1. 引言
复发性口腔溃疡(Recurrent oral ulcer, ROU)又称复发性阿弗他溃疡，是一种常见疾病，全球发病率达5%~25%，它以口腔黏膜间歇性出现的疼痛性溃疡为特征，显著影响患者生活质量[1]。中医将复发性口腔溃疡归为“口疮”，认为“心脾积热”为主要病机。其表现为心火亢盛、脾失健运，邪热上攻口舌，导致黏膜红肿溃烂[2]。心脾郁热内蕴可引发口舌生疮，症状时发时缓，导致溃疡反复发作[3]。临床研究表明，其病因与外伤、感染、过敏等多种因素有关，ROU具有易复发的特点，难以彻底治疗[4] [5]。运用糖皮质激素联合免疫抑制药物[6]，是目前常规疗法，长期使用会导致细菌感染数量增加，甚至导致激素依赖和黏膜萎缩[7]，亟需探索更安全有效的治疗策略。
灯心草(Juncus effusus L.)性味甘淡、微寒，归心、肺、小肠经，作为传统中药，在《本草纲目》中记载“降心火，利小肠”[8]。现代研究证实其富含黄酮类、菲类、苷类等成分，这些成分具有显著抗炎及促进伤口愈合作用[9] [10]。近年民族药学进一步研究发现，灯心草提取物可通过降低促炎因子减缓口腔黏膜炎症[11]。现有研究多聚焦于灯心草单一活性成分，难以全面阐释其作用机制，且缺乏灯心草对ROU的分子网络调控证据。
相较于传统单靶点研究模式，网络药理学能够系统解析活性成分与疾病靶点的相互作用网络，还能识别关键调控通路[12]。本研究基于网络药理学方法，结合分子对接与通路富集分析，首次系统揭示灯心草治疗ROU的多层次作用机制，为灯心草的研究提供理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 成分与疾病的靶点获取
通过TCMSP数据库检索灯心草活性成分，以OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18为筛选标准，使用UniProt标准化其基因名称。以“recurrent oral ulcer”为关键词，在GeneCards和OMIM数据库中查询疾病靶点，获取socre值大于中位数的基因。
2.2. 网络构建
Cytoscape 3.9.1构建成分–靶点–疾病网络，使用CytnNCA模块聚类各节点，对节点的关系进行分析，推测灯心草中的核心成分。
2.3. 蛋白互作网络(PPI)建立
将灯心草治疗复发性口腔溃疡的靶点，导入蛋白互作网络STRING数据库，设置高置信度(>0.7)，获取蛋白互作网络(PPI)数据，在Cytoscape平台绘制PPI网络图。
2.4. 富集分析
使用R语言，对灯心草治疗复发性口腔溃疡作用靶点进行基因本体(GO)和京东基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路进行分析，设置p < 0.05与q < 0.05为检验显著性的筛选条件，GO生物学过程(BP)，细胞组成(CC)，分子功能(MF)分别取前10条目，KEGG通路取前20条目。
2.5. 分子对接分析
在Uniprot数据库中查找靶点对应的Homo蛋白名称，并通过RCSB Protein Data Bank数据库获得蛋白结构，PyMOL软件处理结构的水分子以及配体小分子，借助Autodock tool软件对蛋白加氢得到受体pbdqt格式文件。运用Pubchem数据库得到各成分的2D结构，使用Chem3D22.0.0软件优化构象，借助Autodock tool得到配体pbdqt格式文件，采用Autodock vina结合R语言进行小分子配体和蛋白分子对接模拟。
3. 结果
3.1. 成分与疾病的靶点获取
通过TCMSP数据库，从灯心草中得到17个化学成分，主要包括黄酮类和菲类成分(表1)，与活性成分相关的靶点687个。通过GeneCards和OMIM数据库获得基因，得到ROU靶点2540个。通过交集灯心草的作用靶点与复发性口腔溃疡的靶点，去除重复基因后，获得73个共同靶点，作为治疗ROU的潜在靶点，详见韦恩图(图1)。
Table 1. Chemical composition table of Juncus effusus
表1. 灯心草的化学成分表
Mol ID |
Molecule Name |
中文名 |
OB(%) |
DL |
MOL000296 |
hederagenin |
常春藤皂苷元 |
36.91 |
0.75 |
MOL000359 |
sitosterol |
β-谷甾醇 |
36.91 |
0.75 |
MOL000006 |
luteolin |
木犀草素 |
36.16 |
0.25 |
MOL006149 |
7-hydroxy-8-methyl-4-vinyl-9,10-
dihydrophenanthrene-1-carboxylic acid |
7-羟基-8-甲基-4-乙烯基-9,10
-二氢菲-1-羧酸 |
56.99 |
0.27 |
MOL007895 |
2,8-dihydroxy-1,7-dimethyl-6-ethenyl-10,11-dihydrodibenz[b,f]-oxepin |
2,8-二羟基-1,7-二甲基-6-乙烯基-10,11-二氢二苯并[b,f]氧杂环庚烯 |
58.95 |
0.27 |
MOL007898 |
1,8-dimethyl-4-vinyl-9,10-dihydrophenanthrene-2,7-diol |
1,8-二甲基-4-乙烯基-9,10-二氢菲-2,7-二醇 |
42.1 |
0.23 |
MOL007899 |
2,8-dihydroxy-1,6-dimethyl-5-ethenyl-9,10-dihydrophenanthrene |
2,8-二羟基-1,6-二甲基-5-乙烯基-9,10-二氢菲 |
35.77 |
0.23 |
MOL007904 |
dehydroeffusal |
去氢灯心草酚 |
79.55 |
0.21 |
MOL007905 |
5-(1-methoxyethyl)-2,6-dihydroxy-1,7-dimethyl-9,10-dihydrophenanthrene |
5-(1-甲氧基乙基)-2,6-二羟基-1,7-二甲基-9,10-二氢菲 |
35.77 |
0.29 |
MOL007907 |
3,7-dihydroxy-2,8-dimethyl-9,10-dihydrophenanthrene-4-carbaldehyde |
3,7-二羟基-2,8-二甲基-9,10-二氢菲-4-甲醛 |
40.49 |
0.23 |
MOL007908 |
7-hydroxy-2-methoxy-1,8-dimethyl-9,10-dihydrophenanthrene-4-carbaldehyde |
7-羟基-2-甲氧基-1,8-二甲基-9,10-二氢菲-4-甲醛 |
60.42 |
0.26 |
MOL007910 |
1-methyl-5-vinyl-9,10-dihydrophenanthrene-2,7-diol |
1-甲基-5-乙烯基-9,10-二氢菲-2,7-二醇 |
56.43 |
0.2 |
MOL007911 |
juncunol |
灯心草酚 |
35.57 |
0.2 |
MOL007912 |
1-(3,7-dihydroxy-2,8-dimethyl-9,10-dihydrophenanthren-4-yl) ethanone |
1-(3,7-二羟基-2,8-二甲基-9,10-二氢菲-4-基)乙酮 |
44.72 |
0.26 |
MOL007915 |
1-hydroxyethyl)-2,6-dihydroxy-1,7-dimethyl-9,10-dihydrophenanthrene |
1-(1-羟乙基)-2,6-二羟基-1,7-二甲基-9,10-二氢菲 |
42.31 |
0.26 |
MOL007917 |
8-hydroxy-2-methoxy-1,6-dimethyl-5-ethenyl-9,10-dihydrophenanthrene |
8-羟基-2-甲氧基-1,6-二甲基-5-乙烯基-9,10-二氢菲 |
32.62 |
0.26 |
MOL007918 |
2-hydroxy-7-methoxy-1,8-dimethyl-5-ethenyl-9,10-dihydrophenanthrene |
2-羟基-7-甲氧基-1,8-二甲基-5-乙烯基-9,10-二氢菲 |
43.49 |
0.26 |
![]()
Figure 1. Venn diagram of common targets between Juncus effusus and the disease
图1. 灯心草与疾病的共同靶点韦恩图
3.2. 网络构建
使用Cytoscape平台构建灯心草成分和靶点的交互网络(图2)，包含86个节点与193条边，经degree值知其中关键化合物为木犀草素(luteolin, MOL000006)、4-乙烯基-7-甲氧基-3,8-二甲基-9,10-二氢菲-1-醇(4-ethenyl-7-methoxy-3,8-dimethyl-9,10-dihydrophenanthren-1-ol, MOL007917)、5-乙烯基-7-甲氧基-1,8-二甲基-9,10-二氢菲-2-醇(5-ethenyl-7-methoxy-1,8-dimethyl-9,10-dihydrophenanthren-2-ol, MOL007918)、2,8-二羟基-1,6-二甲基-5-乙烯基-9,10-二氢菲(2,8-dihydroxy-1,6-dimethyl-5-ethenyl-9,10-dihydrophenanthrene, MOL007899)、1,8-二甲基-4-乙烯基-9,10-二氢菲-2,7-二醇(1,8-dimethyl-4-vinyl-9,10-dihydrophenanthrene-2,7-diol, MOL007898) 5个活性成分。
Figure 2. Network diagram of Juncus effusus-active components-targets-ROU
图2. 灯心草–活性成分–作用靶点–复发性口腔溃疡网络图
3.3. 蛋白互作网络(PPI)建立
PPI网络String分析显示CASP3、JUN、TP53等核心靶点形成高置信度互作模块(图3)。将PPI网络数据导入Cytoscape3.10.2，绘制得到靶点网络图子网络a (图4)，包含70个节点，471条边。根据BC、CC、DC、EC、LAC、NC参数，依次筛选出大于对应的中位值的靶点，逐步得到网络关系图子网络b、子网络c，筛选出前7位核心基因EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor，表皮生长因子受体)、MMP9(Matrix Metalloproteinase 9，基质金属蛋白酶9)、TP53 (Tumor Protein p53，肿瘤蛋白p53)、JUN(Transcription Factor AP-1，转录因子AP-1)，IL6 (Interleukin 6，白细胞介素6)、CASP3 (Caspase 3，半胱天冬酶3)、AKT1 (AKT serine/threonine kinase 1，AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1) (表2)。
Figure 3. Protein-Protein Interaction Network
图3. PPI网络图
Figure 4. Key genes screened by CytoNCA for Juncus effusus in treating ROU
图4. 灯心草治疗ROU CytoNCA筛选关键基因
Table 2. Topological parameters of the first seven targets in the PPI network
表2. PPI网络的前7位靶点的拓扑参数
Name |
Betweenness |
Closeness |
Degree |
Eigenvector |
LAC |
Network |
EGFR |
17.26204906 |
0.88 |
19 |
0.262241185 |
12.10526316 |
17.11446944 |
MMP9 |
5.976334776 |
0.75862069 |
15 |
0.216789722 |
10.8 |
12.77648463 |
TP53 |
24.51125541 |
0.956521739 |
21 |
0.281860173 |
12.76190476 |
20.33270577 |
JUN |
16.41356421 |
0.88 |
19 |
0.260034919 |
12.10526316 |
17.36244328 |
IL6 |
10.88347763 |
0.846153846 |
18 |
0.253727913 |
12.22222222 |
16.32585919 |
CASP3 |
13.61515152 |
0.814814815 |
17 |
0.235240981 |
10.82352941 |
14.11767261 |
AKT1 |
28.93030303 |
1 |
22 |
0.290797621 |
13 |
22 |
3.4. 富集分析
GO富集筛选得到生物过程、细胞组成、分子功能各前10条目，见图5。生物过程主要涉及外源性物质刺激应答(response to xenobiotic stimulus)、氧化应激反应(response to oxidative stress)、炎症反应调控(regulation of inflammatory response)；细胞组成包括膜阀(membrane raft)、膜微区(membrane microdomains)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合体(serine/threonine protein kinase complex)等；分子功能主要有激酶调节活性(kinase regulator activity)、蛋白激酶调节活性(protein kinase regulator activity)、泛素样蛋白连接酶结合(ubiquitin-like protein ligase binding)等。灯心草治疗复发性口腔溃疡的KEGG通路的前20条涉及到癌症、免疫、炎症以及耐药性相关通路，如图6所示，最重要的为PI3K-AKT(磷脂酰肌3-激酶-蛋白激酶B)信号通路。
Figure 5. GO bar chart
图5. GO柱状图
Figure 6. KEGG bubble chart
图6. KEGG气泡图
3.5. 分子对接分析
将PPI网络中前7个蛋白和筛选出的前5个活性成分展开分子对接，其蛋白信息和结合能数据如表3、图7所示，结合能 < −5 kcal/mol，表明对接均结合稳定。其中活性成分2,8-二羟基-1,6-二甲基-5-乙烯基-9,10-二氢菲小分子配体对接JUN蛋白受体，木犀草素小分子配体对接JUN蛋白受体，结合能 < −9 kcal/mol，具有强的亲和力。
Table 3. Molecular docking protein information table
表3. 分子对接蛋白信息表
Gene |
Protein name |
PDB ID |
EGFR |
Epidermal Growth Factor Receptor |
1M14 |
MMP9 |
Matrix Metalloproteinase 9 |
1ITV |
TP53 |
Tumor Protein p53 |
2G3R |
JUN |
Transcription Factor AP-1 Subunit c-Jun |
1JNM |
IL6 |
Interleukin 6 |
1ALU |
CASP3 |
Caspase 3 |
2CNN |
AKT1 |
AKT Serine/Threonine Kinase 1 |
1H10 |
Figure 7. Molecular docking binding energy heatmap
图7. 分子对接结合能热图
4. 讨论
复发性口腔溃疡发病过程与口腔黏膜炎症、氧化应激及上皮细胞凋亡-增殖失衡有关。除了传统中医“心脾积热”病机，现代医学认为，ROU与炎症因子失衡及T细胞极化异常导致的免疫失常有密切联系[13]。IL-6等促炎因子在溃疡局部显著升高，导致黏膜上皮细胞凋亡及中性粒细胞浸润[14] [15]。Treg细胞比例下降，Th17细胞扩增，打破免疫耐受，引发自身免疫攻击，免疫稳态失调进一步导致口腔粘膜炎症[16]。此外，该病还与基因多态性驱动个体差异、口腔菌群失调与机会致病菌增殖、营养缺乏、激素以及心理因素等多因素交互作用[17]。
灯心草传统功效以清心火为主，与“心脾积热”病机高度契合。现代研究证实，炎症和氧化应激是ROU的核心病理环节，与“心脾积热”的“热、毒、瘀”特征相关[18]。木犀草素具有抗炎、抗氧化的作用，研究表明，木犀草素通过调节核因子E2相关因子2和核因子-κB，抑制促炎细胞因子的产生，进而恢复Th17/Treg细胞平衡，减轻口腔黏膜损伤[19]。在成分–靶点网络图中，木犀草素与7个核心靶点(EGFR/IL6/TP53/JUN/MMP9/AKT1/CASP3)直接连接，度值占比最大；分子对接结果显示，木犀草素与各个核心靶点的结合能 ≤ −7.8 kcal/mol，表明木犀草素可能是治疗ROU的核心成分。2,8-二羟基-1,6-二甲基-5-乙烯基-9,10-二氢菲是一种二氢菲类化合物，菲类衍生物在体外抗炎实验中可抑制NO产生[20]。2,8-二羟基-1,6-二甲基-5-乙烯基-9,10-二氢菲在成分–靶点网络图中它通过“多对多”模式调控CASP3和AKT1；它与核心靶点对接稳定(结合能 ≤ −5.9 kcal/mol)，表明该成分是治疗ROU的潜在成分。
PPI网络提示核心蛋白为EGFR、MMP9、TP53、JUN、IL-6、CASP3、AKT1，其中，IL-6由巨噬细胞和T细胞产生，在炎症和免疫反应中发挥核心作用。MMP9参与细胞外基质降解，在伤口愈合过程中被激活，并在炎症细胞、角质形成细胞表达，与炎症和肿瘤转移相关[21]；TP53、JUN为转录因子，与免疫炎症密切相关[22] [23]。AKT1是PI3K/AKT信号转导通路的核心激酶之一，参与调控细胞增殖和代谢。这些表明PPI网络筛选出的靶点都与ROU密切相关。
GO富集分析提示灯心草可能通过激酶、泛素连接酶调控蛋白，参与口腔炎症、氧化应激等生物过程，从而调节免疫和炎症细胞因子的稳态。KEGG通路富集分析涉及到癌症、免疫、炎症以及耐药性等多种疾病和生物过程，揭示了复发性口腔溃疡受到多个靶点、生物过程交互调控。PI3K/AKT信号通路，在炎症、免疫性疾病、癌症中发挥重要作用。PI3K/AKT的激活，上调血清中促炎因子，导致难愈性溃疡创面[24]。在IL-17信号通路中，IL-17通过靶细胞表面受体介导的信号传导，可诱导促炎细胞因子的过度生成，进而引发病理性组织增殖及持续性炎性损伤[25]。推测木犀草素作用于IL-17，从而下调IL-6等促炎因子水平来减轻炎性损伤，木犀草素还可能抑制AKT1激酶磷酸化，阻断下游NF-κB的激活来减少炎症反应。灯心草中2,8-二羟基-1,6-二甲基-5-乙烯基-9,10-二氢菲等菲类成分，可能会通过抑制c-Jun氨基末端激酶的激活，来实现口腔溃疡的治疗。
本研究揭示了灯心草成分-ROU病因机制–信号通路之间关系。通过网络药理和分析对接初步地阐明了ROU的潜在机制，提示灯芯草治疗复发性口腔溃疡，潜在成分为木犀草素、2,8-二羟基-1,6-二甲基-5-乙烯基-9,10-二氢菲等；调控靶点为EGFR、MMP9、TP53、JUN、IL-6、CASP3、AKT1；作用方式和炎症、免疫、氧化应激密切相关，影响病理的通路涉及PI3K-AKT和IL-17等。灯心草治疗ROU的确切作用机制有待进一步药理实验验证。
基金项目
湖北省教育厅科研计划项目(Q20222807)。
NOTES
*通讯作者。