混合生物膜的感染与治疗最新研究进展

Recent Research Advances in Infection and Treatment of Hybrid Biofilms

摘要: 混合生物膜感染是一种由多种微生物共存并形成生物膜的复杂感染类型，在慢性伤口、肺部感染、医疗器械相关感染等临床场景中极为常见。由于生物膜的胞外基质(Extracellular Polymeric Substances, EPS)屏障、持留菌、微生物相互保护作用、耐药基因水平传播等因素，混合生物膜感染对抗生素表现出极强的耐受性，导致治疗困难、感染反复发作，并使全球抗生素耐药问题进一步恶化。传统抗生素自青霉素发现以来，在感染治疗中发挥了重要作用。然而，在治疗混合生物膜感染时，传统抗生素存在药物穿透受限、持留菌耐受、微生物间协同耐药、群体感应(Quorum sensing, QS)调控耐药性等诸多缺陷。例如，β-内酰胺类抗生素因EPS屏障作用难以到达深层细菌，氨基糖苷类抗生素由于正电荷特性难以扩散，而喹诺酮类抗生素易诱导耐药突变。此外，混合生物膜中的细菌可以通过基因水平转移(horizontal gene transfer, HGT)迅速传播耐药基因，使联合抗生素疗法的效果受限，甚至可能加速耐药菌的进化。由于传统抗生素的局限性，混合生物膜感染的治疗面临极大挑战。因此，未来的研究方向应集中在新型抗菌策略上，包括纳米药物递送系统、生物膜靶向抗菌药物、噬菌体疗法、抗生物膜酶治疗、免疫调控疗法等，以期有效破坏混合生物膜结构，提高抗感染治疗的成功率。

Abstract: Mixed biofilm infection is a complex type of infection in which multiple microorganisms coexist and form a biofilm, which is extremely common in clinical scenarios such as chronic wounds, pulmonary infections, and medical device-related infections. Due to factors such as the Extracellular Polymeric Substances (EPS) barrier of biofilms, holding bacteria, mutual protective effects of microorganisms, and transmission of drug-resistant genes at the horizontal level, mixed biofilm infections show extreme resistance to antibiotics, leading to treatment difficulties, recurrent infections, and further worsening the global antibiotic resistance problem. Conventional antibiotics have played an important role in the treatment of infections since the discovery of penicillin. However, in the treatment of mixed biofilm infections, traditional antibiotics have many shortcomings, such as limited drug penetration, tolerance of holdout bacteria, synergistic resistance among microorganisms, and resistance modulation by quorum sensing (QS). For example, β-lactam antibiotics are difficult to reach deep bacteria due to the EPS barrier, aminoglycoside antibiotics are difficult to diffuse due to the positive charge property, and quinolone antibiotics are prone to induce drug resistance mutations. In addition, bacteria in mixed biofilms can rapidly spread drug-resistant genes through horizontal gene transfer (HGT), which limits the effectiveness of combination antibiotic therapy and may even accelerate the evolution of drug-resistant bacteria. The treatment of mixed biofilm infections is extremely challenging due to the limitations of conventional antibiotics. Therefore, future research should focus on novel antimicrobial strategies, including nano drug delivery systems, biofilm-targeted antimicrobials, phage therapy, anti-biofilm enzyme therapy, and immunomodulatory therapy, with the aim of effectively destroying the structure of mixed biofilms and improving the success rate of anti-infective treatments.

1. 引言

生物膜是一种由微生物群体分泌的胞外聚合物包裹形成的结构化聚集体，这些生物膜赋予微生物极强的抗逆性，使其在不利环境下依然能够存活[1]。混合生物膜感染是指由两种或多种不同微生物共同组成的生物膜引发的感染。这种感染在慢性伤口、肺部感染、尿路感染、口腔疾病、植入物相关感染等临床疾病中广泛存在，极大地增加了抗生素治疗的难度[2]。混合生物膜感染的复杂性远超单一菌种生物膜，因其具有异质性、基因水平交换、共生互作、群体感应调控等特性，使得传统的抗生素治疗难以有效清除感染[3]。因此，深入研究混合生物膜的形成机制、微生物间相互作用以及抗菌策略，对于开发新的抗感染疗法具有重要意义。

2. 混合生物膜的形成机制

2.1. 生物膜的基本结构

生物膜由微生物聚集而成，并嵌入到一个由多糖、蛋白质、脂质和核酸组成的胞外基质中。该基质在生物膜的形成和抗性中起着关键作用，其中EPS主要起到提供机械保护，增强细菌粘附能力的作用[4]。而细胞外DNA (extracellular DNA, eDNA)则能起到促进细菌的遗传物质交换的作用，这样能增强耐药性[1] [5]。剩余的蛋白质与脂质则维持生物膜的结构稳定性，并调节细胞间的信息通讯。

2.2. 混合生物膜的动态演变

混合生物膜的形成通常经历几个阶段。首先微生物通过菌毛、鞭毛、黏附素等附着到宿主组织或人工表面(如导管、植入物)形成可逆附着。然后细菌开始分泌EPS形成不可逆附着，增强附着力，并促进生物膜稳定形成。当多种微生物形成稳定的附着后，会慢慢演变为微生物群落，不同微生物种群之间会发生复杂的相互作用，建立复杂的共生关系。最后多种微生物在生物膜内形成高度有序的结构，标志着成熟生物膜形成，此时生物膜的耐药性显著增加[4] [6]。部分微生物还可以发生群体脱落，迁移到新的部位进行分散与传播，形成多方位的感染[7]。

2.3. 细菌–细菌相互作用

在多种细菌形成的混合生物膜中，不同菌种之间可能存在三种主要关系。第一种是互利共生，两种或多种细菌通过代谢互补、耐药基因交换等方式互相促进[8]。例如，铜绿假单胞菌分泌铁载体，帮助金黄色葡萄球菌在低铁环境下生存[9]。第二种是竞争抑制，某些细菌可以分泌抑制性物质，如大肠杆菌可通过细菌素抑制其他细菌的生长[10]。第三种是寄生关系，某些病原菌可以利用共生菌的代谢物进行生长，如牙龈卟啉单胞菌可借助其他厌氧菌制造的环境生存[11]。

2.4. 细菌–真菌相互作用

而在真菌与细菌形成的混合生物膜中，细菌和真菌的共生关系尤其重要。如白色念珠菌与金黄色葡萄球菌混合时，白色念珠菌可形成三维网络，提供额外的粘附位点，主要通过真菌黏附素Als3使金黄色葡萄球菌更容易形成定植[12]。而铜绿假单胞菌与白色念珠菌混合时则会产生抑制作用，铜绿假单胞菌可分泌毒素，抑制白色念珠菌的生长，形成竞争关系[13]。

3. 混合生物膜的耐药机制

混合生物膜感染后远比单一菌种感染更难以治疗，主要由于其多种耐药机制。生物膜的EPS可以形成物理屏障作用，阻碍抗生素的渗透，使其难以到达深层微生物，从而降低抗菌效果[14]。不同微生物在生物膜中的代谢状态不同，部分处于休眠状态，即持留菌，该状态下对抗生素有天然的耐受能力[15]。QS也是一种重要的细菌耐药机制，其通过信号分子调节基因表达，可影响生物膜的形成、毒力因子表达及耐药性[16]。如铜绿假单胞菌的LasI/LasR系统可以调控生物膜成熟和抗生素耐受性[17]。金黄色葡萄球菌的Agr系统同样也可以调节生物膜的分散和耐药因子的表达[18]。但目前对于QS机制的研究不够充分，需要进行更多菌种的的研究，进一步探索QS的机制。在混合生物膜中，细菌还可以通过质粒、噬菌体或转座子进行基因交换，从而快速传播耐药基因。如碳青霉烯类耐药菌的bla_KPC基因可以通过质粒在革兰阴性菌之间传播[19]。

4. 混合生物膜感染的临床表现

混合生物膜可以对人体造成多种感染。如糖尿病足溃疡(DFU)，是通常以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、厌氧菌等为主形成的慢性伤口混合感染，难以愈合[20]。铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和真菌可共同形成生物膜，造成囊性纤维化肺部感染，由于部位深在，感染情况复杂，抗生素常常难以彻底清除病原微生物，导致反复感染[21]。大肠杆菌、克雷伯菌、肠球菌和真菌等可在导管表面形成混合生物膜，导致难治性尿路感染[22]。牙菌斑也是典型的混合生物膜，包含变形链球菌、乳酸杆菌、牙龈卟啉单胞菌等，导致龋齿和牙周病[23]。

5. 传统药物在混合生物膜治疗中的历史及缺陷

抗生素的应用是人类医学史上最重要的突破之一，自1928年弗莱明发现青霉素以来，抗菌药物在治疗各种感染性疾病中发挥了至关重要的作用。然而，随着抗生素的滥用和细菌耐药性的逐步发展，特别是在混合生物膜感染的背景下，传统抗生素的疗效逐渐受到挑战。

在20世纪40~50年代，青霉素类与β-内酰胺类抗生素得到了广泛应用，青霉素、氨苄西林、阿莫西林、头孢菌素等是其中最具代表性的药物[24]。该类药物主要通过抑制细菌的细胞壁合成，使其破裂死亡。最早用于治疗单一细菌感染，如金黄色葡萄球菌引起的感染。但其有着明显的局限性，随着β-内酰胺酶的广泛传播，许多细菌获得了耐药性。此外，这类药物对混合生物膜感染中的厌氧菌和某些革兰阴性菌作用有限。

在20世纪50~60年代，氨基糖苷类抗生素开始被应用起来，代表药物由庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星等。这类药物主要通过与细菌核糖体30S亚基结合，抑制蛋白质合成。首先被用于治疗铜绿假单胞菌等革兰阴性菌感染。但后来发现由于生物膜的屏障作用，氨基糖苷类抗生素难以穿透EPS，使药物浓度难以达到有效水平[25]。此外，许多细菌通过外排泵机制耐受这类抗生素，使这类药物也无法取得理想的治疗效果。

20世纪60~70年代，大环内酯类抗生素被发现，代表药物有红霉素、克拉霉素、阿奇霉素等。主要通过抑制细菌核糖体50S亚基，干扰蛋白质合成。被用于治疗如肺炎链球菌等引起的呼吸道感染，在混合生物膜感染中对某些细菌也具有一定效果。但其也有明显的局限性，对厌氧菌和部分耐药菌株作用有限，同时在混合生物膜环境中，由于药物扩散受限，导致疗效下降[26]。

喹诺酮类抗生素说是在80~90年代发现的，代表药物有环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星等。这类药物主要作用机制丧失抑制DNA旋转酶和拓扑异构酶IV，阻止DNA复制来抑制细菌的繁殖。其作为广谱抗菌药物，尤其对铜绿假单胞菌、革兰阴性菌等效果较好，曾被广泛用于生物膜相关感染，但是容易诱导耐药突变，导致治疗失败[27]。

在21世纪初，由于单一抗生素对混合生物膜的治疗效果不佳，临床上尝试联合抗生素治疗，产生来复方抗生素疗法[28]。如β-内酰胺类 + 氨基糖苷类、喹诺酮类 + 大环内酯类以及抗真菌药物 + 抗生素等。

然而，联合用药仍然存在多个问题，药物的穿透性仍然受生物膜屏障限制。微生物之间的相互作用可能降低某些抗生素的有效性(如铜绿假单胞菌的QS系统可以抑制某些抗生素的作用)。耐药基因在生物膜内更容易交换，可能加速耐药性的产生[29]。这些都会降低药物治疗的作用。

传统抗生素虽然在混合生物膜感染的治疗中发挥了一定作用，但其受到药物穿透性差、持留菌耐受、微生物互相保护、耐药基因传播等问题的严重影响，疗效被严重限制。因此，亟需开发新型抗生素、纳米递送系统、生物膜靶向疗法、噬菌体疗法等新型疗法，以克服混合生物膜感染的治疗难题。

6. 混合生物膜感染未来治疗方式的探索

近年来，研究者们致力于探索新型策略，以提高抗生素在混合生物膜感染治疗中的有效性。纳米技术与抗菌肽的结合是一个新的途径。

纳米技术可以递送抗生素，将抗菌肽与纳米载体结合，可以增强其在生物膜中的穿透性和稳定性[30]。这种策略有望克服生物膜对抗生素的屏障作用，提高治疗效果。抗菌水凝胶作为局部治疗剂，也能够持续释放抗生素，直接作用于感染部位，如负载庆大霉素的双交联水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出持久的抗菌活性，有效消除伤口中的细菌，并显著加速伤口愈合[31]。金属有机框架材料(MOFs)作为新型抗菌材料，具有高比表面积和可调节的孔径结构，也可用于负载和释放抗生素[32]。研究表明，MOFs在细菌感染治疗方面展现出巨大的潜力，能够有效对抗耐药菌株。随着耐药菌的增加，噬菌体疗法同样受到广泛关注。噬菌体可特异性裂解细菌，联合抗生素使用，有望增强治疗效果，减缓耐药性的产生[33]。微纳米机器人能够自主运动，携带抗生素直达感染部位，提高药物递送效率[34]。这种技术在增强抗菌治疗方面展现出潜力，可能为未来的感染治疗提供新的思路。抗生素骨水泥作为局部抗感染材料，能够在感染部位释放高浓度抗生素，破坏细菌生物膜，促进创面愈合，减少手术次数和住院时间[35]。

在治疗混合生物膜感染时，联合用药策略具有良好的前景，联合使用多种抗生素可以增强疗效。如在以金黄色葡萄球菌为主的生物膜中，联合头孢类药物和克拉霉素能够破坏生物膜，进而杀灭细菌。负压引流技术通过改善创面微环境，促进血液循环，有助于抑制生物膜的形成，增强抗生素的疗效，促进感染创面的愈合[36]。研究者们正在开发新型抗菌材料，如具有抗菌和骨再生双重功能的多组分介孔二氧化硅纳米系统[37]。这种纳米系统结合了抗生素和抗菌金属离子，显著提高了抗生物膜效果，并促进骨组织再生。

由于生物膜的复杂结构和耐药特性，许多研究者正在探索靶向生物膜的抗生素修饰策略，以提高药物的递送效率和抗菌活性。

通过纳米颗粒包裹或修饰抗生素，可以增强药物的渗透性。研究表明，聚乙二醇修饰的纳米抗生素可以有效穿透铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的混合生物膜，提高抗菌效果[38]。某些表面活性剂或穿膜肽可用于修饰抗生素，使其更容易穿透生物膜[39]。还可以利用光敏剂联合抗生素进行治疗，以在特定波长光照射下产生活性氧，可以在光照条件下有效破坏多种细菌的生物膜结构，提高抗菌活性，增强抗菌效果[40]。

基因编辑技术，如CRISPR-Cas9等，近年来也被广泛研究用于抗菌领域，尤其是针对耐药性基因的抑制[41]。研究者们设计了靶向耐药基因(如bla、mecA、ermB)的CRISPR载体，可有效切割耐药基因，从而恢复细菌对抗生素的敏感性[42]。如靶向mecA基因的CRISPR-Cas9系统可使MRSA对β-内酰胺类抗生素重新产生敏感性[42]。CRISPR干扰(CRISPRi)技术可用于抑制生物膜形成相关基因，如生物膜信号分子合成、生物膜多糖合成等，减少生物膜的形成，提高抗生素的治疗效果[42]。细菌通过QS机制调控生物膜的形成、毒力因子表达和耐药性，因此，QS抑制剂的开发也成为抗生物膜感染的新策略[43]。自然界有一些天然存在的QS抑制剂，如大蒜素、黄酮类化合物及茶多酚等天然产物可以抑制QS信号传导，减少细菌生物膜的形成，提高抗生素的疗效[44]。近年来，也出现了一些人工合成的QS抑制剂。如AHL类似物(如N-酰基高丝氨酸内酯衍生物)可与QS信号竞争性结合，干扰细菌通讯，提高抗生素的杀菌效果[45]。

细菌的代谢状态对抗生素的敏感性有重要影响，因此，对细菌进行代谢干预也成为近年来研究的热点。代谢激活剂可以提高抗生素敏感性，研究发现补充葡萄糖、果糖、柠檬酸等代谢底物可以激活细菌的代谢，使其从耐药状态转变为易感状态，从而提高抗生素的杀菌效果[46]。如葡萄糖补充可激活大肠杆菌的能量代谢，使其对β-内酰胺类抗生素更加敏感。

扰乱铁的代谢也是一种改变代谢状态的策略。多种螯合剂，如EDTA、槲皮素等可以影响细菌的铁代谢，从而增强抗生素的作用[47]。铁载体抗生素可通过细菌的铁摄取系统进入细胞，提高杀菌效率。

尽管针对混合生物膜感染的抗生素治疗研究取得了显著进展，但仍然面临一些挑战。混合生物膜存在异质性并且膜由不同细菌组成，具有复杂的代谢和耐药性，使单一抗生素疗法难以奏效，未来需要进一步解析不同菌种间的相互作用，并针对特定微生物群体设计个性化治疗策略。目前的许多研究仍然依赖于传统抗生素，如何在控制耐药性增加的同时提高抗菌效果，仍是一个重要课题。需要开发精准抗菌策略，如基因编辑、靶向治疗、联合用药等，减少耐药性的发展。由于传统抗生素疗效下降，未来的研究方向可以往开发新型抗菌肽，提高对耐药菌的杀灭能力的方向靠拢，也可以探索新型噬菌体疗法，作为抗生素的替代策略；基因编辑 + 纳米技术也是一个有良好前景的方向，其可以增强抗生素的递送和作用靶向性。

许多新型抗生素递送系统、基因编辑疗法、噬菌体疗法仍处于实验室研究阶段，如何将其安全有效地转化为临床应用，需要进一步的研究和验证。未来需要更多的临床试验，以评估新型抗生素治疗方案的安全性、有效性和稳定性。

7. 讨论

混合生物膜感染因其复杂性和耐药性，给临床治疗带来了巨大挑战。近年来，通过纳米技术、基因编辑、光动力治疗、群体感应抑制、代谢干预等策略，研究者们不断探索新的抗生素治疗方案。这些进展不仅有助于提高抗生素的治疗效果，也为耐药细菌感染的控制提供了新的思路。未来，多学科交叉，如纳米技术 + 基因编辑 + 生物信息学的结合将推动抗生素治疗的创新，进一步提高混合生物膜感染的治愈率。综上所述，针对混合生物膜感染的治疗，研究者们正积极探索多种新型策略，包括纳米技术、抗菌水凝胶、MOFs、噬菌体疗法、微纳米机器人、抗生素骨水泥、联合用药、负压引流、新型抗菌材料以及临床指导原则的制定等。这些研究进展为提高抗生素在混合生物膜感染治疗中的有效性提供了新的思路和方法。

基金项目

重庆市科卫联合医学科研项目(2020MSXM005)。

NOTES

^*通讯作者。