1. 引言
植物细胞壁作为植物生长发育和逆境响应的动态界面，不仅为细胞提供机械支撑和物理屏障，更通过精密调控细胞与环境互作，参与多种生理过程[1]。其复杂组分中，由β-1,3-葡萄糖苷键聚合而成的胼胝质(Callose)因其独特的时空特异性沉积特征，在植物生命周期中发挥多重生物学功能[2]。胼胝质的生物合成依赖于一类关键酶——胼胝质合酶(Callose Synthases, CalS)，该酶属于进化上高度保守的葡聚糖合酶样蛋白(Glucan Synthase-Like, GSL)家族[3]。目前已在多种植物中系统鉴定出GSL基因家族成员：拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtGSLs (12个)、水稻(Oryza sativa) OsGSLs (10个)、甘蓝型油菜(Brassica napus) BnCalSs (32个)、葡萄(Vitis vinifera) VvCalSs (8个)以及棉花(Gossypium spp.) Gh/Gb/Gr/GaCalSs (15~28个)等[3]-[7]。
分子进化分析表明，GSL蛋白具有高度保守的FKS1结构域和β-1,3-葡聚糖合酶催化域，其跨膜拓扑结构与纤维素合酶(Cellulose Synthase, CES)类似[3]。通过亲水环结构域与其他调控蛋白互作形成功能性复合体，GSLs在细胞质膜上精确调控胼胝质的动态沉积[8]。这一过程对植物生长发育至关重要：从调控胞间连丝(Plasmodesmata)孔径的分子大小排除极限(Size Exclusion Limit, SEL) [9]，到维持气孔发育[10]、花粉母细胞减数分裂[2]以及筛管物质运输[11]等关键生理过程均需胼胝质的精确调控。例如，拟南芥AtGSL2通过控制小孢子初生细胞壁的胼胝质沉积确保雄性配子发育[2]，而水稻OsGSL5的功能缺失导致花粉母细胞减数分裂异常，最终引发雄性不育[12]。值得注意的是，胼胝质沉积的时空失衡亦会引发病理效应，如高温胁迫下水稻叶片OsGSL1、OsGSL6、OsGSL7、OsGSL8和OsGSL9的异常表达导致胞间连丝阻塞，抑制光合同化物运输并最终降低产量[11]。
除发育调控外，GSL基因家族在植物逆境应答中扮演双重角色：一方面，病原侵染诱导的胼胝质沉积可形成物理屏障限制病原扩散，如大豆GSLs通过调控韧皮部胼胝质沉积抑制花叶病毒的系统性传播[13]；另一方面，过量沉积可能加剧生理紊乱，如柑橘黄龙病菌引发的筛板孔堵塞会破坏韧皮部运输稳态[14]。这种精细平衡凸显了系统解析GSL基因家族功能网络的重要性。
本氏烟草(Nicotiana benthamiana)作为植物分子生物学研究的模式体系，凭借其完善的遗传转化平台[15]、高质量基因组数据库[16]以及CRISPR编辑系统[17]，在基因功能研究领域具有独特优势。尽管拟南芥AtGSL7已被证实通过调控筛管发育和损伤诱导的胼胝质沉积影响植物抗逆性[18]，但本氏烟草NbGSLs基因家族的系统鉴定及其成员功能研究仍属空白。本研究通过全基因组水平鉴定NbGSLs家族成员，结合比较基因组学与进化分析筛选AtGSL7同源基因NbGSL2进行克隆与功能预测。研究结果将为解析GSL基因在茄科植物中的功能分化及作物遗传改良提供理论依据。
2. 材料与方法
2.1. NbGSLs基因家族鉴定、亚细胞定位预测与理化性质分析
本氏烟基因组相关文件(N. benthamiana draft genome v2.6.1)下载自Sol Genomics Net (https://solgenomics.sgn.cornell.edu/)数据库。Pfam数据库(http://pfam.xfam.org)下载葡聚糖合酶结构域(pfam02364)的隐马尔可夫模型hmm文件，将获得成员的氨基酸序列提交至NCBI-CD Search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析保守结构域[19]，将没有葡聚糖合酶保守结构域的候选序列删除，共鉴定出12个独特的NbGSLs基因，根据其染色体位置命名为NbGSL1~NbGSL12。EXPASY (https://web.expasy.org/protparam/)对NbGSLs家族成员氨基酸序列进行理化性质分析，预测属性涵盖蛋白氨基酸数量、分子量、等电点等[20]。WoLF PSORT (https://www.genscript.com/wolf-psort.html)预测亚细胞定位[21]。
2.2. 染色体定位、基因结构、保守结构域
通过TBtools (v2.109)的Graphics-Gene Location Visualize from GTF/GFF模块对NbGSLs家族12个成员绘制染色体定位图谱，基因结构与保守结构域通过Gene Structure View模块实现整合[22]。
2.3. 系统发育分析、共线性分析与顺式作用元件分析
拟南芥AtGSLs蛋白序列下载自TAIR (https://www.arabidopsis.org/)数据库。水稻OsGSLs家族蛋白序列下载自NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库。将12个NbGSLs、12个AtGSLs与10个OsGSLs蛋白序列整合至一起，提交MAFF version 7 (https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html)并以Clustal format形式导出结果。将结果在MEGA (v7.0)中打开，使用邻接法(Bootstrap method设置：1000)构建系统发育树[23]。
NbGSLs物种内共线性分析由TBtools中的Advanced Circos模块完成。拟南芥的物种间共线性分析由TBtools中的One Step MCScanX-Super Fast，通过提交两个物种的基因组文件与注释文件，将获得的Ctl文件按要求修改后，于Dual Systeny Plot模块提交Ctl、Simplified GFF、Collinearity三个文件，并对GSLs基因进行高亮，获得拟南芥与本氏烟GSL共线性结果[22]。
通过TBtools中的Gtf/GFF3 Sequence Extract模块抓取所有编码基因ATG上游2000 bp序列，再利用Fasta Extract (Recommended)模块从上述获得的文件中抓取NbGSLs家族12个成员的上游2000 bp序列，再提交至PlantCARE (https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，随后获得各个基因上游顺式作用元件信息[24]，筛选后的结果通过TBtools的Simple BioSequence Viewer模块进行可视化。
2.4. 实验材料
本氏烟培养于人工气候室。
2.5. 本氏烟总RNA提取与cDNA合成
本氏烟总RNA提取参照TIANGEN总RNA提取试剂盒(DP419)说明书。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。NbGSL2参考序列长达5784 bp，建议选用Invitrogen™旗下SuperScriptTM IV逆转录酶(18090200)完成长链cDNA合成，方法参考说明书。
2.6. NbGSL2基因克隆与生物信息学分析
根据从基因组中抓取到NbGSL2 (Niben261Chr01g0179010)的CDS序列，设计克隆引物为NbGSL-F：ATGGCGAGTACTAGTGGGAC；下游引物NbGSL-R：CAAGACTTCCACTTTGCTAC。引物由杭州有康生物科技有限公司合成。
使用诺唯赞2 × KeyPo SE Master Mix (Dye Plus) (PK512)对NbGSL2进行基因克隆。PCR反应体系(50 μL)：2 μL cDNA、2 μL NbGSL-F、2 μL NbGSL-R、25 μL Mix、19 μL dd H2O；PCR反应条件为：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸6 min，35个循环，72℃最终延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带后，使用TIANGEN琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP214)回收PCR产物。将PCR产物与全式金T&B Zero Cloning Kit克隆载体(CTB501)在25℃条件下连接30 min。重组载体热激转化大肠杆菌DH5α后，37℃摇床过夜培养。次日挑取单菌落至500 μL含有卡那霉素的LB培养基，摇床培养3 h后，将菌液送至擎科生物有限公司，经通用引物M13双向测序。
TMHMM-2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测NbGSL2跨膜结构域。NCBI-CD Search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析NbGSL2保守结构域[19]。SOPMA (https://npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)预测NbGSL2蛋白二级结构[25]；SWISS-MODE (https://swissmodel.expasy.org)同源建模NbGSL2蛋白三级结构[26]。
3. 结果与分析
3.1. 本氏烟NbGSLs家族鉴定与染色体定位
为鉴定本氏烟NbGSLs基因家族，我们从Sol Genomics Network (https://solgenomics.net/)下载本氏烟N. benthamiana基因组文件、基因组注释文件等，结合葡聚糖合酶结构域的隐马尔可夫模型(pfam02364)抓取本氏烟中的GSLs基因序列与氨基酸序列。筛选掉不含葡聚糖合酶及其超家族结构域，在剔除其结构域N、C端存在缺失的序列后，从本氏烟中共鉴定到含有12个GSLs，分别位于本氏烟9条不同的染色体上(图1)，我们按从小到大、从上到下的顺序，分别结合染色体序号与基因在染色体上的位置，将12名成员命名为NbGSL1~NbGSL12。其中NbGSL1、NbGSL2和NbGSL3位于染色体Chr01，NbGSL4位于Chr02，NbGSL5位于Chr05，NbGSL6位于Chr06，NbGSL7位于Chr09，NbGSL8位于Chr11，NbGSL9位于Chr12，NbGSL10位于Chr15，NbGSL11和NbGSL12位于Chr18。整体而言，12名成员不均匀分布在各条染色体上，在Chr1中分布3个成员，Chr18中分布2个，其余都各只分布1个成员。
随后我们对其CDS长度、氨基酸长度、蛋白分子量、等电点和亚细胞定位预测等基本特征进行分析(表1)。12个NbGSLs成员CDS最长可达6411 bp，最低长度为5226 bp，CDS整体较长。蛋白的氨基酸长度范围为1741 (NbGSL8)~2136 aa (NbGSL10)。分子量整体较大，大小浮动在202.72 (NbGSL8)~243.90 kD (NbGSL10)。pI范围为8.31 (NbGSL11)~9.23 (NbGSL5)，表明NbGSLs成员为碱性蛋白质。亚细胞定位预测表明，NbGSLs蛋白全部位于胞间连丝。
Figure 1. Chromosome mapping of the NbGSLs gene family in Nicotiana benthamiana
图1. 本氏烟NbGSLs基因家族染色体定位
Table 1. Physical and chemical properties analysis of the NbGSLs gene family in Nicotiana benthamiana
表1. 本氏烟NbGSLs基因家族理化性质分析
基因名称 |
基因号 |
编码区(bp) |
氨基酸数(aa) |
分子量(kD) |
等电点 |
亚细胞定位 |
NbGSL1 |
Niben261Chr01g0064002 |
5307 |
1768 |
205.83 |
9.16 |
胞间连丝 |
NbGSL2 |
Niben261Chr01g0179010 |
5784 |
1927 |
223.92 |
8.85 |
胞间连丝 |
NbGSL3 |
Niben261Chr01g0236017 |
6114 |
2037 |
235.04 |
8.41 |
胞间连丝 |
NbGSL4 |
Niben261Chr02g0096002 |
5913 |
1970 |
227.79 |
9.15 |
胞间连丝 |
NbGSL5 |
Niben261Chr05g1092001 |
5871 |
1956 |
225.19 |
9.23 |
胞间连丝 |
NbGSL6 |
Niben261Chr06g0616013 |
5421 |
1806 |
206.98 |
8.94 |
胞间连丝 |
NbGSL7 |
Niben261Chr09g0663013 |
5736 |
1911 |
220.45 |
9.18 |
胞间连丝 |
NbGSL8 |
Niben261Chr11g0086021 |
5226 |
1741 |
202.72 |
9.17 |
胞间连丝 |
NbGSL9 |
Niben261Chr12g0745001 |
5694 |
1897 |
220.53 |
8.95 |
胞间连丝 |
NbGSL10 |
Niben261Chr15g0136001 |
6411 |
2136 |
243.90 |
9.09 |
胞间连丝 |
NbGSL11 |
Niben261Chr18g0196001 |
5964 |
1987 |
227.96 |
8.31 |
胞间连丝 |
NbGSL12 |
Niben261Chr18g0196002 |
5880 |
1959 |
226.59 |
9.13 |
胞间连丝 |
3.2. 基因结构与保守结构域分析
NbGSLs基因家族鉴定到的12个成员的基因结构并非都属于断裂基因，NbGSL1基因不含内含子(图2)。成员间的基因长度也表现出大小不一的特点，最短可达5305 bp (NbGSL8)，最长可达64068 bp (NbGSL11)，相差近12倍。除去NbGSL1与NbGSL8只含有1、2个外显子的特殊情况，其他10位成员外显子数量浮动在31~49之间，平均含有约41个外显子，CDS编码区并未因基因序列长度、外显子与内含子数量上的差异而产生较大变化。蛋白保守结构域分析结果指出，所有成员都具备葡聚糖合酶结构域与FKS1结构域，除NbGSL1、NbGSL6、NbGSL8、NbGSL11四个蛋白外，其余成员皆包含Vta1结构域，后者占比60%。整体上看，该基因家族成员编码的蛋白在进化过程中保守性较强。
Figure 2. Gene structure and conserved domains of the NbGSLs genes in Nicotiana benthamiana
图2. 本氏烟NbGSLs基因结构与保守结构域
3.3. 系统发育分析
拟南芥与水稻两种模式植物的GSLs基因家族已被鉴定，将本氏烟NbGSLs家族成员蛋白序列与拟南芥AtGSLs、水稻OsGSLs家族成员的蛋白序列构建系统发育树，可进一步探索本氏烟NbGSLs家族成员与其他物种同源基因进化上的关系，并可通过在拟南芥、水稻中已报道的基因功能来预测在本氏烟中同源基因的功能(图3(a))。
NbGSL10是拟南芥AtGSL2与水稻OsGSL5的同源基因，推测NbGSL10在维持减数分裂的正常运行过程中不可或缺，其功能缺失也可能会造成花粉败育、雄性不育等。在拟南芥中已报道AtGSL7在韧皮部特异性表达，负责调控韧皮部胼胝质的合成，参与损伤应激等多种生理过程[10]。序列比对结果推测NbGSL2与NbGSL9可能也在韧皮部的生长发育和创伤应激等反应中发挥作用。
3.4. 共线性分析
共线性分析是揭示基因家族成员间进化关系的重要手段，有助于理解基因复制事件及其在物种进化过程中的作用。为探索NbGSLs家族基因复制模式，我们进行了共线性分析(图3(b))。结果表明，NbGSLs基因家族12个基因中有2个基因(NbGSL11、NbGSL12)为串联重复序列(Tandem duplication)。此外，我们发现6个NbGSLs基因在5条染色体(Chr1、Chr5、Chr9、Chr11和Chr12)上存在片段重复(Segmental duplication)，存在3个显著的共线性对，表明分别是NbGSL1与NbGSL8、NbGSL2与NbGSL9、NbGSL5与NbGSL7。这些成对的基因可能来源于同一祖先基因，经过物种形成过程中的基因复制事件，保留了相似的基因序列，这或许暗示它们在功能上的潜在冗余或分化，成对的基因可能在植物的发育或应对环境压力具有协同作用，但不一定都在某个组织或某个细胞内都表达，可能因细胞分化而产生组织特异性表达的现象。
为进一步分析本氏烟NbGSLs基因家族与其他物种的进化关系，我们选择了同为双子叶的拟南芥为对象，分析了NbGSLs与拟南芥AtGSLs两个物种间的共线性关系(图3(c))：NbGSL1与AtGSL5 (AT4G03550)、NbGSL3与AtGSL4 (AT3G14570)、NbGSL8与AtGSL5 (AT4G03550)。有趣的是，NbGSL1与NbGSL8不仅在物种内呈现共线性，还在与拟南芥AtGSL5呈现物种间的共线性，这或许暗示它们在进化上源自相同的祖先。
注：(a) 水稻、拟南芥、本氏烟GSLs家族系统发育树；(b) 本氏烟NbGSLs基因家族物种内共线性分析；(c) 本氏烟与拟南芥GSLs家族物种内共线性分析。
Figure 3. Phylogenetic analysis and synteny analysis
图3. 系统发育分析与共线性分析
3.5. 顺式作用元件鉴定与分析
顺式作用元件作为基因的侧翼序列，配合转录激活因子、抑制因子等反式作用因子，在调控基因本底水平、抑制或高表达等方面至关重要，调控元件并非都位于转录起始位点(Tanscription Start Sites, TSS)上游，属于核心启动子的十基序元件(Motif Ten Element, MTE)与下游启动子元件(Downstream Promoter Element, DPE)都位于TSS下游[27]。为了避免忽略TSS下游的调控元件，我们抓取了12个NbGSLs家族成员ATG上游2000 bp序列，并提交至PlantCARE分析元件类型。在剔除了增强子、常见的核心启动子与光响应元件后，最终筛选得到20个元件，主要分为激素应答元件、逆境胁迫应答元件与生长发育元件，部分元件具有交叉反应(图4)。
Figure 4. Analysis of cis acting elements in members of the NbGSLs gene family of Nicotiana benthamiana
图4. 本氏烟NbGSLs基因家族成员顺式作用元件分析
10种激素应答元件中，CGTCA-motif、TGACG-motif参与茉莉酸甲酯信号通路；SARE、TCA-element参与水杨酸信号通路；ABRE参与脱落酸信号通路；P-box、TATC-box、GARE-motif参与赤霉素信号通路；TGA-element、AuxRR-core参与生长素信号通路；水杨酸、茉莉酸甲酯与脱落酸是常见的逆境胁迫激素[28]。在非生物和生物胁迫下，植物经常引发胼胝质的积累，这个过程在几秒钟内发生[1]，聚焦于胼胝质在胁迫中的作用，观察到除NbGSL4外，其余9位成员皆有水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸应答元件，且数量最多是NbGSL2 (9个)与NbGSL11 (10个)。植物在长期进化中已经形成了一套有体系的响应机制来应对各式各样的胁迫条件。TC-rich repeats参与防御和应激反应，ARE为厌氧胁迫下的应答元件，GC-motif应答缺氧胁迫，而MBS与LTR分别参与干旱与低温胁迫的响应。5种参与生长发育的调控元件共同确保了植物生理稳态的正常运作，它们涵盖了细胞周期的精细调控、近似昼夜节奏的精确控制，以及对初生代谢与次生代谢过程的有效调节。CAT-box为分生组织基因表达相关元件，GCN4-motif参与胚乳中相关基因表达，circadian参与昼夜节律控制，MSA-like参与细胞周期调控，MBSI则参与黄酮的生物合成。在开花植物中，胼胝质对于细胞分裂不可或缺[29]，胼胝质在花药中的出现是减数分裂开始的显著组织学标志[12]。
分析基因上游调控元件能够得知该基因能够响应哪些信号的刺激，进而推测该基因是否参与发育、胁迫或细胞周期等过程。
3.6. NbGSL2基因克隆与序列分析
考虑到NbGSL2与NbGSL9存在共线性关系，两条序列一致性高达93.79%，且在起始与终止密码子处都保持高相似度，这为克隆NbGSL2带来了困难。为了解决这个问题，我们经TBtools通过基因组注释文件抓取了NbGSL2、NbGSL9终止密码子下游200 bp的UTR序列，通过对UTR的序列比对寻找靶点，成功设计了特异性引物对NbGSL2-F/NbGSL2-R，并以本氏烟cDNA为模版克隆到NbGSL2 (图5)，经单克隆菌液测序后得到其CDS全长5727 bp，编码1908个氨基酸。这与前文对基因组中抓取的NbGSL2参考序列有所出入，克隆序列CDS较参考序列缺少57 bp，相应缺少19个氨基酸。对两者序列进行比对可以发现，在参考序列的852~935 bp与4218~4386 bp两处序列在基因组注释文件中被标注为外显子，而实际克隆序列中则是未被剪接上的内含子(图6)。另有一处则与之相反，克隆序列1203~1298 bp区段实为外显子，但并不存在于参考序列上，被误注释为内含子。NbGSL2的成功克隆为本氏烟基因组注释文件的修正与完善提供了数据支撑。
注：M：DL 8000 DNA Marker；NbGSL2：NbGSL2目的片段扩增产物。
Figure 5. Amplification of the full-length cDNA sequence of NbGSL2 genes
图5. NbGSL2基因cDNA全长序列扩增
3.7. NbGSL2理化性质与亲疏水性分析
使用Expasy分析NbGSL2克隆序列的氨基酸理化性质，蛋白分子式C10148H15637N2671O2772S81，相对分子质量222.01 kD。正、负电荷氨基酸数量分别为233个、213个，等电点pI为8.85，蛋白呈碱性。不稳定指数计算为39.29 (<40)，表明NbGSL2属于稳定蛋白。脂肪族指数92.46，亲水性平均系数为−0.131，表明蛋白具有较高的疏水性与具有一定的亲水性，可能与脂质相互作用或在细胞膜中稳定存在。跨膜结构预测表明NbGSL2具有14个跨膜结构(图7(a))。亚细胞定位预测结果与参考序列预测结果一致，仍旧定位于胞间连丝。NCBI CD-Search表明，NbGSL2克隆序列存在β-1,3-葡聚糖合酶、FKS1与Vta1三个结构域，这与参考序列预测一致(图7(c))。综合分析表明NbGSL2在很大程度上是定位在胞间连丝处的跨膜蛋白。
3.8. NbGSL2蛋白二级、三级结构预测
水孔蛋白是一类通常形成四聚体以行使其转运水或甘油等物质的跨膜蛋白，每个亚基上具有6个α-螺旋[30]。为更好地表征NbGSL2跨膜性质，我们通过预测NbGSL2的二级结构，同时对其三级结构进行同源建模，以期能从三维结构角度分析其属性，对其属于跨膜蛋白的理论依据提供进一步的数据支撑。
通过SOPMA预测NbGSL2蛋白二级结构，结果显示NbGSL2存在α-螺旋、无规则卷曲、延伸链3种二级结构，不存在β-折叠(图7(b))。其中有1264个氨基酸参与α-螺旋(占比66.25%)，564个氨基酸参与无规则卷曲(占比29.56%)，80个氨基酸参与延伸链(占比4.19%)，推测NbGSL2存在大量的α-螺旋可能是其在胞间连丝处作为跨膜蛋白的结构基础。
蛋白的结构与其功能相适应，通过SWISS-MODEL对NbGSL2蛋白空间结构进行同源建模以期获得其高级结构(图7(d))，以AlphaFold v2算法匹配度最高的模型蛋白为拟南芥AtGSL7 (一致性73.21%)，GMQE为0.80表明模型具有较高的预测质量。NbGSL2三级结构中存在大量α-螺旋，图中所示其结构底部能观察到明显的无规则卷曲，这与二级结构预测结果吻合。此外，匹配上拟南芥AtGSL7蛋白模型也与系统发育树中AtGSL7、NbGSL2在进化上呈现高度亲缘性结果一致。
4. 总结与讨论
本研究首次系统鉴定了本氏烟(Nicotiana benthamiana)胼胝质合酶NbGSLs基因家族成员。本氏烟作
Figure 6. Comparison of NbGSL2 reference sequence and clone sequence
图6. NbGSL2参考序列与克隆序列比对
为重要的模式植物，在植物生理学与病理学研究中具有广泛应用，胼胝质又在植物细胞的物理防御的建立过程中发挥着举足轻重的作用。然而，本氏烟中胼胝质合酶基因家族尚未得到系统鉴定。本研究基于生物信息学技术，共鉴定12个NbGSLs基因，其染色体分布、基因结构及保守结构域特征揭示了该家族在茄科植物中的独特进化轨迹，填补了本氏烟中胼胝质合酶基因家族研究的空白。
NbGSLs家族成员分布于9条染色体，其中Chr1和Chr18呈现基因簇分布，暗示染色体片段重组可能在家族扩张中起关键作用。基因结构分析显示，除NbGSL1外，其余成员均含多个内含子(31~49个)，断裂基因结构存在一定的复杂性。所有NbGSLs蛋白均携带β-1,3-葡聚糖合酶与FKS1结构域，其跨膜拓扑特征与纤维素合酶高度相似，印证了胼胝质合酶功能的进化保守性。值得注意的是，66.7%的成员额外
注：(a) NbGSL2蛋白疏水性分析；(b) NbGSL2二级结构；(c) NbGSL2保守结构域；(d) NbGSL2三级结构。
Figure 7. Analysis of hydrophobicity, conserved domains, secondary and tertiary structures of NbGSL2 protein
图7. NbGSL2蛋白疏水性、保守结构域、二级结构与三级结构分析
含有Vta1结构域，该结构域在其他物种中多与囊泡运输相关[29]，结合所有成员被预测定位于胞间连丝的可能性，暗示了本氏烟NbGSLs蛋白在胞间连丝调控中的独特机制。
通过系统发育树分析，我们发现NbGSLs基因家族与拟南芥AtGSLs和水稻OsGSLs基因家族存在显著的进化关系，这为预测本氏烟中NbGSLs基因的功能提供了重要线索。在共线性分析方面，我们发现了两个重要的现象。首先，NbGSLs基因家族中存在2个串联重复序列(NbGSL11、NbGSL12)，这表明在物种进化过程中，这些基因可能经历了基因复制事件，从而保留了相似的基因序列。此外，我们还发现6个NbGSLs基因在5条染色体上存在片段重复，形成了3个显著的共线性对(NbGSL1与NbGSL8、NbGSL2与NbGSL9、NbGSL5与NbGSL7)。这些成对的基因可能来源于同一祖先基因，暗示基因复制是植物适应复杂环境的重要进化策略。这种共线性关系不仅揭示了基因家族成员间的进化关系，也为我们理解基因复制事件及其在物种进化过程中的作用提供了新的视角。基因上游调控区富集ABRE、MBS等12类逆境响应元件，进一步支持NbGSLs在各类胁迫应答中的潜在作用，这与在其他物种中报道GSL参与高温响应和生物胁迫等应答反应相呼应[9] [11] [18]。
值得注意的是，NbGSL2的成功克隆及其与拟南芥韧皮部特异性表达基因AtGSL7的系统发育同源性，为解析本氏烟韧皮部的发育机制提供了新线索。克隆序列与基因组注释的差异直接揭示了当前本氏烟基因组数据库的局限性，为后续注释修正提供了实验证据。蛋白结构分析表明，NbGSL2具有14个跨膜结构域和66.25%的α-螺旋，与其作为膜定位胼胝质合酶的功能特性高度吻合。与拟南芥AtGSL7结构一致性达73.21%，结合系统发育同源性结果，共同支持了NbGSL2参与韧皮部胼胝质沉积调控的可能性。
本研究首次绘制了本氏烟GSL基因家族的功能图谱，其成果具有三重意义：在理论层面，通过比较基因组学揭示了NbGSLs在进化中的复制与分化规律，为理解植物胼胝质合酶家族的功能演化提供了新视角；在技术层面，NbGSL2的成功克隆及注释误差的发现，凸显了验证工作对基因组注释的重要性，为茄科植物基因功能研究提供了方法论参考；在应用层面，鉴定到的逆境响应元件与共线性基因对(如NbGSL2/AtGSL7)，可作为关键靶点用于作物抗逆育种或韧皮部运输改良。未来研究可进一步结合CRISPR/Cas9技术与时空表达谱分析，深入解析NbGSL2基因功能。这些工作将有助于完善植物胼胝质合成调控网络，为作物抗逆育种提供新的分子靶点。