1. 前言
糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)是一组因胰岛素绝对或相对分泌不足和(或)胰岛素利用障碍引起的代谢紊乱性疾病[1]，随着生活水平的提高，其在世界的发病率逐年上升，糖尿病肾病(DN)是其常见且严重的微血管并发症，以进行性蛋白尿和肾小球滤过率(GFR)逐渐下降为特征，目前已发现更多的生物标志物有助于早期发现DN，例如：Serum cystatin C、E-cadherin levels、Type IV collagen等[2]。30%~40%的糖尿病患者患有肾病，DN患病率占慢性肾病(Chronic Kidney Disease, CKD)病例总数的三分之一[3]，且极易进展为肾病终末期，为各国造成巨大的经济负担，严重影响糖尿病患者的预后及生存质量，但临床对此仍缺乏有效的治疗方法，迄今为止，虽然糖尿病肾病的患病率仍在升高，但其危险因素的证据线尚未完全确定，目前认为糖尿病肾病受糖基化终末产物的积累(AGE)、炎症反应、氧化应激、自噬、线粒体损伤、脂代谢紊乱、遗传等多种发病机制共同影响[4]。
维生素种类繁多，是维持机体生命活动过程所必需的一类有机化合物[5]，发挥着保护视力、营养神经、促进身体新陈代谢、促进骨骼发育、增强免疫力等多种作用。
维生素D在肝脏经25-羟化酶催化成25羟基维生素D (25OH-D)，后在肾脏经1α-羟化酶进一步催化形成1,25-二羟基维生素D (1,25(OH)2D3)，维生素D促进胰岛β细胞Ca2+内流，并调节胰岛β细胞存活，促进胰岛素分泌，调节糖代谢，其还是肾素–血管紧张素(RAS)的抑制剂，1,25(OH)2D3可缓解高血糖诱导的足细胞凋亡[6]，逆转足细胞自噬，近期已有大量的动物性研究、观察性研究阐明25-羟基维生素D水平和糖尿病肾病两者之间存在显著相关性。
维生素E是一种有效的抗氧化剂，能够减少氧化应激和炎症反应，减轻糖尿病肾损伤；维生素C是重要的还原剂，体内多种酶反应途径的重要辅助因子能够将氧自由基转变为脱氢抗坏血酸，从而减少自由基产生和促进自由基的清除达到抗氧化作用，改善肾功能；同型半胱氨酸(Hcy)通过破坏二硫键的形成，影响蛋白质折叠，导致肾脏的足细胞损害，诱导炎症递质表达促进肾小球硬化，维生素B12，可辅助同型半胱氨酸(Hcy)重新合成甲硫氨酸。降低患者血浆Hcy水平，保护肾功能，控制DN进展[7]。目前已有相关的观察性研究证明维生素E、维生素C、维生素B12在降低尿蛋白、保护肾功能，延缓糖尿病肾病进展等方面发挥着积极的作用。
然而这些动物研究或临床观察性研究，未能证实糖尿病肾病与维生素之间的独立关联，其可能受阳光光照、炎症介质、糖代谢水平等因素的干扰，无法推断出直接因果关系，随着孟德尔随机化研究(MR)的普遍应用，可从流行病学的层面来评估暴露因素与结局变量之间的因果关系，由于遗传基因是随机分配的，可有效的克服混杂因素及反向因果的干扰。
2. 研究方法
2.1. 数据来源
所有用于两样本孟德尔随机化分析的血清维生素及糖尿病肾病的数据均可在IEU OpenGWAS在线数据库中获得[8]。血清25-羟基维生素D (25 hydroxyvitamin D (25OH-D))的数据来自于2020年Revez JA [9]等发表的研究，此研究基于417,580例欧洲人群的分析数据，8,643,988个SNP用于GWAS分析；血清Vit B12，血清VitC，血清VitE的数据均来自于英国生物银行(UK Biobank) (http://www.nealelab.is/uk-biobank)，血清Vit B12，血清VitC，血清VitE三个数据集的样本量为64,979，共计9,851,867个SNP；糖尿病肾病数据来自于芬兰数据库(The FinnGen Biobank) (https://www.finngen.fi/en)，该数据集样本量为213,746，包括3283例糖尿病肾病患者和210,463例健康对照，16,380,453个SNP用于GWAS分析。由于本研究基于已发表的公开GWAS数据，因此不需要伦理批准或知情同意(见表1)。
Table 1. Summary of the GWAS included in the study
表1. 本研究使用的GWAS汇总数据
Items |
GWAS ID |
Sample size |
Number of SNPs |
Population |
糖尿病肾病 |
finn-b-DM-NEPHROPATHY |
213,746 |
16,380,453 |
European |
25OH-D |
ebi-a-GCST90000615 |
417,580 |
8,643,988 |
European |
维生素B12 |
ukb-b-19524 |
64,979 |
9,851,867 |
European |
维生素C |
ukb-b-19390 |
64,979 |
9,851,867 |
European |
维生素E |
ukb-b-6888 |
64,979 |
9,851,867 |
European |
2.2. 工具变量的选择
本研究使用单核苷酸多态性(snp)作为工具变量(IVs)，snp是DNA序列中单个碱基对变异发生的特定位置。对于工具变量，必须满足关联性、独立性、排他性三个假设：1) 关联性假设：作为IVs的遗传变异与暴露相关；2) 独立性假设：IVs与结果不相关；3) 排除限制假设：IVs与除暴露外的任何混杂因素无关(见图1)。根据P < 5 × 10−8和次要等位基因频率 > 0.01分别选择与25OH-D、维生素C、维生素E、维生素B12水平相关的snp。此外，我们分别计算了snp的F统计量，以调查是否存在弱工具偏差。F统计量可以使用以下公式计算：F = (R2/k)/([1 − R2]/[n − k − 1])，使用R软件包“TwoSampleMR”进行两样本孟德尔随机化分析。
Figure 1. Mendelian randomized study design
图1. 孟德尔随机化的研究设计
2.3. 统计学分析
本研究采用随机效应逆方差加权法(Inverse-Variance Weighted, IVW)作为MR分析的主要分析方法。当所选遗传变异满足工具变量假设，IVW法对因果效应的估计值最准确[10]。同时，使用MR-Egger回归法(MR-Egger regression)、加权中位数法(Weighted Median, WM)、简单模型(Simple Mode)和加权模型(Weighted Mode)法作为MR分析的补充方法。WM法是对纳入的有效IVs排列，将所得中位数作为分析结果，MR-Egger回归法可对MR结果进行敏感性分析[11]。本研究的结局为二分类变量，故采用比值比(Odds Ratio, OR)及95%置信区间(95% Confidence Interval, 95% CI)对分析结果进行评价，P < 0.05认为有统计学意义；检验水准α = 0.05。
2.4. 敏感性分析
应用Cochran Q检验评估遗传变异的因果关系是否存在异质性，当P < 0.05时提示存在异质性，需关注随机效应IVW模型结果[12]。MR-Egger法的截距用于检测是否存在水平多效性，若截距与0相距较远且P < 0.05时，提示存在水平多效性[11]。留一法(Leave-one-out sensitivity test)进行敏感性分析，评估是否存在单个SNP对MR结果产生影响。本研究所有MR分析均使用R 4.2.2中的“Two Sample MR”包实现。
3. 结果
3.1. 工具变量筛选
以血清维生素水平为暴露因素，糖尿病肾病为结局变量，根据本研究的筛选标准，最终纳入了212个与血清25OH-D，9个与VitB12、10个与VitC、11个与VitE相关的SNP。所有工具变量的F值均大于10，表明MR分析不存在弱工具变量偏倚的影响。
3.2. 血清25OH-D水平与糖尿病肾病的MR分析
以血清25OH-D水平为暴露因素，以糖尿病肾病为结局变量进行两样本MR分析。随机效应IVW结果显示血清25OH-D水平与糖尿病肾病高发病风险相关(OR = 1.522, 95% CI = 1.212~1.910, P < 0.001) (见表2)。MR-Egger回归检验表明结果不存在水平多效性(P = 0.539)，Cochran’s Q检验表明存在异质性。利用Leave-one-out法进行敏感性分析以检验单个SNP位点对总体因果关系的影响见图2，结果提示系统去除单个SNP对总体MR因果关系并未产生显著影响。SNPs对25OH-D和DN的因果估计影响大小的散点图、漏斗图如图3和图4所示。
Figure 2. Sensitivity analysis of causality between 25OH-D levels and DN
图2. 25OH-D水平和DN因果关系的敏感性分析
Figure 3. Scatterplot of the relationship between 25OH-D and DN
图3. 25OH-D和DN之间关系的散点图
Figure 4. Funnel plot of the relationship between 25OH-D and DN
图4. 25OH-D和DN之间关系的漏斗图
Table 2. Univariate MR study results of the relationship between 25OH-D and DN
表2. 25OH-D与DN之间关系的MR分析结果
Method |
Number of SNPs |
OR |
95% CI |
P |
Inverse-variance weighted |
212 |
1.522 |
1.212~1.910 |
P < 0.001 |
MR-Egger |
212 |
1.400 |
0.988~1.985 |
0.539 |
Weighted median |
212 |
1.533 |
1.095~2.145 |
0.013 |
Simple Mode |
212 |
1.764 |
0.800~3.890 |
0.161 |
Weighted Mode |
212 |
1.444 |
1.083~1.927 |
0.013 |
3.3. 血清VitB12、VitC、VitE水平与糖尿病肾病的MR分析
以血清VitB12、VitC、VitE水平为暴露因素，以糖尿病肾病为结局变量进行两样本MR分析，随机效应IVW结果显示未发现血清维生素B12 (OR = 0.718, 95% CI = 0.279~1.848, P = 0.492 > 0.05)、维生素C (OR = 1.123, 95% CI = 0.615~2.052, P = 0.705 > 0.05)、维生素E (OR = 1.095, 95% CI = 0.682~1.759, P = 0.707 > 0.05)与糖尿病肾病之间存在因果关系见表3~5。MR-Egger回归检验未发现维生素B12 (P = 0.602)、维生素C (P = 0.591)、维生素E (P = 0.433)存在水平多效性，Cochran’s Q检验表明VitB12存在异质性。VitC、VitE不存在异质性。利用Leave-one-out法进行敏感性分析以检验单个SNP位点对总体因果关系的影响，结果提示系统去除单个SNP对总体MR因果关系并未产生显著影响。
Table 3. Univariate MR study results of the relationship between VitB12 and DN
表3. VitB12与DN之间关系的MR分析结果
Method |
Number of SNPs |
OR |
95% CI |
P |
Inverse-variance weighted |
9 |
0.718 |
0.279~1.848 |
0.492 |
MR-Egger |
9 |
0.400 |
0.039~4.066 |
0.602 |
Weighted median |
9 |
0.774 |
0.333~1.796 |
0.550 |
Simple Mode |
9 |
0.523 |
0.173~1.578 |
0.283 |
Weighted Mode |
9 |
0.673 |
0.241~1.876 |
0.471 |
Table 4. Univariate MR study results of the relationship between VitC and DN
表4. VitC与DN之间关系的MR分析结果
Method |
Number of SNPs |
OR |
95% CI |
P |
Inverse-variance weighted |
10 |
1.123 |
0.615~2.052 |
0.705 |
MR-Egger |
10 |
0.817 |
0.228~2.936 |
0.591 |
Weighted median |
10 |
0.820 |
0.391~1.717 |
0.598 |
Simple Mode |
10 |
0.678 |
0.199~2.307 |
0.549 |
Weighted Mode |
10 |
0.705 |
0.300~1.660 |
0.445 |
Table 5. Univariate MR study results of the relationship between VitE and DN
表5. VitE与DN之间关系的MR分析结果
Method |
Number of SNPs |
OR |
95% CI |
P |
Inverse-variance weighted |
11 |
1.095 |
0.682~1.759 |
0.707 |
MR-Egger |
11 |
0.780 |
0.306~1.994 |
0.433 |
Weighted median |
11 |
0.967 |
0.504~1.856 |
0.920 |
Simple Mode |
11 |
0.939 |
0.369~2.392 |
0.898 |
Weighted Mode |
11 |
0.957 |
0.452~2.025 |
0.910 |
4. 讨论
迄今为止，已有大量研究表明，25OH-D干预可显著改善糖尿病前期肾脏结构和功能，由于25OH-D在DN发生发展中的作用明显，25OH-D对DN的影响引起了广泛关注。近期一项动物实验中，作者构建糖尿病前期小鼠模型，通过维生素D (VD)干预剂量不同，分为4组，对照组正常喂养，经过为期16周观察，得出VD可通过Klotho/p53通路对糖尿病前期小鼠肾脏损伤起到保护作用[13]，GUANQING LI等人另一项动物研究证明，维生素D3可降低肾小管上皮细胞中α-平滑肌肌动蛋白和E-钙粘蛋白的表达，改善肾小管间质纤维化。下调Bax/Bcl2蛋白比例，减轻肾小管上皮细胞凋亡[14]。为进一步研究人体内25OH-D与糖尿病肾病的关系，各位研究者进行了一系列临床研究：一项基于95例糖尿病肾病患者的回顾性分析中，与未补充维生素D组相比(33.33%)，补充普通维生素D组和补充活性维生素D组的降低尿蛋白的总有效率分别为80.65%和74.19% (P < 0.001和P = 0.002) [15]，另一项基于90例2型糖尿病肾病患者的回顾性分析示：25-(OH)D3水平相比，对照组>正常蛋白尿(24 h-UAE < 30 mg)组 > 微量蛋白尿(24 h-UAE为30~300 mg)组 > 临床蛋白尿(24 h-UAE > 300 mg)组，差异有统计学意义(P < 0.05) [16]。周慧等人纳入2型糖尿病患者126例，依据肾小球滤过率及尿蛋白指标分为糖尿病肾病组(DKD)及对照组，DKD组血清25羟维生素D3、骨钙素水平分别为19.64 ± 6.12 ng/mL和13.95 ± 5.63 ng/mL低于对照组的27.32 ± 6.84 ng/mL (t = 3.084, P = 0.003)和16.95 ± 5.19 ng/mL (t = 2.456, P = 0.016) [17]。为扩大样本量，Yomna E. Dean等人一项纳入了23项研究和7722例患者的Meta分析也证明了这一点，同时他们还提出年龄和糖尿病病程和维生素D水平无关[18]。
然而，Mingjie He等人对7751例I型糖尿病相关肾病(T1DN)和9933例II型糖尿病相关肾病(T2DN)患者进行了维生素D对糖尿病肾病的因果影响的孟德尔研究[19]。其结果显示，25(OH)D可增加T1DN晚期发病风险(OR = 1.213, 95% CI: 0.367~4.010)，降低T1DN早期发病风险(OR = 0.903, 95% CI: 0.229~3.555)，T2DN早期发病风险(OR = 0.588，95% CI：0.182~1.904；T2DN后期发病风险：OR = 0.904，95% CI：0.376~2.173)。在本研究中，我们通过MR分析证明25OH-D可增加糖尿病肾病的风险。Mingjie He等人的研究结果与我们的研究结论存在一定差异，提示25(OH)D与糖尿病肾病的关系可能更为复杂，需要进一步的研究来明确其在不同类型和不同阶段糖尿病肾病中的具体作用。我们的分析比之前的观察性研究提供了更确凿的证据，因为它包括各种敏感性方法来排除水平多效性的偏倚可能性。
与25OH-D相比，维生素B12、维生素C、维生素E与糖尿病肾病相关性的研究相对较少。2018年一项关于维生素E与糖尿病肾病的临床实验已提出维生素E可显著降低肌酐[20]，随后郭科婷等人的一项共纳入8篇随机对照试验(RCTs)，涉及到552例糖尿病肾病患者的Meta分析结果示维生素E显著改善24 h尿蛋白[MD = −47.31, 95% CI (−50.8, −43.81), P < 0.00001]血肌酐[MD = −11.10, 95% CI (−12.78, −9.41), P < 0.00001]、总胆固醇[MD = −0.27, 95% CI (0.36, −0.18), P < 0.00001]，差异具有统计学意义[21] 2021年一项纳入108例冠心病合并早期DN患者的病例对照研究，其对照组予以碳酸氢钠治疗，观察组给予碳酸氢钠联合维生素C治疗，治疗后观察组总胆固醇TC (5.71 ± 0.41) mmol/L、尿素氮BUN (20.51 ± 3.28) mmol/L均低于对照组的(9.32 ± 1.34)、(24.09 ± 3.87) mmol/L，差异均具有统计学意义(P < 0.05) [22]。可见维生素C在延缓糖尿病肾病进展中发挥积极作用。早在2015年印度就已有关于维生素B12水平与糖尿病肾病相关性的临床研究，得出血清维生素B12肾病组的水平(181.6 ± 17.6 pg/dL)显著低于无肾病组(286 ± 30.1 pg/dL) (P = 0.03) [23]。苏萍等人的一项病例对照研究得出维生素B12联合叶酸治疗糖尿病肾病(DN)伴高同型半胱氨酸血症(HHcy)患者不仅可有效降低患者体内Hcy，还可保护患者的肾功能，控制DN的进展[7]。与之相反，House等人的一项研究表明，在晚期糖尿病肾病患者中，高剂量补充维生素VitB6、VitB9和VitB12会严重影响肾功能[24]。
我们的MR分析表明维生素B12、维生素C、维生素E并不直接影响糖尿病肾病的临床病程。彼此之间无明显的因果关系，这与观察性研究结论相反，可能与观察性研究的局限性有关，观察性研究是横断面研究设计，不能作为血清维生素水平与糖尿病肾病之间因果关联的直接证据。仍需要进一步的研究来证实这一点。
我们的研究存在以下几点优势，首次通过孟德尔随机化研究，探讨多种维生素与糖尿病肾病之间的因果关系，我们仔细选择了独立的snp，并进行了一系列敏感性分析，以减轻混杂因素对因果效应的影响。这在克服环境混杂因素、反向因果关系、样本量不足、选择偏倚等问题上具有极大优势，其次使用汇总型数据库，样本具有代表性。这些发现有助于更好地理解血清维生素水平在糖尿病肾病中的作用，并为临床医师和研究人员进一步研究提供一定的参考价值。
然而，我们的研究也存在一些局限性：两样本孟德尔随机化分析所使用的GWAS数据来自欧洲血统人群，结果是否适用于其他种族人群尚不能确定。因此需要未来的更多MR研究来确认研究结果的可靠性，特别是在非欧洲人群中。另外MR分析的主要假设是遗传变异仅通过维生素D浓度影响DN，但未知功能对遗传变异的影响也可能独立影响DN。除此之外也需要更大的早期和晚期DN、不同类型糖尿病肾病的样本量来揭示维生素水平与DN进展之间的关系。虽然研究使用了汇总数据，但不同维生素的样本量差异较大，特别是维生素B12、C、E的样本量仅为64,979，可能会影响统计效力，导致假阴性结果，未来的研究可以考虑增加样本量以提高统计效率。
5. 结论
综上所述，这是第一个探讨维生素水平对糖尿病肾病的因果关系的MR研究，尽管观察性研究表明25(OH)D、维生素B12、维生素C、维生素E与糖尿病肾病有很强的相关性，但我们的MR研究表明25(OH)D与糖尿病肾病高风险存在因果关联。维生素B12、维生素C、维生素E对糖尿病肾病产生影响的可能性较小，因此，基于目前的研究结果，没有迹象表明补充维生素D、维生素B12、维生素C、维生素E可能对预防糖尿病肾病有益。但需要注意的是，维生素在体内并非孤立存在，它们之间可能存在相互作用，共同影响DN的发生发展。本研究仅分析了单一维生素与DN的关系，未考虑维生素间的协同或拮抗作用，未来的研究可以进一步探讨维生素之间的相互作用对糖尿病肾病的影响。
致 谢
自此本篇文章的写作告一段落，感谢导师对本篇文章的指导及提出的建设性建议，感谢阅稿人的认真审阅。
NOTES
*通讯作者。