1. 引言
衰老是一个不可逆的过程，发生在细胞、器官和整个生物体水平，导致生理功能中断和生物体内相关退行性疾病的发作[1]。随着时间的推移，生物功能变弱，生物体减轻氧化应激的能力减弱。过量ROS的积累可能导致细胞结构和代谢过程受损[2]，这种损伤通常会导致氧化应激和炎症，随后导致细胞衰老和死亡，从而加速衰老过程[3]。鉴于与年龄相关的退行性疾病患者所承受的经济和心理负担，寻求预防或减轻衰老影响的方法已获得全球关注[4]。
中药罗布麻Apocynum venetum L.为夹竹桃科罗布麻属植物罗布麻的干燥叶，性甘、苦，凉。归肝经。具有平肝安神，清热利水的药理作用，用于治疗肝阳眩晕，心悸失眠，浮肿尿少。现代药理学表明罗布麻也具有抗衰老的功效[5]，但大多聚焦于罗布麻黄酮与罗布麻多糖[6]，少有研究罗布麻蛋白。由于植物蛋白成本更低、健康益处更多、功能特性更好，人们对植物蛋白作为动物蛋白替代品的兴趣一直在迅速增长[7]，罗布麻叶中蛋白含量丰富，含15.24%~19.57% [8]，因此，从罗布麻叶中寻找有生物活性的肽类成分，会极大促进罗布麻的资源利用与开发。
HUVEC细胞源自脐带，易于获取，容易培养，在体外培养生长快速，可以用于研究多种衰老相关的生物学过程和疾病。并且HUVEC细胞在体外培养过程中会表现出衰老特征，如细胞增殖减缓、细胞形态改变、染色质结构紊乱等，因此可以用于研究衰老及相关治疗药物的筛选。本项目通过体外培养HUVEC，初步考察罗布麻蛋白及多肽成分的抗衰老作用，为后期基于其肽类抗衰老成分的开发奠定基础。
2. 实验部分
2.1. 仪器与材料
细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)、酶标仪(美国Biotech公司)、超净工作台(美国Thermo Scientific公司)、倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)、HIS-SIM智能超灵敏超分辨显微镜(广州超视计生物科技有限公司)。
罗布麻(安徽亳州)、胃蛋白酶(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、胰蛋白酶(美国Gibco公司)、D-半乳糖(北京普西唐生物科技有限公司)、30%过氧化氢(南京化学试剂股份有限公司)、MTT (Biosharp公司)、高糖DMEM培养基含双抗(中国凯基生物有限公司)、β-半乳糖苷酶检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)、活性氧检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1) (上海碧云天生物技术有限公司)。
2.2. 实验方法
2.2.1. 罗布麻蛋白多肽部位制备
将干燥的罗布麻叶粉末与纯水按1:20的比例(w/v)混合均匀，用1 mol/L NaOH调节pH至12，在60℃的条件下水浴超声提取2 h，提取完成后，在4℃、5000 r/min的条件下离心20 min，抽滤后得到罗布麻蛋白上清液。用1 mol/L HCl调节pH至4，4℃静置一夜后，在4℃、5000 r/min的条件下离心20 min，过滤上清液后得到罗布麻蛋白沉淀，沉淀加水溶解，用1 mol/L HCl调节pH至2，加入胃蛋白酶(E/S 1:25, W/W)，37℃震荡孵育1 h，随后用1 mol/L NaOH调节pH至7.5，加入胰酶(E/S 1:25, W/W)，37℃震荡孵育1 h，将混合物置于95℃水浴锅中使酶失活，在4℃、5000 r/min的条件下离心20 min [9] [10]，抽滤后冷冻干燥得到罗布麻蛋白多肽样品(LH)。同时制备未经过胃-胰蛋白酶酶解的罗布麻蛋白空白对照(LQ)。
2.2.2. HUVEC细胞培养
HUVEC细胞复苏后接种于含有10% FBS的DMEM高糖培养基中，置于5% CO2、37℃恒温培养箱中培养。
2.2.3. LQ、LH对HUVEC细胞的安全给药浓度筛选
以1.5 × 105个/孔的密度将细胞接种于96孔板中，放入37℃培养箱里培养12 h。培养结束后，加入不同浓度LQ、LH培养24 h，加入MTT溶液培养4 h，在570 nm、650 nm波长处用酶标仪测各孔的吸光值。
2.2.4. H2O2诱导的HUVEC细胞衰老模型的建立
以1.5 × 105个/孔的密度将细胞接种于96孔板中，放入37℃培养箱里培养24 h后加入不同浓度的H2O2溶液(0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、和5 mmol/L)，并放入培养箱中培养4 h，加入MTT溶液继续培养4 h，在570 nm、650 nm波长处用酶标仪测各孔的吸光值。
2.2.5. D-半乳糖诱导的HUVEC细胞衰老模型建立
以1.5 × 105个/孔的密度将细胞接种于96孔板中，放入37℃培养箱里培养12 h后，加入不同浓度的D-半乳糖溶液(20 mg/mL、40 mg/mL、60 mg/mL和80 mg/mL)，放入培养箱中培养36 h，加入MTT溶液继续培养4 h，在570 nm、650 nm波长处用酶标仪测各孔的吸光值。
2.2.6. LQ、LH对H2O2诱导的HUVEC细胞活力测定
分为空白对照组、模型组、模型(H2O2) + LQ组、模型(H2O2)+LH组，给药组在LQ (4 mg/mL)、LH (4 mg/mL)处理24 h后，加入配制好的H2O2溶液培养4 h后加入MTT溶液继续培养4 h，在570 nm、650 nm波长处用酶标仪测各孔的吸光值。
2.2.7. LQ、LH对H2O2诱导的细胞β-半乳糖苷酶水平测定
分组给药方式同2.2.6。用PBS洗涤1次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min。吸出细胞固定液，用PBS洗涤3次，每次5 min。弃PBS，每孔加入1 mL染色工作液，置于37℃生化培养箱孵育过夜后使用普通光学显微镜进行观察。
2.2.8. LQ、LH对H2O2诱导的细胞活性氧(ROS)水平测定
分组给药方式同2.2.6。用无血清培养基洗3遍，取2 mL含DCFH-DA (10 μM)的无血清培养基加入各孔孵育，用胰酶消化细胞转移至黑色96孔板中，立即用荧光酶标仪测量荧光强度。
2.2.9. LQ、LH对H2O2诱导的细胞线粒体膜电位(MMP)水平测定
分组给药方式同2.2.6。PBS洗涤1次，加入500 μL细胞培养液，加入1 mL JC-1染色工作液，37℃孵育20 min后，用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次。加入1 ml细胞培养液，超高分辨荧光显微镜下观察。
2.2.10. LQ、LH对D-半乳糖诱导的细胞活力测定
分别设立对照组、模型组、模型(D-半乳糖) + LQ组、模型(D-半乳糖) + LH组，在D-半乳糖培养12 h后，加入LQ (4 mg/mL)、LH (4 mg/mL)与D-半乳糖共培养24 h，移去培养基，加入MTT孵育4 h后在570 nm、650 nm下检测吸光度。
2.2.11. LQ、LH对D-半乳糖诱导的细胞β-半乳糖苷酶水平测定
分组给药方式同2.2.10。用PBS洗涤1次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液固定15 min，用PBS洗涤3次，每次5 min。每孔加入1 mL染色工作液，置于37℃生化培养箱孵育过夜后使用普通光学显微镜进行观察。
2.2.12. LQ、LH对D-半乳糖诱导的细胞活性氧(ROS)水平测定
分组给药方式同2.2.10。用无血清培养基洗三遍。按照1:1000比例用无血清培养基稀释DCFH-DA，使其最终浓度为10 μM，取2 mL含DCFH-DA (10 μM)的无血清培养基加入各孔，用胰酶将细胞消化下来加至黑色96孔板中，立即用荧光酶标仪测量荧光强度。
2.2.13. LQ、LH对D-半乳糖诱导的细胞线粒体膜电位水平测定
分组给药方式同2.2.10。用PBS洗涤细胞1次，加入500 μL细胞培养液。加入1 mL JC-1染色工作液37℃孵育20 min。孵育结束后，用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次。加入1 ml细胞培养液，超高分辨荧光显微镜下观察。
3. 结果与讨论
3.1. HUVEC细胞衰老模型建立
结果见图1，LQ在4000 μg/mL以内对HUVEC细胞无明显细胞毒性，LH在8000 μg/mL以内对HUVEC细胞无明显细胞毒性，选择4000 μg/mL作为LQ、LH安全给药浓度。H2O2在1000 μmol/L下作用HUVEC细胞4 h，细胞活力在50%左右，40 mg/mL的D-gal作用36 h，HUVEC细胞存活率约为70%，如图1(C)、如图1(D)。
3.2. LQ、LH对H2O2诱导HUVEC细胞存活率的影响
用MTT法检测细胞活力，如图2所示，与空白组相比，模型组可显著降低细胞存活率，与模型组相比，LQ、LH均可以使细胞存活率显著上升。
3.3. LQ、LH对H2O2诱导HUVEC细胞SA-β-gal的影响
如图3所示，与正常组相比，模型组SA-β-gal阳性率显著上升；与模型组相比，经过LQ及LH给药后，可使HUVEC细胞SA-β-gal阳性率下降；与LQ组相比，同浓度下LH组阳性率较少，说明LH对H2O2诱导HUVEC细胞保护作用更好。
Figure 1. Establishment of the HUVEC aging model. (A) Effect of LQ on HUVEC cell viability (B) Effect of LH on HUVEC cell viability (C) Effect of H2O2 on HUVEC cell viability (D) Effect of D-galactose on HUVEC cell viability
图1. HUVEC衰老模型的建立。(A) LQ对HUVEC细胞活力的影响 (B) LH对HUVEC细胞活力的影响 (C) H2O2对HUVEC细胞活力的影响 (D) D-半乳糖对HUVEC细胞活力的影响
Figure 2. Effects of LQ and LH on the viability of H2O2-induced HUVEC cells
图2. LQ、LH对H2O2诱导HUVEC细胞存活率的影响
Figure 3. Effects of LQ and LH on SA-β-gal induced by H2O2 in HUVEC cells
图3. LQ、LH对H2O2诱导HUVEC细胞SA-β-gal的影响
如表1所示，与正常组相比，模型组SA-β-gal细胞蓝染数显著上升；与模型组相比，经过LQ及LH给药后，可使HUVEC细胞SA-β-gal蓝染数下降。
Table 1. Effects of LQ and LH on SA-β-gal induced by H2O2 in HUVEC cells
表1. LQ、LH对H2O2诱导HUVEC细胞SA-β-gal的影响
Group |
Positive rate of β-galactosidase staining (%) |
Control |
1.58 ± 1.47 |
Model (H2O2) |
8.58 ± 4.02### |
LQ |
22.50 ± 3.90*** |
LH |
20.58 ± 3.76*** |
###代表模型组蓝染数量与空白组相比有显著差异，***代表给药组蓝染数量与模型组相比有显著差异。
3.4. LQ、LH对H2O2诱导HUVEC细胞活性氧ROS的影响
如图4所示，与正常组相比，模型组ROS荧光强度显著升高；与模型组相比，LQ、LH组HUVEC细胞内ROS荧光强度均显著降低。LH组ROS荧光强度比LQ组更弱，说明LH组能够显著降低H2O2诱导的细胞过氧化损伤，从而达到对细胞氧化损伤的保护作用。
Figure 4. Effects of LQ and LH on ROS in H2O2-induced HUVEC cells
图4. LQ、LH对H2O2诱导HUVEC细胞ROS的影响
3.5. LQ、LH对H2O2诱导HUVEC细胞线粒体膜电位MMP的影响
由图5可知，对照组HUVEC细胞红色荧光/绿色荧光比值较高，H2O2组红色荧光/绿色荧光比值降低，H2O2 + LQ、H2O2 + LH组HUVEC细胞红色荧光相对于模型组增强，红色荧光/绿色荧光比值显著提高，同等剂量下，LH组红色荧光/绿色荧光比值比LQ组高，提示LH组保护线粒体膜电位效果优于LQ组。
Figure 5. Effects of LQ and LH on the mitochondrial membrane potential induced by H2O2 in HUVEC cells
图5. LQ、LH对H2O2诱导HUVEC细胞线粒体膜电位的影响
3.6. LQ、LH对D-半乳糖诱导HUVEC细胞存活率的影响
如图6所示，与空白组相比，模型组可显著降低细胞存活率，与模型组相比，LQ、LH均可以使细胞存活率显著提高，同浓度下，LH组细胞存活率更高，提示LH对细胞的保护作用更好。
Figure 6. Effects of LQ and LH on the survival rate of D-galactose-induced HUVEC cells
图6. LQ、LH对D-半乳糖诱导HUVEC细胞存活率的影响
3.7. LQ、LH对D-半乳糖诱导HUVEC细胞SA-β-gal的影响
如图7所示，与正常组相比，模型组SA-β-gal阳性率显著上升；与模型组相比，经过LQ及LH给药后，可使HUVEC细胞SA-β-gal阳性率下降；与LQ组相比，同浓度下，LH组阳性率较少，说明LH对D-半乳糖诱导HUVEC细胞保护作用更好。
Figure 7. Effects of LQ and LH on D-galactose-induced SA-β-gal in HUVEC cells
图7. LQ、LH对D-半乳糖诱导HUVEC细胞SA-β-gal的影响
如表2所示，与正常组相比，模型组SA-β-gal细胞蓝染数显著上升；与模型组相比，经过LQ及LH给药后，可使HUVEC细胞SA-β-gal蓝染数下降。
Table 2. Effects of LQ and LH on D-galactose-induced SA-β-gal in HUVEC cells
表2. LQ、LH对D-半乳糖诱导HUVEC细胞SA-β-gal的影响
Group |
Positive rate of β-galactosidase staining (%) |
Control |
1.08 ± 0.89 |
Model (H2O2) |
35.58 ± 4.92### |
LQ |
15.75 ± 4.09*** |
LH |
14.50 ± 3.74*** |
###代表模型组蓝染数量与空白组相比有显著差异，***代表给药组蓝染数量与模型组相比有显著差异。
3.8. LQ、LH对D-半乳糖诱导HUVEC细胞活性氧ROS的影响
如图8所示，与正常组相比，模型组ROS荧光强度显著升高；与模型组相比，LQ、LH组HUVEC细胞内ROS荧光强度均显著降低。LH组ROS荧光强度比LQ组更弱，说明LH组能够显著降低D-半乳糖诱导的细胞过氧化损伤，从而达到对细胞氧化损伤的保护作用。
Figure 8. Effects of LQ and LH on D-galactose-induced ROS in HUVEC cells
图8. LQ、LH对D-半乳糖诱导HUVEC细胞ROS的影响
3.9. LQ、LH对D-半乳糖诱导HUVEC线粒体膜电位MMP的影响
由图9可知，对照组HUVEC细胞红色荧光/绿色荧光比值较高，D-半乳糖组红色荧光/绿色荧光比值降低，D-半乳糖 + LQ、D-半乳糖 + LH组HUVEC细胞红色荧光相对于模型组增强，红色荧光/绿色荧光比值显著提高，同等剂量下，LH组红色荧光/绿色荧光比值比LQ组高，提示LH组保护线粒体膜电位效果优于LQ组。
Figure 9. Effects of LQ and LH on the mitochondrial membrane potential of D-galactose-induced HUVEC
图9. LQ、LH对D-半乳糖诱导HUVEC细胞线粒体膜电位的影响
4. 讨论
天然植物蛋白是一种具有高质量、高开发价值的可再生优质蛋白资源。制备生物活性肽的第一步通常是从原料中提取出蛋白质，这样可以提高后续酶解的效率。常见的蛋白质提取方法是碱提酸沉法、盐析法、发酵法。碱提酸沉法提取效率比较高，有利于蛋白的沉降[11]，本文选用此方法提取罗布麻蛋白。已有研究表明，D-Gal可以引起类似于衰老的生理状态改变[12]。D-Gal诱导衰老模型应用广泛，具有操作方便，副作用少，细胞生存率较高等优势，被认为是衰老研究的有效工具[13]。H2O2也可以诱导内皮细胞衰老[14]。
罗布麻从古至今都有抗衰老记载，据我国著名中医文献学家马继兴等考证，罗布麻又名泽漆，记载于《三国志·华佗列传》，华佗曾遗留一个能延年益寿的方剂“漆叶青粘散”，此方剂能有“久服去三虫，利五脏、轻体，使人头不白”之功效[15]。现代临床研究发现罗布麻叶浸膏片可改善夜尿等部分衰老症状[16]；可提高老年人自然杀伤细胞活性及红细胞超氧化物歧化酶含量，有一定延缓衰老的作用[17]；在动物模型中，罗布麻提取物可延长果蝇寿命，降低大鼠血清过氧化脂质水平[18]。但是其抗衰老的活性成分尚不明晰。
本研究首次制备了罗布麻蛋白多肽部位，确证了其抗衰老药效。衰老机制复杂，其中线粒体功能障碍是关键机制之一。线粒体是细胞能量工厂和信号传输中心，当线粒体结构受损时，会导致线粒体功能障碍，包括线粒体膜电位的降低和ROS产生的增加，最终加剧细胞损伤并引发衰老[19]。本研究明确罗布麻蛋白及多肽部位可改善由于衰老导致的内皮细胞膜电位降低，提示罗布麻抗衰老可能通过维持线粒体稳态、抑制应激有关氧化。本课题首次明确罗布麻蛋白及肽类成分是其抗衰老的活性部位之一，可为未来罗布麻抗衰老成分的开发发掘奠定基础。
NOTES
*通讯作者。