鲍曼不动杆菌疫苗研究新进展

New Progress of Research on Vaccines against Acinetobacter baumannii

摘要: 鲍曼不动杆菌是引起医院获得性感染的重要机会致病菌之一，随着多重耐药及广泛耐药菌的不断出现，其临床治疗面临严峻挑战。近年来，国内外学者对鲍曼不动杆菌疫苗的研制进行了不少探索，为其免疫治疗提供了新的思路。本文通过总结鲍曼不动杆菌灭活全菌体疫苗、外膜囊泡疫苗、重组蛋白亚单位疫苗、荚膜多糖疫苗、DNA疫苗及疫苗佐剂的最新研制成果，对鲍曼不动杆菌抗菌疫苗现状做阐述、分析及前景展望。

Abstract: Acinetobacter baumannii (AB) is one of the main opportunistic pathogens causing nosocomial infection. With the rapid emergence of multi-drug and pan-drug resistant strains, its clinical treatment encounters significant challenges. Numerous scholars try to explore and develop vaccine in control of AB infection, including inactived whole cell vaccine, out membrane vesicles vaccine, recombinant protein subunit vaccine, capsular polysaccharide candidate vaccine, DNA vaccine and adjuvant. In this paper, the current situation of various vaccines for AB is reviewed, so as to elaborate on the prospects of their development.

1. 引言

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii, AB)是一种自然界广泛存在的机会致病菌，主要导致医院内感染，如肺炎、脑膜炎、菌血症和软组织感染，常见于重症监护病房(ICU) [1]。2022年发表于《柳叶刀》的一项统计报告[2]称，AB是导致耐药性死亡的主要病原体之一。由于新的抗生素发展缓慢，疫苗研究将为其免疫治疗提供新的思路[3]。近年来，国内外学者关于AB疫苗的研制进行了不少探索，本文就该菌疫苗研究新进展做一综述。

2. 灭活全菌体(Inactivated Whole Cell, IWC)疫苗

IWC疫苗是将培养的AB灭活后，保留具有抗原性的菌体作为其主要成分，灭活方式主要有化学固定、加热、辐射、暴露于抗生素中等。既往研究[4]证实锰–十肽–磷酸(MDP)复合物可以特异性保护免疫原性表位，2021年Dollery等[5]改进方法，在MDP复合物的作用下对AB培养物进行γ灭活，结果显示该疫苗对免疫小鼠具有高度保护作用(80%~100%)。1年后他们再次对IWC疫苗进行评估[6]，认为利用紫外线C (UVC)辐照是一种更易获得的灭活方法，并进一步评估MDP的保护作用。结果表明，UVC辐照可以在不添加MDP的情况下产生同等高效的IWC疫苗，其体液免疫足以保护中性粒细胞减少的小鼠。因此，基于UVC的疫苗灭活可能是制备Ab-IWC疫苗的可行方法。

除了灭活方法不断改进，疫苗载体和免疫佐剂也逐渐被应用。Khan等[7]利用脂质体包封制备了一种全菌体抗原(Lip-WCAgs)作为疫苗制剂。研究结果表明，Lip-WCAgs对其免疫小鼠不产生任何毒性，但可诱导小鼠产生较强的特异性免疫反应。此外，使用Lip-WCAgs免疫的小鼠的脾细胞可产生更多的IFN-γ和IL-12，对AB全身感染表现出更强的抵抗力、更高的存活率和更低的细菌负荷，且体循环中的炎症标志物水平较低，包括CRP、IL-6、IL-1β和TNF-α。基于脂质体在疫苗研制中的应用，少动鞘氨醇单胞菌中的鞘脂糖(GSLs)也发挥了其相应价值。同年Khan等[8]又利用GSL制备了一种新的脂质体疫苗制剂(GSLs-Lip-WCAgs)。结果表明用GSLs-Lip-WCAgs免疫的小鼠存活率为100%，而用Lip-WCAgs (不含GSLs)免疫的小鼠存活率为60%；用GSLs-Lip-WCAgs免疫的免疫受损小鼠存活率为50%，而用Lip-WCAgs免疫的免疫受损小鼠存活率为20%。此外，它在免疫小鼠中产生更高水平的抗体和细胞因子，特别是IFN-γ水平。

3. 外膜囊泡(Outer Membrane Vesicles, OMV)疫苗

细菌可以从外膜自发地产生囊泡，通常被称为OMV。既往研究[9]证实Ab-OMV可通过激活骨髓树突状细胞促进体液免疫反应，并在AB诱导的脓毒症中发挥保护作用。迄今为止，获得Ab-OMV研究最多的方法是通过超滤和超离心结合从细胞培养上清液中分离，但产量通常很低。Li等[10]开发了制备Ab-OMV疫苗的新方法，他们从AB细胞中提取的SuOMV (蔗糖提取的Ab-OMV)和nOMV (天然Ab-OMV)获得了更高的产量，其中，SuOMV针对AB攻击提供了最有效的保护，而且与肌内疫苗接种相比，鼻内接种Ab-OMV提供了更强大的保护。随后Higham等[11]也证实了鼻内免疫可显著减少气道定植并防止全身细菌播散，由此可见鼻内免疫是提供保护的有效途径，也表明局部免疫在预防AB感染中的重要性。

近年来，新型纳米技术在疫苗配方中的应用日益增加，具有提高稳定性、防止过早降解以及精确输送至细胞靶点等优点[12]。Bjanes等[13]利用Ab-OMV实现金纳米颗粒(AuNPs)的功能化，设计了一种可调节的AB纳米颗粒疫苗(Ab-NP)。结果发现Ab-NP疫苗接种在兔和小鼠中均诱导了强大的IgG抗体反应，其抗血清促进了中性粒细胞对AB的杀伤力，并且与仅接种Ab-OMV和磷酸盐缓冲液(PBS)对照组相比，诱导了B细胞向引流淋巴结募集，增加了树突状细胞活化。最重要的是，在使用高毒力AB菌株的研究中，免疫血清被动免疫和Ab-NP疫苗的主动免疫能强烈保护小鼠免受致死性败血症和肺炎的攻击。因此，作为开发针对AB和其他耐多药革兰阴性细菌病原体的疫苗平台，免疫原性OMV与纳米技术的结合值得进一步探索。

尽管OMV在抗菌领域表现出巨大的潜力，但在临床使用之前，仍然有许多问题需要解决，主要是疫苗的安全性。脂质A是OMV中脂多糖(LPS)的内毒素成分，可以导致宿主产生强烈甚至致命的反应[14]。以往认为LPS是OMV形成所必需的，将LPS纳入OMV是不可避免的。然而，Pulido等[15]首次从缺乏LPS的AB中产生OMV，并且用这些OMV对小鼠进行免疫后结果表明，在AB的攻击下，10 ug的OMV提供了75%的保护，100 ug的OMV提供了100%的保护。因此，减少OMV疫苗中内毒素的含量是可取的。

4. 亚单位疫苗

亚单位疫苗是一种含有病原体活性片段以刺激保护性免疫反应的疫苗，具有高纯度、安全稳定、易于生产和高度靶向诱导免疫反应等优势[16]。许多研究者已经探索了针对AB亚单位疫苗的潜在抗原，其中外膜蛋白(outer membrane protein, Omp)、纤维蛋白和荚膜多糖(capsular polysaccharides, CPS)可以有效地诱导免疫反应，成为最受欢迎的候选物质[17]。此外，在亚单位疫苗的制备中使用佐剂或输送工具可以减缓降解并提高免疫原性，适当的免疫方法还可以增强免疫效果，因此，选择适当的佐剂和免疫方法对亚单位疫苗研究至关重要。

4.1. 蛋白质亚基

4.1.1. OmpA及其重组蛋白

OmpA作为亚单位疫苗候选物，研究广泛，参与了AB黏附、细胞毒性和生物膜形成等过程，在动物模型中具有高度免疫原性[18]。先前的研究[19]已经证实了使用纯化的OmpA进行鼻内接种，可诱导全身及黏膜抗体，从而引起对多重耐药AB (MDRAB)感染的免疫性保护。然而，鉴于这种蛋白质与包括宿主防御在内的环境因素的相互作用，Viale等[20]研究描述了OmpA的大量变异，这些变异集中在可作为抗原决定簇的蛋白质区域，其重组潜力可能会严重限制仅基于单一变体疫苗的有效性。利用此研究提供的分析，通过定向蛋白质进化产生的多价OmpA疫苗是否可以预防由携带不同OmpA变体的AB菌株引起的感染，还有待检验。因此，详细了解抗原的多样性和进化对于有效开发针对MDR细菌病原体的疫苗至关重要。

铁外膜蛋白(BauA)充当铁载体复合物的受体，被认为是针对AB感染较为合适的保护性抗原[21]。Akbari等[22]在研究中选择BauA的三个免疫原性暴露环(5、7和8)，并单独或合并纳入无环C-叶(LCL)，并在AB感染的小鼠败血症模型中评估了此设计结构，结果表明用重组BauA或杂合抗原环7免疫的小鼠对AB感染具有完全保护作用，而其他杂合抗原的保护作用<100%。由于LCL支架没有提供保护，因此可以将观察到的保护作用归因于BauA。因此，BauA也被选为适合参与多抗原组合的重要抗原。

考虑到AB致病性差异，单一抗原只能产生部分保护，随后的研究侧重于选择多抗原的组合或利用多表位来设计疫苗。Tamehri等[23]在研究中，使用BauA和OmpA进行纯化重组，并单独和联合施用于BALB/c小鼠。小鼠血清酶联免疫吸附试验(ELISA)证实了抗体显著增加，特异性血清检测到OmpA、BauA以及含有这些抗原的免疫原性环的构建体，这些抗原具有不同的亲和力。免疫小鼠的脾脏、肝脏和肺部的细菌负荷显著减少，且接受BauA和OmpA组合的组在脾脏和肝脏中的细菌负荷明显低于对照组。因此，该抗原组合可增强对AB感染的免疫保护，且有望应用于AB引起的脓毒血症。

4.1.2. DcaP样蛋白及其重组蛋白

DcaP样蛋白在结构上类似于AB的OmpA，是一种具有β-桶结构的外膜蛋白，在抗生素耐药性和发病机制中发挥作用[24]。Raoufi等[25]发现，在两次致命细菌攻击后，接受DcaP免疫的BAlB/c小鼠1周内的存活率为100%，且ELISA显示，DcaP免疫小鼠在末次免疫的4个月后还可高度稳定地产生抗体，表现出良好的免疫维持。

Fereshteh等[26]将OmpA和DcaP这两个优秀的疫苗靶点相结合，首次全面评估了OmpA + DcaP样蛋白作为潜在疫苗候选物的免疫原性，以及对MDRAB引起的播散性脓毒血症的免疫效果。该研究将OmpA、DcaP样蛋白和OmpA + DcaP样蛋白用明矾佐剂分别注射到三组C57BL/6小鼠体内，结果显示DcaP样蛋白诱导了高水平的特异总IgG，并且在细菌攻击后使免疫小鼠的存活率达到100%。第28天ELISA结果显示，联合用药组特异性总IgG水平最高，DcaP样蛋白次之，这一趋势揭示了两种抗原的协同作用。除此之外，OmpA + DcaP样蛋白在感染期间触发对免疫小鼠脾脏和肺脏的保护，且有效地将中性粒细胞和巨噬细胞募集到感染部位，并诱导与特定抗体相关的补体依赖性细菌裂解。

4.1.3. Omp34及其重组蛋白

Omp34，也称为Omp33-36，通过参与宿主细胞粘附诱导宿主细胞凋亡，且高度保守[27]。Naghipour等[28]研究表明，重组Omp34 (rOmp34)免疫的BAlB/c小鼠模型在致命细菌攻击后IgG滴度显著增加、细菌负荷减少，小鼠脾脏和肝脏中的细菌被完全清除，并且在致命细菌攻击后3到4天，rOmp34免疫的小鼠存活率为100%。

Golestani等[29]从Omp34中选择环3，纳入LCL制备混合抗原，并对小鼠进行免疫实验。结果表明小鼠存活率增加且组织中的细菌负荷减少，因此证实Omp34环3的卓越免疫保护作用，也证明组合抗原策略是一种可行方法。Mirali等[30]在小鼠败血症模型中研究了Omp34和BauA的联合鸡尾酒作为针对AB疫苗的保护性，结果显示免疫小鼠的存活率显著提高。在主动免疫中，单独或联合接受Omp34和BauA的小鼠的存活率为100%，脾脏、肝脏和肺部的细菌负荷均明显下降，且联合免疫两种蛋白的小鼠体内器官细菌负荷下降幅度明显高于单独免疫两种蛋白的小鼠。被动免疫中，联合免疫两种蛋白特异性血清小鼠存活率为85.7%。因此证明Omp34和BauA的组合比Omp34或BauA的保护性更高，也表明了两者作为预防或治疗AB感染的候选疫苗的协同作用。

4.1.4. Omp22及其重组蛋白

OmpK/Omp22是利用AB中OmpK和Omp22这两种免疫抗原，通过重组表达获得的一种融合蛋白。既往研究[31]已经证实，其联合免疫相较于单独免疫对预防AB感染提供了更强大的保护。Yang等[32]通过气管内接种，进一步评估了在该疫苗制备过程中使用黏膜佐剂MF59的免疫反应。研究中分别使用OmpK/Omp22和辅有MF59佐剂的OmpK/Omp22对Balb/c小鼠进行气管内接种。结果显示，与单独接种OmpK/Omp22免疫的小鼠相比，使用辅有MF59佐剂的OmpK/Omp22产生的特异性抗体水平更高，血液和肺组织中的细菌负荷更低，血液炎症细胞因子水平更低，且存活率更高(83.3%)。因此MF59可能被用作AB疫苗的黏膜佐剂。

随着亚单位疫苗在制备过程中免疫佐剂的应用，Du等[33]在疫苗设计中也结合了生物信息学和纳米技术，从而更好地实现抗原递送。聚(乳酸–共–乙二醇)酸(PLGA)可以递送抗原，壳聚糖(CS)增强分子对粘膜表面的渗透，研究将PLGA涂有CS，形成CS-PLGA纳米颗粒，再将Omp22封装在壳聚糖(CS)纳米颗粒中，并对小鼠进行免疫，随后用不同AB菌株进行攻击。结果显示用CS纳米颗粒中Omp22免疫的小鼠的IgG和IFN-γ水平均高于未涂层的Omp22，且免疫存活率显著增加(42%~60%)，其肺部和血液中的细菌负荷受到抑制，对急性致命AB感染产生了有效保护(57.14%~83.3%)。

Sabzi等[34]也评估了多巴胺纳米颗粒(PDANPs)作为鼻内抗原给药的输送工具的有效性。结果显示在rOmp22负载的PDANPs免疫小鼠中，IgG2a/IgG1和IFN-γ水平明显高于对照组，且诱导了对AB感染的有效保护，并在肺组织病理学检测中表现出更正常的结构，证明了PDANPs作为诱导强免疫反应以对抗AB感染的纳米佐剂的潜力。总之，多表位蛋白和纳米技术的结合是一个非常创新的设计方向。

4.1.5. BamA

外膜β-桶状组装蛋白(BamA)是一种Omp组装体，在AB菌株中高度保守。Singh等[35]使用小鼠肺炎模型研究了BamA对毒性多耐药临床分离株的免疫保护作用，结果表明重组BamA (rBamA)在小鼠中引发了高IgG抗体滴度，主动和被动免疫分别保护了80%和60%的小鼠免受致命剂量的AB鼻腔内感染，同时能有效清除小鼠肺部细菌，降低促炎细胞因子(即血清和肺组织匀浆中的TNF-α、IL-6和IL-1β)水平，且IL-10水平的增加和肺部中性粒细胞的减少有助于感染的控制。

Vieira等[36]利用rBamA免疫小鼠产生高抗体滴度，引发对天然AB-BamA的抗体识别，证明rBamA抗体可为小鼠提供针对AB感染的保护性反应。在AB攻击后，免疫小鼠存活率提高了40%，肾脏中细菌清除率也更高。然而，使用rBamA免疫应答并非完全针对AB，其对肠道微生物群也产生了影响，但不具有特异性。虽然针对各种病原体的广谱疫苗是一种极具吸引力的策略，但对人类正常微生物群的影响是不可取的。

4.1.6. OmpW

OmpW是一种鲜为人知的AB抗原，其表位功能尚未得到充分认知，具有潜在的免疫原性[37]。Abdollahi等[38]对OmpW2进行了免疫原性分析，在其序列结构中检测到暴露表位，并根据这些表位生成亚单位候选疫苗。ELISA结果显示，用OmpW2全蛋白或其亚基片段加强免疫BALB/c小鼠后，IgG滴度显著升高。主动和被动免疫小鼠死亡率及肺脏、肝脏、肾脏、脾脏的细菌负荷均显著降低。因此证实OmpW2全蛋白及其亚基片段可诱导宿主免疫反应，从而有效预防AB感染。未来，更多的研究可以集中在由这些极具前景的免疫原性蛋白组成的组合，以实现更加强大的免疫反应和保护作用。

4.2. 多糖亚基

AB外膜被高分子量荚膜多糖(CPS)包围，这些多糖是在发病机制中发挥重要作用的主要毒力因子[39]。CPS可触发特定的免疫反应，成为开发糖结合疫苗的理想目标[40]。

Rudenko等[41]通过高碘酸盐氧化法合成3种惰性载体蛋白与AB中K9-CPS片段的结合物，诱导血清中产生高水平的抗体(主要是IgG)，该抗体与AB的K9-CPS发生特异性反应，并具有较长的免疫记忆。免疫导致促炎/抗炎淋巴因子和保护性抗体的平衡产生，以确保AB感染小鼠的存活。该多糖缀合物免疫ICR-1小鼠可诱导Th1型适应性免疫应答，免疫BALB/c小鼠可能会增强其吞噬细胞的杀菌能力。其特异性抗体的水平足以提供针对AB感染的保护性免疫，使得该方法适用于疫苗制剂的开发。

Karatovskaya等[42]利用含有K9-CPS片段的糖缀合物制备了一种针对AB的K9-CPS单克隆抗体。单抗能有效结合CPS，检测感染组织中的AB，以保护模型动物免受感染。菌株K9结构在长期观察中保持稳定，在其感染的小鼠肺模型中分析血液和肺部AB存在的结果表明，将抗体引入小鼠尾静脉完全阻止了细菌进入血液，且在整个观察期内，血液中未检出细菌。将Ab-CPS抗体引入动物血液后，肺组织中的细菌负荷量明显减少。在第四次注射后，使用单抗CPS-407导致肺部感染完全消除。由此可见，CPS具有良好的免疫原性，随着耐药菌株的增加，以CPS为靶点的被动免疫可用于治疗耐药菌株的感染，但仍需进一步研究CPS的毒性。

5. DNA疫苗

DNA疫苗是将目的基因克隆至表达载体，在靶细胞内直接表达目的蛋白的新途径。事实证明，DNA疫苗通过将遗传物质直接注入到宿主细胞内提供保护性免疫是有效的。与传统疫苗相比，它们在制备生产、稳定性、安全性和高效力诱导等方面具有潜在的优势[43]。

Ansari等[44]将AB的OmpA基因克隆到真核表达载体中，观察到OmpA在真核细胞模型中得到了显著表达，并研究检测了其在实验小鼠模型中的免疫原性，发现免疫后血清IgM、IgG、IL-2、IL-4、IL-12和INF-γ水平均升高，且在注射致死剂量下，重组载体免疫后小鼠的存活率高于对照组，保护效果为60%。表明OmpA-DNA疫苗可有效地触发体液和细胞免疫反应，尽管还需进一步实验，但结果证实OmpA基因可以被认为是DNA疫苗实验中合适的候选基因。

Pal是一种肽聚糖相关脂蛋白，其C端包含一个类似OmpA的结构域，在外膜完整性中发挥着重要作用[45]。Lei等[46]研究开发了OmpA和Pal两种抗原的双价DNA疫苗，并进一步评估了其免疫原性和保护效果。结果表明，该DNA疫苗对小鼠急性AB感染具有高度免疫保护作用，诱导了高水平的体液免疫应答和Th1/Th2/Th17混合型细胞免疫应答，且通过降低肺组织中的细菌负荷和病理损伤，减少炎症因子表达和炎性细胞浸润，从而保护小鼠免受致死性细菌攻击。因此使用DNA疫苗预防AB感染是可行的，OmpA和Pal均可作为潜在的候选抗原。

构建DNA疫苗的最佳方法之一被认为是基于纳米技术[47]。Hosseinnezhad等[48]选择AB中具有高度免疫原性和保守性的蛋白csuC作为候选抗原，利用生物信息学和免疫学技术预测和定位其最佳表位，并用化学方法制造出DNA疫苗，然后利用CS纳米颗粒(NPs)进行包封，制备CS-DNA纳米颗粒对BALB/c小鼠进行免疫效果评价。结果显示，与非包封DNA疫苗相比，接种CS-DNA疫苗的BALB/c小鼠在血浆中诱发更高水平的特异性IgG，在脾细胞裂解液中诱发更高水平的IFN-γ，且与急性致死性气管内AB感染相比，肺部损伤和血液中的细菌负荷减少，以及显示出显著的免疫力(87.5%)。由此可见，DNA疫苗的开发结合新型纳米技术的应用是有效预防AB感染的新方向。

6. 总结和前景

MDRAB菌株的广泛存在以及缺乏新的抗菌药物，限制了针对该菌的治疗选择，开发有效的疫苗成为迫切需求。尽管十多年来许多研究人员为鉴定和改进AB候选疫苗做出了许多努力，但迄今为止，仍没有批准用于公共或临床试验的候选疫苗。AB疫苗研发的进展受到多项挑战的阻碍[49] [50]：AB毒力因子与发病机制之间的复杂相互作用仍有待完全发现；AB基因组表达具有多样性及不稳定性，包括其广泛耐药和强致病性；日益滥用的抗生素及疫苗选择压力下，新型菌株不断出现等。所以构建抗原覆盖率广、结构完善、产生高效价抗体和免疫保护效应疫苗的任务依然十分艰巨，AB疫苗的批准仍需要进行大量研究和创新。

随着新兴技术蓬勃发展，AB疫苗研制前景是积极且充满希望的。反向疫苗学、泛基因组学、核心基因组学、蛋白质组学、基因修饰和纳米技术、免疫信息学和生物物理分析等，为开发对抗病原体的高效疫苗提供了潜在的突破[51] [52]，AB疫苗研制正在经历前所未有的变革与创新。随着技术的进步、应用领域的扩展、国内外企业的突破以及市场需求的增长，疫苗研制的前景是积极的，未来疫苗的研制将迎来更多的发展机遇。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。