点 |
MOL000387 |
MOL004815 |
MOL002333 |
MOL000358 |
MOL000290 |
AKT1 |
−5.99 |
−4.77 |
−5.32 |
−6.18 |
−6.23 |
TNF |
−5.67 |
−5.32 |
−5.35 |
−5.52 |
−5.39 |
TP53 |
−6.13 |
−5.53 |
−6.29 |
−7.95 |
−6.4 |
CASP3 |
−6.22 |
−5.55 |
−5.9 |
−6.67 |
−5.98 |
MAPK3 |
−6.25 |
−5.83 |
−5.74 |
−6.46 |
−6.69 |
Figure 8. Molecular docking binding energy heat map
图8. 分子对接结合能热图
(A)
(B)
(C)
(D)
A：AKT1-联苯双酯对接点位图；B：AKT1-茯苓酸A对接点位图；C：TNF-联苯双酯对接点位图；D：TNF-四脉银胶菊素A对接点位图。
Figure 9. Molecular docking results and ligand interaction diagram
图9. 分子对接结果及配体相互作用图
4. 讨论
在西医理论中，脓毒症AKI是一种由感染引起的免疫机能失调导致长期炎症的病理征，在中医理论中，脓毒症AKI可以概括为邪毒入侵和各类外伤所致的正气虚弱、外邪入侵人体、正邪交争的病理过程，正邪交争过程中还会形成痰浊、瘀血等病理产物。现代研究中，中医痰浊代表脂质代谢紊乱，瘀血常则会导致组织缺血缺氧，凝血功能出现障碍[5]。近代以来的临床研究已经证实了防己茯苓汤治疗脓毒症AKI有着良好的临床疗效[7]。
防己茯苓汤为医圣张仲景治水气病的经典方，此方在临床治疗慢性肾炎性水肿、急性肾损伤等疾病有显著成效[8]。药理研究已充分证明了防己茯苓汤中的有效成分对于脓毒症AKI起效，防己内的生物碱可以对机体起抗炎、抗肾间质纤维化作用[9]。茯苓粗提物以及三萜类物质还有免疫调节、降脂、抗炎、抗肿瘤、抗氧化作用[10]。黄芪中的皂苷类和黄酮类物质可以通过降低血肌酐及尿素氮水平，进而促进组织自我修复，来达到防治肾小管坏死、防治肾损伤的临床效果[11]。桂枝中的桂枝醇的有效浓度达至25 mg/ml时，可达到显著抑菌抗炎效果[12] [13]。虽然目前关于防己茯苓汤各主要成分的药理作用已经基本明确，但其治疗脓毒症AKI的具体作用机制还有待阐明。
为了研究防己茯苓汤治疗脓毒症AKI的药效学基础，我们利用生物信息技术及分子对接技术将作用机制可视化。最终得到治疗疾病的关键成分为联苯双酯、四脉银胶菊素A、β-谷甾醇、茯苓酸A等。β-谷甾醇是植物甾醇的关键活性成分，目前已有多项临床试验和动物研究证实其具有抗炎、抗菌、调节免疫系统、抗氧化[14]、调节脂质代谢[15] [16]、神经保护[17]的作用，其中β-谷甾醇可通过清除体内过量的过氧化物及内外源性毒物，通过降低IL-6、IL-1β、TNF-α等因子发挥抗炎作用[18]。目前四脉银胶菊素A对脓毒症AKI的治疗作用尚不明确，可作为未来的研究方向。茯苓酸A可通过调控AMPK等信号通路而抑制氧化应激与炎症过程[19]。含有这些活性成分的药物可以进行重新配伍或经过结构修饰后制成新药，从而达到低剂量且高效的临床治疗效果。
通过PPI网络分析得到防己茯苓汤治疗脓毒症AKI的核心靶点：AKT1、TNF、TP53、CASP3、MAPK3。AKT1是AKT系列的一种亚型，主要促进细胞的存活和增殖[20]，多项研究已明确证实ATK1为治疗脓毒症AKI的治疗靶点[21]，抑制了AKT1蛋白的磷酸化可以降低肾脏指数，减轻肾损伤[22]。TNF参与调节多种生物学过程，其中包括细胞增殖和细胞凋亡等，是一种多功能的诱导因子，通过诱导激活NF-κB信号，减少免疫细胞和炎性细胞的聚集[23] [24]，从而降低基质金属蛋白酶的血浆水平[25]，调节细胞代谢、增殖等众多生物过程。TP53编码的肿瘤蛋白p53是一种肿瘤抑制蛋白，抑制p53表达可达到肾保护作用[26]。MAPK3参与各种肾脏疾病的走向发展。激活p38-MAPK信号通路可以激活NF-κB，同时释放氧化剂，使TNF-α大量表达并触发肾细胞凋亡过程，合成的TNF-α又可形成正反馈通路，使生成的TNF-α表达增强，从而进一步加重肾损伤。有研究者发现通过提前抑制p38MAPK的磷酸化，可以达到抑制炎症反应和机体应激反应，改变细胞存活、分化和凋亡的过程，进而改善脓毒症AKI的预后，降低临床患者死亡风险[27]。
GO富集分析显示，脓毒症AKI在机体内的损伤过程主要体现在蛋白磷酸化、磷酸化、炎症反应、ATP结合、丝氨酸激酶蛋白活性等方面，这些主要与肾组织的炎症应激和能量代谢密切相关。KEGG通路富集分析结果显示，癌症、脂质和动脉粥样硬化通路、乙型肝炎等信号通路是疾病发生发展中主要的调节通路，上述信号通路与炎症应激、免疫力低下和能量代谢异常有关，这提示我们可以在未来的研究中通过人工调控脓毒症AKI的炎症应激、能量代谢等方面来改变疾病的进程，将疾病损伤程度尽可能最小化。
分子对接验证了上述核心靶点蛋白与本方关键活性成分存在良好的对接活性(结合能 < −5 kcal/mol)，其中核心靶点TP53与β-谷甾醇的结合能最小，为−7.95 kg/mol，显示出较强的结合能力。本研究预测性地研究了防己茯苓汤治疗脓毒症AKI的作用机制，为临床治疗提供了依据，但相关结果还有待进一步的体内外实验加以验证。
NOTES
*通讯作者。