基于pcDNA3.1框架的p38β真核表达质粒的构建及其功能研究

Study on Construction and Functional Characterization of a pcDNA3.1-Based Eukaryotic Expression Plasmid for p38β

摘要: 目的：为探究p38β在巨噬细胞炎症反应中的调控机制，建立鼠源pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β真核表达质粒，转染RAW264.7细胞建立实验模型。通过脂多糖(LPS)刺激，从细胞增殖、凋亡、促炎因子表达三个方面研究该重组质粒的生物学功能。方法：通过PCR扩增p38β基因，构建基于pcDNA3.1框架的p38β真核表达质粒。利用EcoRI/XhoI限制性位点双酶切，将纯化的目的片段进行体外重组，转化细菌感受态细胞。经酶切鉴定、测序与比对分析后，将重组质粒转染至LPS刺激的RAW264.7细胞中，通过Western blot和qRT-PCR技术及EdU法、ELISA法检测其对LPS诱导的RAW264.7细胞增殖和凋亡的影响，以及肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-6 (IL-6)、白细胞介素-1β (IL-1β)等炎症介质的分泌水平。其中，Western blot技术用于检测凋亡相关蛋白表达，qRT-PCR解析基因转录调控，EdU法检测DNA合成活性，ELISA法检测炎症因子分泌量。结果：双酶切鉴定和Western blot结果显示pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β真核表达质粒构建成功并表达。EdU实验显示：LPS刺激RAW264.7细胞24 h后，p38β过表达组的细胞存活率显著低于空载体对照组。Western blot及PCR结果显示：p38β过表达组细胞的促凋亡蛋白Bax表达高于转染空载体的对照组，抗凋亡蛋白Bcl-2及增殖蛋白PCNA表达低于空载体对照组(均P < 0.05)。Western blot和ELISA结果显示：pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β质粒转染使RAW264.7细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达较对照组升高，差异均有统计学意义(P < 0.05)。结论：p38β能抑制LPS刺激的RAW264.7细胞增殖，并促进其凋亡，同时能上调TNF-α、IL-6和IL-1β等炎症介质的表达。

Abstract: Objective: To investigate the regulatory mechanism of p38β in macrophage inflammatory responses, a murine pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β eukaryotic expression plasmid was constructed and transfected into RAW264.7 cells to establish an experimental model. Lipopolysaccharide (LPS) stimulation was used to study the biological functions of this recombinant plasmid in terms of cell proliferation, apoptosis, and pro-inflammatory cytokine expression. Methods: The p38β gene was amplified by PCR to construct the p38β eukaryotic expression plasmid based on the pcDNA3.1 framework. Purified target fragments were recombined in vitro using EcoRI/XhoI restriction sites and transformed into bacterial competent cells. After restriction enzyme digestion, sequencing, and comparative analysis, the recombinant plasmid was transfected into LPS-stimulated RAW264.7 cells. Western blot, qRT-PCR, EdU assay, and ELISA were employed to assess its effects on LPS-induced proliferation, apoptosis, and secretion levels of inflammatory mediators such as tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), and interleukin-1β (IL-1β). Specifically, Western blot analyzed apoptosis-related protein expression, qRT-PCR elucidated transcriptional regulation, the EdU assay measured DNA synthesis activity, and ELISA quantified inflammatory cytokine secretion. Results: Restriction enzyme digestion and Western blot confirmed the successful construction and expression of the pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β plasmid. The EdU assay revealed that 24 h after LPS stimulation, cell viability in the p38β overexpression group was significantly lower than in the empty vector control group. Western blot and qRT-PCR results demonstrated that the p38β overexpression group exhibited higher expression of the pro-apoptotic protein Bax and lower expression of the anti-apoptotic protein Bcl-2 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) compared to the control group (P < 0.05). Additionally, Western blot and ELISA showed that transfection with pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β significantly upregulated the expression of TNF-α, IL-6, and IL-1β in RAW264.7 cells compared to the control group (P < 0.05). Conclusion: p38β inhibits LPS-induced proliferation and promotes apoptosis in RAW264.7 cells while upregulating the expression of inflammatory mediators such as TNF-α, IL-6, and IL-1β.

1. 引言

细胞外信号调节激酶p38β是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) p38亚家族中的一个亚型，由丝裂原活化蛋白激酶11 (MAPK11)编码[1]-[3]。p38β在人脑、心脏、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、睾丸、卵巢、前列腺和胰腺等中均有表达，其主要是通过调节炎症信号通路发挥作用，与人类约一半的恶性肿瘤、感染、自身免疫性疾病等引起的炎症过程存在显著关联[1] [4] [5]。肿瘤组织中存在炎症细胞和炎症介质(如趋化因子、细胞因子等)是癌症相关炎症的特征之一，慢性炎症通过促进癌细胞异常增殖、诱导新生血管生成、增强细胞侵袭能力以及促进转移扩散，在恶性肿瘤演进过程中发挥着关键调控作用[6]。作为免疫系统的关键性吞噬细胞，巨噬细胞不仅负责清除病原体和摄取消化、吞噬处理衰老/损伤细胞，还能通过分泌多种促炎因子参与微环境调控[7] [8]。研究表明，作为重要的信号传导通路，p38 MAPK通过动态调节肿瘤相关细胞产生的炎症介质的活性与表达，包括肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)等，从而介导肿瘤起始阶段的病理转化并加速恶性进展过程[6] [9] [10]。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，通过特异性激活巨噬细胞表面Toll样受体(Toll like receptors, TLRs)介导的NF-κB级联反应，触发促炎介质的合成与释放，进而诱导炎症反应的发生发展[11]。故采用LPS刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7，建立体外炎症反应研究模型，研究并探讨p38β的功能。本实验将通过构建p38β过表达质粒，研究p38β对LPS刺激的RAW264.7细胞模型中的调控作用，包括增殖、凋亡及炎症级联反应的影响。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

RAW264.7细胞株(安徽医科大学药学院保存)；胎牛血清(美国Gibco公司)；DMEM培养基(北京沃卡威生物技术有限公司)；p38β抗体(山东华安生物科技有限公司)；Western blot试剂盒、TRIzol Rragent RNA提取试剂(上海Beyotime公司)；ECL化学发光试剂(上海雅酶生物医药科技有限公司)；细胞培养瓶、培养板(无锡NEST公司)；PVDF膜(北京索莱宝科技有限公司)；TNF-α抗体、IL-6抗体、IL-1β抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；Lipofectamine 2000试剂(美国Invitrogen公司)；EcoRI、XhoI内切酶(美国Axygen公司)；ELISA试剂盒(武汉基因美公司)。

2.2. 方法

2.2.1. p38β真核表达质粒的构建与验证

通过PCR技术扩增p38β基因，并将其克隆至pcDNA3.1载体多克隆位点，构建pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β真核表达质粒。经双酶切验证后委托上海吉玛制药技术有限公司完成DNA测序鉴定。

2.2.2. p38β过表达载体的转染与实验分组

将RAW264.7细胞按1 × 10⁶个/孔的密度接种入6孔培养板内继续培养，待细胞贴壁后进行转染操作。制备转染复合物：将A液(含2 μg pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β质粒的250 μL DMEM培养基)与B液(含5 μL Lipofectamine 2000脂质体的250 μL DMEM培养基)分别于无核酸酶EP管中静置5 min后，震荡充分混匀。经20 min室温孵育后，将其转移至6孔板中再补足培养基至2 mL。转染6 h后更换完全培养基，继续培养24 h用于后续检测。本实验分为四个组进行对比分析：基础对照组：维持基础培养条件，未进行任何处理；LPS刺激组：加入100 ng/mL LPS单刺激处理；空载体对照组：100 ng/mL LPS刺激 + pcDNA3.1-N-3 × Flag空载体转染；p38β过表达组：100 ng/mL LPS刺激 + pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β重组载体转染。

2.2.3. Western Blot实验

完成细胞处理后，吸弃6孔板中的培养基，用PBS缓冲液进行3次梯度漂洗。加入预冷的RIPA裂解液(含1% PMSF蛋白酶抑制剂)，在冰上裂解细胞，离心提取总蛋白。使用BCA法对蛋白样品进行定量分析，测蛋白质浓度。经12% SDS-PAGE凝胶蛋白电泳分离后，在恒定电流(200 mA)条件下湿式转膜60 min，使蛋白样品定向迁移至PVDF膜。转印完成后用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液于室温封闭2 h后，TBST在摇床上进行3次间隔洗涤(每次10 min)，并在相应的一抗中4℃孵育过夜，一抗稀释的浓度分别为p38β (1:500)，TNF-α (1:1000)，IL-6 (1:1000)、IL-1β (1:1000)、Bcl-2 (1:1000)、Bax (1:1000)、PCNA (1:1000)。经严格洗膜后，与HRP偶联二抗(1:5000)于室温孵育1 h。严格清洗3次去除游离抗体，采用ECL化学发光试剂盒进行蛋白条带显影及图像采集，所有结果均以β-actin抗体(1:5000)作为内参蛋白对照。

2.2.4. EdU检测

采用胰蛋白酶解离法获取处于对数生长期的RAW264.7单细胞悬液，以1 × 10⁵个/孔的密度接种于96孔培养板中。在37℃、5% CO₂恒温培养箱中预培养12 h后，向各孔加入EdU检测试剂，继续孵育2 h完成细胞增殖标记。弃旧培养基，PBS清洗2遍。每孔加入50 μL 4%多聚甲醛固定液固定30 min，经PBS清洗后进行膜透化处理。每孔加入含0.5% Triton X-100的PBS溶液100 μL，室温处理15 min后弃液，PBS清洗3遍。向各孔滴加Click-iT™反应缓冲液，于室温避光反应30 min，随后补加1 μg/mL DAPI核染液室温染色10 min。经PBS清洗后在荧光显微镜下采集各组细胞图像，细胞增殖率 = EdU阳性细胞数/DAPI阳性细胞数。

2.2.5. RNA提取和qRT-PCR

按照RNA纯化试剂盒说明书分离细胞总RNA。逆转录合成cDNA，在StepOnePlus™实时荧光定量PCR系统中进行目标基因扩增。目标基因表达水平通过ΔΔCt法计算，以β-actin作为内参进行标准化校正。

2.2.6. ELISA检测炎症因子的分泌

将处于对数生长期的RAW264.7细胞以1 × 10⁶个/孔的密度接种于6孔培养板，分别转染空载体(pcDNA3.1-N-3 × Flag)和p38β过表达载体(pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β)，6 h后更换为含100 ng/mL LPS的完全培养基，继续孵育24 h。终止培养后，收集细胞悬液经离心分离获得上清液，严格参照ELISA试剂盒操作规范检测细胞上清液中炎症介质TNF-α、IL-6和IL-1β的浓度。

2.3. 统计学分析方法

本研究中所有数据均采用SPSS 20.0统计软件进行系统分析，计量资料均以“均数 ± 标准差”(x ± s)表示，选用t检验进行两独立样本均数比较，选用单因素方差分析进行多组间数据比较。显著性水平设为α = 0.05 (双侧)，P < 0.05判定为差异显著。

3. 结果

3.1. p38β真核表达质粒的构建与验证

为了构建pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β真核表达质粒，通过PCR法扩增目的基因片段。将pcDNA3.1-N-3 × Flag载体与目的片段经EcoRI/XhoI双酶切后纯化，通过T4 DNA连接酶构建重组质粒，转化TG1感受态细胞。随机选取8个单克隆菌落进行液体振荡培养，最终采用质粒纯化试剂盒提取重组质粒。经EcoRI/XhoI双酶切验证显示：pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β重组质粒成功构建。如图1所示，阳性克隆经琼脂糖凝胶电泳分析，在预期分子量位置呈现特异性条带，与双酶切产生的片段大小一致。进一步筛选经限制性内切酶验证的重组克隆，委托专业测序机构(上海吉玛制药技术有限公司)进行DNA序列比对。

3.2. pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β真核表达质粒的表达验证

为了检测pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β质粒在RAW264.7细胞中的表达效率，采用Western blot技术进行蛋白水平检测。结果显示：与基础对照组相比，LPS刺激组中p38β蛋白表达水平显著升高(P < 0.01)；过表达组的p38β蛋白表达量高于转染空载体的对照组(P < 0.01)。该结果表明pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β重组质粒成功实现功能性表达，见图2。

M1、M2: DNA Marker

Figure 1. Restriction enzyme digestion verification of the pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β recombinant plasmid

图1. pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β重组质粒的酶切验证

Figure 2. Protein expression of the pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β recombinant plasmid. A: Western blot detection of the protein expression of the pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β plasmid; B: Histogram of p38β protein expression. Compared with the basic control group: ^*P < 0.05; compared with the empty vector control group: ^**P < 0.01.

图2. pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β重组质粒的蛋白表达。A:Western blot检测pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β质粒的蛋白表达；B:p38β蛋白表达柱状图；与基础对照组比较：^*P < 0.05；与空载体对照组比较：^**P < 0.01。

3.3. p38β对RAW264.7细胞增殖的影响

为了检测pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β质粒转染后对RAW264.7细胞增殖活性的影响，采用EdU染色法进行检测。结果显示，相较于LPS刺激组和空载体对照组，p38β过表达组的EdU阳性细胞率明显降低，差异具有统计学意义(P < 0.01)。这表明在LPS刺激的炎症反应中，p38β的过表达可通过靶向调控细胞周期来抑制RAW264.7细胞的增殖活性，见图3。

3.4. p38β对RAW264.7细胞凋亡的影响

为了检测pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β质粒转染至RAW264.7各组细胞后对细胞凋亡的影响，分别采用qRT-PCR和Western blot检测Bcl-2、PCNA和Bax的mRNA和蛋白水平相对表达量。结果显示，相较于LPS刺激组及空载体对照组，p38β过表达组抗凋亡因子Bcl-2的转录水平与蛋白丰度均下调(P < 0.01)，促凋亡因子Bax的表达量则呈现上调(P < 0.01)。同时，增殖标志物PCNA的表达亦受抑制(P < 0.05)。该结果表明过表达p38β可通过调节Bcl-2/Bax平衡及抑制增殖相关蛋白表达，促进LPS诱导的RAW264.7细胞凋亡，见图4。

Figure 3. Detection of cell proliferation activity by EdU assay

图3. EdU法检测细胞增殖活性

^*，^**分别代表P < 0.05，P < 0.01。

Figure 4. Expression of apoptosis-related proteins after transfection with pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β recombinant plasmid. A. Western blot detection of apoptosis-related protein expression; B. Analysis of mRNA levels for Bax, PCNA, and Bcl-2; C. Analysis of protein levels for Bax, PCNA, and Bcl-2

图4. pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β重组质粒转染后凋亡相关蛋白的表达。A. Western blot检测凋亡相关蛋白的表达；B. Bax、PCNA和Bcl-2的mRNA水平分析；C. Bax、PCNA和Bcl-2的蛋白水平分析

3.5. p38β对RAW264.7细胞炎症介质表达的影响

为了检测pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β质粒转染后对RAW264.7细胞炎症应答的调控作用，采用qRT-PCR技术定量分析关键促炎介质(TNF-α、IL-6、IL-1β)的mRNA转录水平，Western blot检测相应蛋白的表达量。结果显示：与空载体对照组相比，p38β过表达组中的TNF-α和IL-6的表达量均上调(P < 0.001, P < 0.01)。IL-1β的mRNA与蛋白表达亦呈现上调趋势(P < 0.01)。这表明在RAW264.7细胞模型中，p38β的基因过表达显著驱动促炎细胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β的转录激活与胞外分泌，见图5。

^*，^**分别代表P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001。

Figure 5. Expression of inflammatory factors after transfection with pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β recombinant plasmid. A. Western blot detection of the expression of inflammatory factors; B. Quantitative analysis of the mRNA levels of TNF-α, IL-6, and IL-1β; C. Quantitative analysis of the protein levels of TNF-α, IL-6, and IL-1β

图5. pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β重组质粒转染后炎症因子的表达。A. Western blot检测炎症因子的表达；B. TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平定量分析；C. TNF-α、IL-6和IL-1β的蛋白水平定量分析

3.6. p38β对RAW264.7细胞炎症介质分泌的影响

为了检测pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β质粒对RAW264.7巨噬细胞炎症介质分泌的调控，通过高敏ELISA法检测上清液中促炎因子水平。结果显示：相较于空载体对照组，p38β过表达组中的TNF-α释放量升高(P < 0.01)；IL-6和IL-1β的分泌水平也均较转染空载体对照组升高(P < 0.05)。这表明在RAW264.7细胞中，过表达p38β显著促进TNF-α、IL-6及IL-1β等促炎介质的合成与分泌，见图6。

^*，^**分别代表P < 0.05，P < 0.01。

Figure 6. Detection of the levels of inflammatory factors in the supernatant after transfection with pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β recombinant plasmid by ELISA

图6. ELISA法检测pcDNA3.1-N-3 × Flag-p38β重组质粒转染后上清液中炎症因子的水平

4. 讨论

丝裂原活化蛋白激酶p38家族是存在于各种生物细胞中一条重要的信号传导通路，作为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的核心成员，其在炎症调控和肿瘤发生发展中的双重作用近年来备受关注[12]。有研究证实，在巨噬细胞介导的炎症反应中，通常在病原体或LPS刺激后，p38 MAPK被迅速磷酸化和激活，促进多种促炎介质的表达[13] [14]。p38β可能主要通过激活MAPK AP-K2和ATF-2等下游效应分子调控细胞应激反应，同时可能通过MSK1通路影响炎症因子的转录调控[15] [16]。炎症是多种生理和病理过程的基础，过度或持续的炎症稳态失衡会导致多种疾病，比如自身免疫性疾病、感染、癌症等[17]。本研究通过构建p38β过表达质粒，建立LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型，揭示其在RAW264.7巨噬细胞中的功能调控网络。

实验数据显示，p38β过表达显著抑制LPS诱导的细胞增殖(EdU阳性率下降，P < 0.01)。分子机制研究发现，qRT-PCR和Western blot检测质粒转染后细胞凋亡相关蛋白表达，结果显示p38β过表达后能够上调细胞凋亡相关蛋白Bax的表达，下调抗凋亡相关蛋白Bcl-2及增殖相关蛋白PCNA的表达，从而促进RAW264.7细胞的凋亡。此外，该亚型同时表现出促炎特性。Western blot检测结果显示p38β过表达使细胞中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的蛋白表达水平上调；ELISA结果显示细胞上清中炎症因子分泌量显著升高，进一步表明p38β通过转录–分泌双途径促进炎症反应。综合实验数据分析，p38β对RAW264.7细胞表现出双重调控作用：抑制RAW264.7细胞的增殖并促进其凋亡；同时也可上调TNF-α、IL-6及IL-1β等促炎细胞因子的分泌水平。该基因过表达在RAW264.7细胞中呈现“增殖抑制–凋亡增强–炎症加剧”的三联效应。

虽然p38β在人类细胞中的确切分子功能尚未完全阐明，但它参与细胞转化和癌症的过程，影响细胞对化疗和放疗的反应，在多种肿瘤类型中具有双重调控作用，以p38β为靶点研发药物抑制炎症因子的表达和分泌，为今后炎症及肿瘤治疗提供了新的思路[18]。本研究证实其同时具有促凋亡和促炎特性，这种特双效性提示靶向p38β可通过重塑肿瘤免疫微环境发挥治疗作用，但也可能过度激活炎症反应而带来相应的副作用。但本研究存在一定局限性，实验模型基于体外培养的RAW264.7细胞系，缺乏在原代巨噬细胞和条件性敲除动物模型中进一步验证；其次，本研究发现的p38β调控网络主要集中于已知的NF-κB和AP-1信号通路，未深入解析p38β特异性调控的转录因子网络，未能揭示新的作用靶点或调控机制，这可能导致研究创新性受限。再者，p38β与其他亚型(如p38α)的交互作用尚未阐明，与其他MAPK通路成员(如ERK、JNK)的交叉对话可能产生补偿效应。后续研究将建立多维度评价体系，在条件性敲除动物模型中验证p38β的体内功能，并通过蛋白质组学筛选其新型互作蛋白，为开发精准靶向p38β的疾病干预策略提供理论依据。

NOTES

^*通讯作者。