基于可解释深度学习神经模型PASNet的系统性红斑狼疮疾病特征基因挖掘与分析

Mining and Analysis of Systemic Lupus Erythematosus Disease Characteristic Genes Based on Interpretable Deep Learning Neural Model PASNet Combined with Bioinformatics

摘要: 目的：通过可解释深度学习神经模型(pathway-associated sparse deep neural network, PASNet)结合生物信息学方法寻找系统性红斑狼疮疾病的特征基因。方法：从NCBI的GEO数据库收集SLE外周血转录组数据，使用R语言筛选差异基因用于模型训练。基于PASNet模型构建用于SLE疾病研究的信号通路相关深度学习神经网络模型，获得SLE疾病相关的关键基因和关键通路。LASSO回归和随机森林方法进一步筛选疾病特征基因。验证SLE疾病特征基因在外部数据集上的表达情况并验证特征基因的临床诊断效果。结果：构建的神经网络模型在深度学习训练后，测试集上验证的预测效果较好，ROC曲线下面积(area under the curve, AUC)为0.82。模型获得47个疾病相关的关键基因，进一步机器学习算法分析及GSE61635数据验证筛选出ADHFE1、BCL11B、BLVRA和BOLAL四种SLE疾病特征基因。SLE单细胞数据验证结果显示，BCL11B和BLVRA基因与免疫细胞有不同程度的相关性，用其构建的临床诊断模型能很好地区分疾病。结论：通过深度学习结合生物信息学方法筛选的BCL11B和BLVRA基因可作为SLE的潜在生物标志物进一步研究。

Abstract: Objective: To identify characteristic genes of SLE using an interpretable deep learning neural model (PASNet) combined with bioinformatics methods. Methods: SLE peripheral blood transcriptome data were collected from the GEO database of NCBI, and differentially expressed genes were screened using R language for model training. A pathway-associated deep learning neural network model based on PASNet was constructed for SLE disease research to identify key genes and pathways related to SLE. LASSO regression and random forest methods were further employed to screen disease characteristic genes. The expression of these characteristic genes in external datasets was validated, and their clinical diagnostic efficacy was evaluated. Results: The constructed neural network model demonstrated good predictive performance on the test set after deep learning training, with an area under the ROC curve (AUC) of 0.82. The model identified 47 disease-related key genes, and machine learning algorithms analyze and GSE61635 data validation further screened out four SLE characteristic genes: ADHFE1, BCL11B, BLVRA, and BOLAL. SLE single-cell data validation results showed that BCL11B and BLVRA genes were correlated with immune cells to varying degrees, and the clinical diagnostic model constructed using these genes effectively distinguished the disease. Conclusion: The BCL11B and BLVRA genes screened through deep learning combined with bioinformatics methods can serve as potential biomarkers for SLE and warrant further research.

1. 引言

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种复杂的自身免疫性疾病，其发病率在中青年女性群体中尤为显著，可导致多器官和系统受到炎症损害[1]。该疾病以免疫系统功能失调为特征，导致机体产生针对自身组织的异常免疫反应，进而引发多器官和系统的慢性炎症性损害[2]。研究表明，T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)以及单核巨噬细胞等免疫细胞亚群在SLE患者体内均存在显著的功能异常。这些细胞不仅丧失了正常的免疫耐受机制，还会对自身抗原产生过度的免疫应答，通过释放促炎性细胞因子、形成免疫复合物等途径，导致全身性炎症反应和多器官损伤[3]。SLE的临床表现具有高度异质性，主要包括特征性皮肤病变、关节炎、肾脏损害(如狼疮性肾炎)、心肺功能异常以及血液系统受累等。其病因学机制涉及遗传易感性、环境触发因素、性激素水平以及免疫调节异常等多重因素的相互作用。流行病学数据显示，全球范围内SLE的患病人数已超过340万，且发病率呈逐年上升趋势，对公共卫生系统造成了沉重负担[4]。

SLE的发病机制至今尚未完全阐明，寻找新的治疗策略和诊断方法成为研究的关键[5]。近年来，随着全基因组关联研究(Genome-wide association studies, GWAS)的不断发展，研究者们已经识别出多个与SLE相关的基因位点[6]-[8]。这些基因的变异可能导致免疫系统功能异常，进而引发自身免疫反应。一些特定的基因变异，如HLA-DRB1，已被证实与SLE的风险显著增加有关。HLA-DRB1是目前已知的最强的遗传风险因素之一，携带该基因变异的个体患病风险明显高于普通人群[9] [10]。目前除了已知的基因变异外，仍有大量潜在的致病基因尚待发掘。

近年来，随着人工智能技术的快速发展，其在医学领域的应用为疾病研究提供了新的方法论支持。机器学习与深度学习算法凭借其强大的数据处理能力和特征提取能力，在疾病诊断、预后预测和药物研发等方面展现出显著优势[11]。海量的基因组学、转录组学和表观遗传学数据为揭示疾病机制提供了丰富的信息资源。通过深度学习与生物信息学分析方法的有机结合，研究者能够从多维度、多层次解析疾病的分子特征，识别关键生物标志物，构建精准的疾病预测模型，为疾病的早期诊断和个体化治疗提供理论依据和技术支持[12]。这种基于人工智能的研究范式不仅提高了疾病研究的效率，也为深入理解疾病的复杂发病机制开辟了新的研究途径。

本研究利用深度学习结合生物信息学方法，基于PASNet构建可解释的深度学习神经网络模型从GEO数据集中找出SLE疾病的关键相关基因和通路，然后采用机器学习方法进一步筛选出SLE疾病的特征基因，并验证特征基因与免疫细胞之间相关性，构建基因预测模型评估其临床诊断效果，以期寻找SLE疾病相关的诊断生物标志物。

2. 材料与方法

2.1. 数据集下载及预处理

从GEO数据库以“SLE”和“Home sapiens”为关键词载SLE转录组数据集。详细信息见表1。使用R包sva对GSE126307 [13]和GSE81622 [14]数据集进行去批次处理合并，消除不同数据集之间的差异，用于后续分析。GSE61635和GSE135779 [15]作为外部数据集对特征基因进行后续验证。

Table 1. Basic information of the datasets in this study

表1. 本研究所用数据主要信息

数据集ID	测序平台	数据类型
GSE126307	GPL13369	微列阵数据
GSE81622	GPL10558	微列阵数据
GSE61635	GPL570	微列阵数据
GSE135779	GPL20301	高通量测序数据

2.2. SLE疾病相关差异表达基因筛选

利用R语言Limma包对SLE样本和正常样本筛选差异基因(differentially expressed genes, DGEs)，筛选标准为P < 0.05，|log2FC| > 0.25，用来消除差异不显著的基因，以作为后续深度学习模型的输入。通过R包“ggplot2”和“pheatmap”分别绘制火山图和热图。在后续试验的分析中，将数据集两组样本随机选取相同数量(SLE组：34，正常人组：34)，以消除神经网络模型在运行过程中出现偏侧化问题。

2.3. 构建可解释性的通路相关深度学习神经网络模型

以PASNet [16]模型为基础，构建一个与系统性红斑狼疮路径密切相关的深度学习网络模型。该模型包括四个不同的层次：输入层(基因层)、路径层、隐藏层和输出层。经过数据预处理和分析后的数据集的80%数据集作为模型的训练数据集，其余20%数据集作为模型的测试数据集。从Reactome数据库[17]中收集数据集中差异表达基因所参与的所有通路，筛选出对应基因数大于10个的通路为SLE通路层的节点。建立基因–通路之间的二进制值矩阵，有效地立基因层和通路层之间的关系。隐藏层代表了更复杂的生物途径和过程，从而增强了网络设计的可解释性。采用AdamW作为优化器，通过引入权重衰减机制，有效解决了传统Adam优化器在某些场景下可能导致的模型性能波动问题。为进一步增强模型的鲁棒性和解释性，我们在训练过程中引入了dropout技术。该技术通过在每次训练迭代中随机丢弃部分神经元，降低了神经网络的复杂度，有效防止了过拟合现象的发生。同时，还采用了L2正则化方法，通过在损失函数中加入权重的平方范数惩罚项，约束模型的复杂度。这种双重正则化策略不仅有效抑制了模型在训练数据上的过拟合倾向，显著提升了模型在未见数据上的泛化性能，为模型的稳定性和可靠性提供了有力保障。

2.4. SLE疾病特征基因的发现和验证

采取LASSO回归算法和随机森林算法对获取的PASNet模型发现的TOP 50基因和TOP 10通路基因进行进一步分析。分析过程均由R语言实现。使用R包“glmnet”，引入L1正则化系数拟合LASSO模型，将基因数据通过10倍交叉验证确定λ的最佳值以获得特征基因。利用随机森林(Random Forest, RF)分类器对已整合SLE相关基因进行重要性排序以获得特征基因，ntree阈值设置为1000。将RF和LASSO算法得到的基因取交集作为特征基因。使用外部数据集GSE61635和GSE135779验证特征基因表达水平。取表达趋势一致基因，绘制受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic, ROC) [18]评价对诊断SLE的准确性。

2.5. 特征基因在单细胞数据上表达分析

从GSE135779中获得5例正常样本和7例成人SLE样本PBMC表达矩阵。使用R包Seurat处理数据，数据质量控制。以线粒体相关基因<10%为标准筛选细胞。对每个样本的前2000高变异基因进行归一化后分析。使用ScaleData功能对筛选出的前2000高变异基因进行缩放，并使用RunPCA功能降低PCA维度。选择dim = 20，并使用FindNeighbors和FindClusters函数将细胞聚类为20个细胞群(分辨率 = 0.8)。然后使用RunUMAP功能进行可视化。

2.6. 临床风险模型构建

采用Logistic回归模型拟合的关键基因后，构建Nomogram模型。Nomogram模型是一种图形工具，用于预测特定事件的概率，结合多个变量的信息。其构建方法包括使用R中的“rms”包，计算ROC曲线下面积(Area under the curve, AUC)，生成校准曲线评估模型诊断准确性。

3. 结果

3.1. SLE数据集预处理和差异基因筛选

GSE81622、GSE126307批次校正合并后共获得80个样本(control组：34；SLE组：46)，11,356个基因表达数据(图1(A))。使用R包“Limma”从80个样本中选出1399个差异基因，其中包括上调基因701，下调基因698。用“ggplot2”包和“pheatmap”包绘制火山图和热图(图1(B)，图1(C))。

(A)

(B) (C)

Note: (A) The expression levels of the dataset after batch effect removal; (B) The volcano plot of differentially expressed genes in SLE; (C) The heatmap of differentially expressed genes in SLE.

Figure 1. Data preprocessing and SLE related differential expressed genes identification

图1. 数据预处理和SLE差异表达基因的筛选

3.2. 可解释性深度学习模型构建和性能验证

为解决深度神经网络的“黑匣子”特性，结合基因–通路关系的生物学知识，以确定与SLE相关的基因和通路。基于PASNet模型的可解释方法将生物学知识整合到神经网络中，样本的基因表达数据作为输入，以样本状态作为标签对患者进行预测，模型框架见图2(A)。模型训练完成后，提取模型的通路层权重特征，通过提前加入的生物学先验，解释权重并用于后续的关键基因和通路的筛选。本研究将模型的学习率(η)设置为0.0004，L2正则化因子(λ)设置为0.0007，中间层的dropout为0.7和0.6，Epochs上限为3500。

为了评估模型对SLE和正常样本的预测性能，我们对测试数据集进行了十折交叉验证。这种评估方法通过将数据集分成十个子集，在每次迭代中使用九个子集进行训练，剩余一个子集进行测试，以进行全面的测试，以确保我们分析的结果稳健可靠。在测试集上，模型的AUC为0.82 (图2(B))。

(A)

(B)

Note: (A) Framework diagram of the model; (B) The area under the curve (AUC) value obtained from the receiver operating characteristic (ROC) analysis of the SLE test dataset is 0.82.

Figure 2. The framework and model performance of deep learning model PASNet used to discover SLE related genes

图2. 用于研究SLE疾病相关基因的可解释深度学习神经网络模型PASNet框架及其性能

3.3. PASNet模型发现的SLE疾病相关基因进一步筛选和外部数据集验证

通过运行神经网络模型，对模型得到权重参数进行分析，从而确定能够区分SLE和正常人的关键基因和关键通路途径。将TOP50基因和TOP10通路两部分基因进行整合，共获得47个基因。LASSO回归算法筛选出22个基因(图3(A)，图3(B))，最佳λ值为0.01844573。随机森林算法筛选前20基因，随机森林决策树个数ntree = 1000 (图3(C))。这两种算法结果取交集，获得14个SLE相关基因(图3(D))。以GSE61635作为外部数据集验证14个SLE相关基因的表达水平，其中ADHFE1、BCL11B、BLVRA、BOLAL这几个特征基因在训练集和外部数据集中的表达趋势一致且具有显著差异(图3(E)，图3(F))。

3.4. 特征基因的单细胞数据表达分析

为进一步验证ADHFE1、BCL11B、BLVRA、BOLAL基因在单细胞水平上的表达情况，我们对收集的SLE单细胞PBMC测序数据进行分析。将5例正常样本和7例SLE样本进行聚类分簇，共获得20个细胞簇。根据免疫细胞的特异性基因将20个细胞簇注释成B细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞5种细胞类型(图4(A)，图4(B))。BLVRA在SLE样本中表达明显高于正常样本的表达，BCL11B表达低于正常样本(图4(C)，图4(D))，与GSE61635数据集中表达趋势一致。

3.5. 构建SLE疾病特征基因与临床诊断的列线图

为了探究最后获得的特征基因BCL11B和BLVRA是否能用于SLE疾病的诊断，我们使用“rms”包构建列线图(图5(A))。该临床模型在训练集上AUC值为0.9035，测试集上AUC值为0.9139，显示了其良好的预测能力(图5(C)，图5(D))。此外，绘制校准曲线估算模型的诊断效果，结果表明观察到与理想状态差距很小，模型诊断效果好(图5(B))。这些发现为SLE临床诊断提供了新线索。

(A) (B)

(C) (D)

(E) (F)

Note: (A) LASSO regression coefficient path plot. The vertical axis represents the regression coefficient values; the lower horizontal axis represents the Log Lambda values, and the upper horizontal axis indicates the number of genes with non-zero regression coefficients in the model as Log Lambda increases; (B) LASSO regression cross-validation plot. The vertical axis represents the likelihood deviation, where smaller values indicate better model fit; (C) Random forest gene importance plot; (D) Venn diagram showing the intersection of genes identified by the LASSO algorithm and the random forest algorithm; (E) Differential gene expression levels in the training set; (F) Differential gene expression levels in the GSE61635 dataset.

Figure 3. LASSO regression and random forest algorithm screening of SLE disease characteristic genes and validation of expression level in external datasets

图3. SLE疾病特征基因的LASSO回归和随机森林算法筛选及其外部数据集表达水平验证

(A) (B)

(C)

(D)

Note: (A) (B) UMAP analysis of single-cell data. Different groups and cells are marked with distinct colors; (C) Expression distribution of feature genes in normal samples; (D) Expression distribution of feature genes in SLE samples.

Figure 4. Expression analysis of characteristic genes in SLE PBMC single cells

图4. 特征基因在SLE PBMC单细胞中的表达分析

(A) (B)

(C) (D)

Note: (A) Clinical prediction model diagram; (B) Calibration curve. The curve demonstrates that the accuracy of the prediction model closely aligns with the ideal scenario; (C) ROC curve and AUC value of the clinical prediction model in the training set. (D) Receiver operating characteristic (ROC) curve and area under the curve (AUC) of the clinical prediction model in the test set GSE61635.

Figure 5. Nomogram of SLE disease characteristic genes and clinical diagnosis

图5. SLE疾病特征基因与临床诊断的列线图

4. 讨论

系统性红斑狼疮(SLE)作为一种具有复杂发病过程和显著临床异质性的自身免疫性疾病，其确切病因至今尚不清楚。为了深入揭示SLE的致病分子机制，通过分析SLE患者的基因表达数据，挖掘出SLE发病过程中的关键分子信号和生物通路，本研究通过一种具有解释性深度学习网络模型结合生物信息学方法对SLE基因表达数据进行分析。该神经网络模型与以往传统的生物信息学和深度学习方法相比，其模型框架具有一定优势。首先，模型中引入一层细胞的信号转导通路，使得模型最后的预测结果具有一定的可解释性。其次，可以处理稀疏标记，能够在复杂的相互作用中提取真正的隐藏信号[12]。最后，通过增加样本量和维度，可以有效利用深度学习模型的力量来捕捉特征之间的非线性相互作用，从而提高预测准确性。

深度学习网络模型PASNet最初被设计用于分析和预测原发性脑癌患者的预后，与其他分类预测模型进行比较时，PASNet模型预测准确性的AUC值达到了显著的0.6622，位居所有相比较模型之首。所以本研究采用该模型分析了阿尔茨海默病帕金森病的关键基因，对这些疾病能进行精准的分类预测，其AUC值分别高达0.82和0.73。所预测的生物通路和关键基因较多也与已知知识相符[19] [20]。

本研究在SLE的DGEs中识别出BLVRA和BCL11B这2个关键基因，它们可能参与SLE发生和发展，同时在单细胞数据中发现关键基因都与免疫细胞存在一定的关系。并由此构建SLE临床预后模型列线图，ROC曲线和校正曲线证实关键基因构建的诊断模型具有较好的预测准确性，AUC值在0.9以上。

BLVRA基因编码的胆绿素还原酶A (Biliverdin reductase A)是一种关键的酶，在血红素代谢途径中起着至关重要的作用。属于胆绿素还原酶家族，是种非冗余NADH依赖性胆绿素还原酶，该家族的成员在NADPH或NADH存在的情况下催化胆绿素转化为胆红素来调节细胞氧化还原循环，参与了细胞内的氧化还原平衡调节[21]。胆红素作为一种强效的内源性抗氧化剂，能够清除自由基，保护细胞免受氧化应激的损伤[22]-[24]。研究表明，胆红素不仅具有抗氧化作用，还具有显著的抗炎和免疫调节功能，这些特性使其在预防和治疗多种疾病中具有潜在的应用价值，特别是在自身免疫性疾病、心血管疾病和神经退行性疾病等领域。

在免疫系统中，单核细胞和巨噬细胞是BLVRA基因表达的主要细胞类型。这些细胞在先天免疫和适应性免疫反应中发挥着核心作用。巨噬细胞通过吞噬病原体、呈递抗原和分泌细胞因子来调节免疫反应。研究发现，胆绿素还原酶A在巨噬细胞外表面的表达能够通过诱导抗炎细胞因子白细胞介素-10 (IL-10)的合成，发挥抗炎和保护作用[25] [26]。IL-10是一种重要的抗炎细胞因子，能够抑制促炎因子的产生，调节免疫反应的平衡，从而减轻炎症反应和组织损伤[27]。

BCL11B基因编码的锌指蛋白样转录因子是一种关键的调控分子，尤其在免疫系统中发挥着重要作用。作为FOXP3的辅助因子[28]，BCL11B在调节性T细胞(Treg细胞)的功能维持和免疫耐受中扮演着核心角色[29]。FOXP3是调节性T细胞的主要转录因子，而BCL11B通过与FOXP3的相互作用，能够增强其转录活性，从而促进Treg细胞的分化和功能[30]。Treg细胞在抑制过度免疫反应和维持免疫稳态中至关重要，其功能异常与多种自身免疫性疾病的发生密切相关。在B细胞和T细胞的分化与增殖过程中，BCL11B基因也发挥着重要的调节作用[31] [32]。研究表明，BCL11B通过调控一系列下游靶基因的表达，影响B细胞和T细胞的发育和功能。例如，在T细胞发育过程中，BCL11B参与调控胸腺细胞的分化，确保T细胞受体(TCR)信号通路的正常传递[33]。

BCL11B基因的功能缺失或突变会导致严重的免疫系统异常。在BCL11B基因缺陷的小鼠模型中，研究人员观察到显著的自身免疫表型，包括多器官炎症和调节性T细胞功能的严重紊乱[34]。这些小鼠表现出免疫耐受的破坏，导致免疫系统对自身抗原的攻击，进而引发自身免疫性疾病。这一发现进一步证实BCL11B在维持免疫稳态中的关键作用。在人类疾病中，BCL11B基因的罕见变异与某些原发性免疫缺陷病和自身免疫性疾病的发生相关。例如，在儿童系统性红斑狼疮患者中，研究发现BCL11B基因存在罕见性变异，这些变异可能导致基因功能的改变，从而增加儿童对系统性红斑狼疮的易感性[35]。

5. 结论

本研究基于可解释深度学习模型，结合生物信息学方法对SLE的转录组数据进行系统性分析，筛选出BCL11B和BLVRA作为SLE的关键疾病特征基因。研究表明，这两个基因在SLE的发生和发展中具有重要的调控作用，且与SLE的疾病诊断密切相关。然而，由于本研究主要依赖于计算生物学分析，缺乏分子生物学实验验证，BCL11B和BLVRA在SLE中的具体分子机制尚未完全阐明。因此，未来需要通过分子生物学实验进一步验证这两个基因的功能及其作用机制。

基金项目

国家自然科学基金项目(32060157)；国家级大学生创新创业训练计划(202210601048)。

NOTES

^*通讯作者。