用于活细胞成像的超分辨光学显微镜方法与应用

Super-Resolution Optical Microscopy for Live-Cell Imaging: Methods and Applications

摘要: 细胞是生命体活动的基本单元，对活细胞的实时观测有助于在更接近生理的条件下观察其细微结构及其动力学过程，理解生命的本质。近三十年，超分辨光学显微成像技术(Super-Resolution Microscopy, SRM)和相关技术的发展，允许人们在突破衍射极限的尺度下对活细胞进行观察与研究，然而这些技术早期应用于活细胞成像领域时遭受到了不同程度的挑战，而随着后续荧光染料等相关技术的发展，SRM在活细胞成像领域的应用愈加广泛。本文通过简要介绍目前常见的几种SRM以及近些年受到广泛关注的最小光子通量(MINFLUX)等显微技术的基本原理和特点，梳理了其在活细胞成像领域的最新应用。

Abstract: As the fundamental unit of life activities, the real-time observation of live cells facilitates the investigation of their intricate structures and dynamic processes under conditions closer to physiological states, thereby advancing our understanding of life’s essence. Over the past three decades, advancements in super-resolution microscopy (SRM) and related technologies have enabled the observation and study of live cells at scales surpassing the diffraction limit. However, the initial application of these techniques in live-cell imaging faced significant challenges. With subsequent advancements in fluorescent dyes and other ancillary technologies, SRM has become increasingly applied in live-cell imaging. This review provides a concise introduction to the principles and characteristics of several widely used SRM techniques, as well as emerging methodologies such as minimal photon flux (MINFLUX) microscopy, which has garnered substantial attention in recent years. Additionally, we summarize their latest applications and breakthroughs in the field of live-cell imaging.

1. 引言

细胞作为生命体的基本结构与功能单元，其内部精细结构、分子间相互作用及动态调控机制的研究是揭示生命本质规律的关键。在探索细胞功能的过程中，生物学家力求观察那些使细胞维持稳态并对外部和内部信号做出动态响应的过程，这些过程不仅涉及分子水平的精确调控，还包括在完整活细胞环境下的复杂相互作用网络[1]。

光学显微镜及其与荧光标记相结合的多种荧光显微成像技术，已成为现代细胞生物学研究的重要工具。然而，由于光学系统衍射极限的存在，传统光学显微镜的分辨能力通常被限制在探测光波长的一半左右(约200~300纳米)，这使得它们对于生物体的纳米结构域难以提供清晰的视图。尽管可以使用电子显微镜(Electron Microscopy, EM)获得纳米分辨率的结构图像，但其严苛的样品制备要求(包括固定、脱水、包埋等处理)以及电子辐照的侵入性特性阻碍了对活细胞的动态成像。相比之下，光学显微成像技术凭借其非侵入性和实时观测优势，在活细胞研究领域展现出独特价值。

近年来，超分辨显微成像技术(Super-Resolution Microscopy, SRM)的快速发展，不仅保留了传统光学显微的无损观测特性，更成功突破了衍射极限的束缚，实现了纳米尺度的活细胞成像。如2014年诺贝尔化学奖得主S. W. Hell团队在2017发表的MINFLUX显微技术已经将光学显微分辨率提升至接近1纳米的水平[2]。SRM的发展显著增强了研究者对细胞内部精细结构和动态过程的解析能力，为生命科学研究提供了新的视角，对于推动生命科学和生物医学研究具有重要意义。

实时成像的四个主要考虑因素为样本健康、对比度、空间分辨率和时间分辨率。对比度、空间分辨率和时间分辨率是相互依存的——任何单一因素的改变都会影响其他两个因素。这些参数的优化通常需要伴随着光照强度的增加，而光剂量的增加可能导致样本受到光毒性损伤等潜在风险[3]，影响细胞存活率和体内的ROS (Reactive Oxygen Species，氧代谢的天然副产物，参与细胞内的信号传递和调节，并且在细胞周期、基因表达和机体内环境稳态的维持中发挥着重要作用)水平。如何平衡多个因素更好地获取所需实时成像图像成为SRM的重要研究方向。

目前的SRM主要分为三大主流技术：第一类是基于空间频率调制原理，代表技术是超分辨结构光照明显微术(Super-resolution Structured Illumination Microscopy, SR-SIM)；第二类是基于点扩散函数(Point Spread Function, PSF)调制原理，代表技术是受激辐射损耗(stimulated emission depletion, STED)显微术；第三类是基于单分子定位原理，代表技术是光激活定位显微(Photo-Activation Localization Microscopy, PALM)和随机光学重建显微(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM)，以及由此衍生的最小光子通量(MINFLUX)显微术。本文将阐述这几种主流技术的基本原理和特点及其在活细胞成像中的应用进展，并对SRM技术的发展趋势及其在生命科学研究中的应用前景进行展望。

2. 超分辨结构光照明显微术(SIM)

2.1. 基本原理与特点

显微成像系统的成像过程本质上是待测物体与该光学系统点扩散函数(PSF)的卷积运算。从频域角度来看，PSF相当于一个低通滤波器，仅允许低频信息通过，而抑制了高频信息。然而，由于样品在频域空间中的信息分布是无限延伸的，传统显微成像系统难以有效采集样品中的高频信息成分，这与研究者期望通过显微观测获取样品精细结构(即高频成分)的研究目标相矛盾。然而，通过利用莫尔条纹(Moiré fringe)的概念能够使我们巧妙地绕过这一限制。当两个具有略微不同频率f₀和f₁的周期性图案发生叠加时，会产生一个频率低于任何一个原始图案的莫尔条纹图案[4] [5]。相反的，当已知其中一个图案时，可以通过莫尔条纹图案代数地解算出另一个图案。这一特性使得研究者能够将样品的高频结构信息通过莫尔条纹效应转移到低频区域，从而被物镜有效采集。

2.2. 在活细胞成像中的发展与应用

结构光照明显微技术(SIM)在活细胞成像中展现出显著优势。通常，SIM只需要拍摄9张(2D-SIM)或15张(3D-SIM)具有不同相位和旋转角度的结构化照明的宽场图像即可重建出一张超分辨图像[9] [10]，与大多数其他基于激光束扫描或单分子定位的超分辨率技术相比，采集时间更短，这意味着相对更高的时间分辨率，此外，SIM较低的激发光强[11] (1~ 10 W/cm²)以及与通用荧光标记方案的兼容性，使其成为三类主要超分辨显微技术中最适合活细胞成像的方法，也是目前应用最广泛的超分辨成像技术之一[12]。

尽管SIM早期版本由于成像原理的限制，只能将横向分辨率提高至传统荧光显微镜的2倍(约为100 nm) [13]。但为了追求更高的时空分辨率，研究者通过多种技术改进显著提升了其性能。例如，通过使用空间光调制器(SLM)或数字微镜(DMD)实现照明模式的高速切换，提高图像采集速率，采用非线性结构光照明技术[14]以及开发多种图像重建算法[4]。此外深度学习的应用提升了SIM的成像速度，进而降低了光损伤，同时也能够进一步提升分辨率。例如，2021年，Qiao等人[15] [16]基于GAN网络架构，建立了一种通道注意力网络(caGAN)进行3D-SIM重建，在重建图像分辨率不受影响的情况下，将所需重建图像数目降低到传统SIM的1/7.5，总光子数降低到1/15。2023年，Wang等人[17]将物理反演模型与总深度变分(Total Deep Variation, TDV)正则化相结合，提出一种混合复原方法(TDV-SIM)，用深度学习的方法抑制了SIM在处理低信噪比图片时产生的伪影。这些技术的进步不仅提高了SIM的空间分辨率，还显著提升了成像速度，降低了光毒性，使其在活细胞成像领域更具竞争力。

3. 受激发射损耗显微术(STED)

3.1. 基本原理与特点

3.2 在活细胞成像中的发展与应用

为提升STED显微术在活细胞成像中的适用性，研究者主要从硬件优化、算法改进和荧光探针开发三个方向进行技术革新，并产生了诸多变体。在硬件和算法层面中，比较重要的一项是2017年Stefan W. Hell团队展示了一种基于自适应照明的新型STED显微镜(Dynamic Intensity Minimum STED, DyMIN STED) [26]，其核心为根据激光扫描位置的局部结构特征动态调整STED损耗光的强度和驻留时间：当STED损耗接近和远离荧光分子时，根据两者距离同步增大或减小对应的STED损耗光功率，以所需的分辨率进行成像，减少过量的光子对荧光分子造成光漂白和对活细胞造成的光损伤。在常见的生物成像条件下，DyMIN-STED可将扫描区域上的STED光剂量降低多达∼20倍，对于较稀疏的2D和3D样品，可降低多达100倍，并可实现约30 nm的高分辨率成像。此外，深度学习算法对于STED的发展起到了重要作用。2020年，年伦斯勒理工大学的Li [27]等人使用深度对抗网络(DAN-based)，对较低分辨率图像使用物理建模进行计算，并输出对应的高分辨率图像，可将60 nm分辨率的STED图像提升至30 nm。2023年，美国Ebrahimi等人[28]将多阶段渐进图像恢复(MPRNet)的方法用于STED中，并结合基于U-Net和残差通道注意力网络(RCAN)架构将样品的曝光时间减小到原来的3.125%，成像速度大幅提升。

相比于从硬件和算法本身优化STED，新型荧光探针的开发对推动STED的活细胞成像适配则更为直接，是超分辨成像研究领域的热点方向[12]。当前用于STED活细胞成像的荧光探针主要分为有机荧光染料、荧光蛋白以及荧光纳米探针[29]。有机荧光染料具有较好的光稳定性和生物兼容性，但目前的有机荧光染料种类还较少，大多靶向线粒体；荧光蛋白作为一种可通过基因编码和靶向蛋白一起表达的荧光探针，不需额外标记，在活细胞成像领域应用愈加广泛，但其较差的光漂白能力使之很难用于长时程活细胞成像；荧光纳米探针出色的光稳定性和较小的受激辐射功率使其具有独特的优势，但特异性差的缺陷限制了其广泛应用。不同荧光探针的共同发展促进了STED在活细胞成像中的应用。2013年Gražvydas Lukinavičius团队开发的硅罗丹明(Silicon-Rhodamine, SiR)染料具有里程碑意义[30]。它是第一个可以用于STED超分辨成像，且具有发光明亮、光稳定性好和细胞膜透过性高的荧光染料[29]。2016年，Francesca Bottanelli团队开发了基于SiR和ATTO590的Halo/SNAP双色标记系统，成功实现了线粒体、内质网等细胞器的STED活细胞成像，并以2秒时间分辨率连续采集长达3分钟[31]。2019年，Chenguang Wang团队报道了具有长荧光寿命的MitoPB Yellow探针，首次通过STED在60 nm分辨率下观察到活细胞线粒体嵴的超微结构[29] [32]。2020年，Xusan Yang团队开发的Mito ESq-635探针实现了HeLa细胞线粒体内膜35.2 nm分辨率、50分钟的延时成像，清晰捕捉了线粒体融合和裂变过程中嵴的动态变化[33]。2022年，Tianyan Liu等人报道了一种与STED兼容的线粒体内膜荧光标志物PK Mito Orange (PKMO)，其特点是延时成像的光毒性显著降低，还与绿色和远红外荧光团兼容[34]。如图4所示，该团队利用PKMO实现了HeLa和COS-7细胞中线粒体多个结构的多色STED成像，包括线粒体内膜(IM)与线粒体DNA (mtDNA)、外膜(OM)、嵴连接(CJs)、内质网(ER)的双色成像，以及IM与细胞微管、mtDNA的三色成像，充分展示了PKMO在多色STED活细胞成像中的应用潜力。

4 单分子定位显微术(SMLM)

4.1 基本原理与典型代表

要分辨两个距离小于衍射极限的发光分子有种很巧妙的方式——从时间上分开。获得这种时间分离最常见的方法是利用荧光分子的光开关特性：如图5所示，荧光分子可在发光态(“开”态)和非发光态(“关”态)之间可逆转换(闪烁)。通过精确控制激光照射或调节化学环境保证荧光分子的闪烁以及调控闪烁的速率[35]，确保同一时间内仅有个别分子处于发光状态，便可通过质心定位算法和高斯拟合方法[36]等算法确定单个荧光分子的精确位置，最后，叠加所有获得的单分子位置从而获得一幅超分辨图像，这就是单分子定位的核心构思。

这一技术的典型代表是Xiaowei Zhuang团队于2006年提出的随机光学重建显微镜(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM) [37]和Eric Betzig等人在同年展示的光激活定位显微镜(photoactivated Localization Microscopy, PALM) [38]，并使超分辨成像进入横向分辨率20 nm，纵向分辨率50 nm时代。两项技术的基本原理相似，主要区别在于PALM技术利用荧光蛋白(Photo Activated Green Fluorescent Protein, PA-GFP)的光激活效应实现开关，而STORM技术利用荧光探针(花菁类荧光染料对，Cy3~Cy5)和免疫荧光技术进行标记，PALM技术通过细胞自身表达荧光蛋白的方式进行成像，因此更适合用于活细胞内蛋白的超分辨成像[12]。

Figure 5. Schematic diagram illustrating the imaging principle of SMLM

图5. SMLM的成像原理图

Figure 6. Localization principle and application modes of MINFLUX [40]

图6. MINFLUX的定位原理及应用模式[40]

值得注意的是，2017 Hell团队发布的最低光子通量显微术(Minimal Photon Fluxes, MINFLUX)将光学显微分辨率推进至约1 nm水平[2]，成为SMLM的新型代表。如图6所示，MINFLUX虽然与STORM和PALM一样利用荧光团的随机开关特性实现单分子稀疏成像，但其定位原理与传统方法有本质区别。不同于流行的质心定位，MINFLUX采用了类似于STED的环形光斑，但其功能不在于损耗，而是激发。理想情况下，当环形激发光束的中心零点精确地对准荧光分子，那么点探测器将不会检测到光子；当环形激发光束的中心零点接近单个荧光分子位置时，二者距离越近(激发光强越低)，收集到的光子数就越少，产生的荧光不仅体现了荧光强度信息，还携带了有关单个分子与激光光束中心相对位置的信息[2]。实际上，荧光可以看作是分子位置与零点位置不匹配所要付出的代价，这也意味着错配越小，定位所需的荧光光子就越少，这种定位方式以较少的光子数就可以获得极高的定位精度，有效降低了样品的光漂白效应[39]，在活细胞成像领域展现出显著优势。

4.2. 在活细胞成像中的发展与应用

SMLM逐帧稀疏信号累积的成像策略以及早期的质心定位等方式使之存在着时间分辨率低和强光毒性等问题，开发更快的成像算法以及荧光探针，结合新型的定位方式能提高SMLM在活细胞成像中的应用价值。

算法方面，早期常见的定位算法包括质心法[41]、高斯拟合[36]、最大似然估计[42]等，然而这些方法主要用于处理低分子密度的图像，时间分辨率低，适用于高分子密度的定位算法可以缓解这一限制。2012年，Zhu等人[43]开发的压缩感知定位算法允许活化的荧光团密度比传统的单分子拟合方法所能处理的密度高一个数量级，并对果蝇活细胞中的微管蛋白实现了3 s (169帧)的动态成像。近年来，深度学习的发展也将SMLM的发展带到了一个新高度。2018年，Nehme等人[44]提出了DeepSTORM算法，算法首次将深度学习引入单分子定位领域，以10 Hz的频率在50秒内同时追踪了活小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中48个分散的端粒，为研究其动态行为提供了新视角。此外，Thunder STORM [45]、DECODE [46]、ANNA-PALM [47]等算法的不断发展，进一步提升了SMLM在活细胞成像中的适用性。

荧光探针方面，同前面提到的一样，也分为有机荧光染料、荧光蛋白以及荧光纳米探针，但基于成像原理的不同，SMLM所需的荧光探针对闪烁性，占空比以及循环次数等有额外的要求。早期使用的花菁类荧光染料Cy5与Cy3和Alexa 647等存在着易光漂白，依赖具有细胞毒性的巯基缓冲液(如β-巯基乙醇、MEA)以及膜穿透性差，需要固定后透膜处理(如Triton X-100)的缺陷，不利于活细胞成像。因此，新型荧光探针的开发对于SMLM在活细胞成像中的应用起着至为关键的作用，也是当前领域研究的热点问题。2009年，Heilemann等人[48]使用ATTO655荧光探针代替外源性巯基化合物，对人肺癌活细胞(A549)中的RNA进行了长达500 s的动态成像。2013年，Gražvydas等人[30]开发了硅基罗丹明(SiR)探针，可使用不同的标记技术特异性偶联到蛋白质上，如SiR-SNAP、SiR-CLIP和SiR-Halo等，并对活细胞组蛋白实现了3分钟的动态成像。此外，一些基于荧光探针的新型标记方法也推动了SMLM的发展。2014年，Ralf Jungmann等人[49]提出了DNA-PAINT，通过固定链(标记目标蛋白的DNA单链)和成像链(带有荧光分子的DNA互补链)的随机结合产生荧光以满足SMLM的稀疏性，实现了固定细胞的超分辨成像。2023年，该团队[50]进一步开发了基于双色DNA-PAINT的单粒子跟踪技术(DNA-PAINT-SPT)，对活细胞膜中蛋白质FKBP进行数分钟的稳定追踪。DNA-PAINT-SPT使用Cy3B标记的成像链(扩散常数0.093 ± 0.017 μm²/s)，不仅能在长时间(>6分钟)内保持可观察分子的数量不变(>85%)，还能增加单个轨迹的持续时间(Cy3B-DNA-PAINT-SPT：τ_1/2 = 31 ± 13 s；Cy3B-单染料：τ_1/2 = 17 ± 3 s)，这种方式比传统单染标记仅能实现的几秒相互作用追踪时间有了显著提高。

5. 总结与展望

随着超分辨光学显微技术(SRM)的快速发展，生命科学研究已迈入纳米尺度动态观测的新时代。本文回顾了结构光照明显微术(SIM)、受激发射损耗显微术(STED)、单分子定位显微术(SMLM)以及近些年受到广泛关注的最小光子通量(MINFLUX)的基本原理与在活细胞成像领域中的发展和应用，揭示了这些技术在突破衍射极限、解析生物纳米结构域动态变化的独特优势。它们的互补性特征为研究者提供了多样化的选择：SIM凭借高时间分辨率和低光毒性成为亚百纳米尺度像的首选，但较低的空间分辨率限制了其在更小尺度研究中的应用；STED虽然具有较高的空间和时间分辨率以及对荧光探针的高兼容性，但高光毒性成为了STED活细胞成像的阻碍；SMLM凭借最为出色的空间分辨率成为了亚纳米尺度活细胞成像的强有力工具，而早期低时间分辨率和高光毒性的缺陷也通过开发合适的荧光探针以及改进成像策略进而逐渐克服，MINFLUX作为SMLM中的新型代表，也在不断冲击着超分辨荧光显微镜在实际生物研究中的观测极限。

当前，荧光探针的开发以及成像模式的改进推动着SRM往更高的时空分辨率发展，并更好地适配活细胞成像，为人类揭示生命本质规律、攻克疾病难题提供了前所未有的微观利器。

未来，SRM无疑将继续扮演重要角色，推动更多的基础研究向临床转化，为人类的健康科学发展开拓新视野。