1. 引言
1.1. 研究背景
RNA剪接是真核生物基因表达过程中的一个关键步骤，主要是转录后的前体mRNA (pre-mRNA)通过内含子的切除和外显子的连接，最终生成成熟的信使RNA (mRNA)。这一过程对于基因表达的精确调控至关重要，因为它不仅可以通过选择性剪接增加基因编码蛋白质的多样性，还在细胞分化和发育过程中发挥重要作用。近年来，随着分子生物学技术的进步，RNA剪接的分子机制及其在疾病中的作用逐渐被揭露。
RNA剪接的精确性和多样性受到多种因素的调控，这些因素包括剪接位点的序列特异性、剪接体的组成与功能，以及多种顺式作用元件和反式作用因子的协同作用。RNA剪接主要由剪接体催化完成，剪接体是一个复杂的分子机器，由多种小核糖核蛋白颗粒(snRNPs)和辅助蛋白组成。它通过识别pre-mRNA的剪接位点(5'剪接位点的GT序列、3'剪接位点的AG序列和分支点)，催化两个转酯反应，将内含子切除并将外显子连接起来[1]。外显子剪接增强子(ESE)和外显子剪接沉默子(ESS)等顺式作用元件也通过与剪接体相关蛋白的相互作用，调节剪接的效率和选择性。反式作用因子，包括剪接因子(如SF1、U1 snRNP等)和RNA结合蛋白(如SR蛋白家族和hnRNP蛋白家族)，通过与顺式作用元件结合，调节剪接位点的选择和剪接反应的进程。
剪接相关基因突变可以通过影响剪接位点和/或剪接调控元件从而导致异常剪接，产生截短蛋白或功能异常的蛋白质，从而引发遗传性疾病。近年来，随着基因测序技术的发展，越来越多的剪接相关突变被鉴定出来，为疾病的诊断和治疗提供了新的靶点。
aHUS，又称非典型溶血尿毒综合征，其临床特征包括微血管性溶血性贫血，血小板减少以及急性肾损伤[2]。临床上主要表现为贫血、血小板减少、LDH升高、间接胆红素升高、肾功能异常(血尿、蛋白尿、肌酐升高等)，当疾病累及其他器官时可以出现对应症状，如累及胃肠道时出现腹痛、恶心、呕吐，累及神经系统时出现意识障碍、感觉异常，累及心血管系统时出现心肌缺血等。目前这一疾病的诊断需排除TTP及其他继发因素[2]。
aHUS的发病机制与补体系统的异常激活有关，约有50%的患者存在补体相关基因的突变。目前已知与aHUS的发生有关的基因包括CFH、CFI、CD46、CFB、C3、THBD、DGKE、CFHR基因。其中CFI基因突变约占所有aHUS患者的5%~10%。CFI介导的aHUS的发生率为百万分之1 [3]。
CFI基因位于染色体4q25上，全长61 kb，由13个外显子组成，编码一种含有583个氨基酸的丝氨酸蛋白酶[3] [4]。FI主要由肝细胞合成和分泌，在多种细胞中表达，包括肝细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞和成纤维细胞，参与补体级联反应[5] [6]。它的前蛋白被切割成分子量为38 kDa和50 kDa的轻链和重链，其中轻链在与辅因子–底物结合之前，其活性位点被重链抑制[7]。只有在辅因子、底物共同存在的情况下，这两条链通过二硫键结合形成异二聚体糖蛋白。它通过切割补体C3b和C4b，使其失活，进而影响C3和C5转化酶的形成，从而调节补体经典、凝集素和替代途径[4]。FI及其液相和膜结合辅因子共同控制循环及细胞表面的补体，保护自身细胞和细胞外膜免受补体激活的影响[3]。
aHUS患者很容易进展至终末期肾病，严重时可危及生命。研究表明有65%的患者出现肾脏损伤，并进展成为晚期肾病，或在诊断后1年内死亡[2]。目前的治疗方案主要是血浆置换和依库珠单抗，但研究表明接受血浆置换治疗的患者，其进展成ESRD和死亡的风险并未减少。在携带CFI突变的患者中，血浆置换的治疗成功率更是低至25% [8] [9]。aHUS患者的肾移植结果较差，40%至70%的患者接受肾移植后发生aHUS复发[3]。因此开发基于补体基因突变的新型治疗方案是未来的研究方向。我们的研究目的是通过生物信息学工具筛选CFI基因突变，通过迷你基因验证其是否影响pre-mRNA的剪接过程，为未来的基因治疗提供新的研究靶点。
1.2. 实验方法
1.2.1. 基因突变的筛选与预测
在人类基因突变数据库(HGMD)和Clinvar数据库(于2024年6月访问)中描述的所有aHUS相关变异中，有207个错义突变或无义突变，12个剪接位点突变，10个小缺失，6个小插入，6个严重缺失。我们注意到错义突变和无义突变占所有突变的86% (207/241)。在本次实验中，我们对HGMD和Clinvar数据库中报告的变异进行了生物信息学分析，并选择了其中7个变异进行迷你基因检测和初步的功能预测。
根据以下标准选择可能的有害变异：
1. 突变位于外显子的5'端或3'端附近。内含子的位置(不包括第一个和最后一个内含子)位于相邻外显子的20 bp范围内，除外GT/AG经典剪接位点。
2. 突变可能导致形成一个新的剪接位点或激活一个隐性剪接位点。
3. 经典剪接位点的预测值发生显著变化。(BDGP评分下降 > 0.2或Mobidetail评分 > 0.2)
对基因突变的命名方式遵循了人类基因组变异学会(http://varnomen.hgvs.org)的标准。根据CFI (NC_000004.12)的cDNA序列进行DNA突变编号。为了评估错义变体对剪接位点的潜在影响，我们采用了由在线生物信息学工具分析的预测软件，以评估它们对前mRNA处理的影响。预测结果见表1。
- Human Splicing Finder (HSF)：用于确定剪接调控序列的存在，并评估剪接调控基序(ESAs/ESSs)变异的潜在影响。
- BDGP和Mobidetails：用于预测突变对经典剪接位点的影响以及新剪接位点的产生或激活，尤其是外显子5'或3'端附近的突变。
- SnapGene：对于经实验验证可改变外显子剪接的位点，我们利用该软件对阅读框变化和随后的蛋白质缺陷进行预测分析。
- VulExMap：用于生成CFI基因的外显子图谱，评估容易发生剪接突变的替代外显子。
- DEEPCLIP：用于预测RNA与剪接相关的RNA结合蛋白(如hnRNPA1和SRSF1)的结合情况。
1.2.2. 迷你基因的构建与定点诱变
本研究通过PCR扩增技术，利用特异性寡核苷酸引物，扩增出包含目标外显子的DNA片段，其两侧分别带有约50-200个碱基的不完整的内含子序列。这些引物设计时引入了XhoI和NheI限制性酶切位点(XhoI: CCGCCTCGAG; NheI: CTAG^CTAGC)，以便将DNA片段克隆至剪接载体pSPL3，见图1。引物序列通过Primer BLAST程序设计，具体序列详见附表1。
随后，使用1 μL T4 DNA连接酶(Takara, Japan)，在16℃条件下将空载载体与DNA片段连接，并转化至DH5α感受态大肠杆菌细胞。将200 μL转化后的细菌悬浮液均匀涂布于含有氨苄青霉素的Luria-Bertani固体琼脂平板上，于37℃培养14小时。通过正向和反向引物对阳性克隆进行测序，并利用SnapGene软件进行序列比对分析。最终，采用Pure Plasmid Mini Kit (Cwbio, China)提取单克隆菌落中的质粒。
1.2.3. HEK 293T细胞的转染
随后将人胚肾293T (HEK 293T)细胞在含有DMEM培养基、10%胎牛血清(FBS)、100 U/L青霉素和100 mg/L链霉素的培养液中培养，置于37℃、5% CO2培养箱中。随后将细胞转移至12孔培养板，当细胞在无抗生素培养基中生长至70%~80%后，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)按照说明书进行转染，分别转染空载体(pSPL3-control, EV)、野生型(pSPL3-WT)和突变型(pSPL3-Mutation)迷你基因。转染48小时后，使用TRIzol试剂(Invitrogen, USA)提取总RNA，并利用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Japan)进行逆转录PCR(RT-PCR)以合成cDNA。用引物SD6 (正向引物5'-TCTGAGTCACCTGGACAACC-3')和SA2(反向引物5'-ATCTCAGTGGTATTTGTGAGC-3')对cDNA序列进行扩增。最终，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物并测序，并使用ImageJ软件对各条带进行定量分析。异常剪接百分率通过公式(下带密度/(下带密度 + 上带密度)) × 100%计算得出。
利用SnapGene软件将实验中获得的基因序列与GenBank数据库中公布的参考序列进行比对分析。若HEK 293T和Hela细胞中的剪接模式与野生型迷你基因存在差异，则认为该变异对剪接过程产生了影响。
将目的外显子的野生型和突变型片段通过Pspl3载体的Xho1和Nhe1位点连接到载体上，形成野生型和突变型Pspl3质粒。
Figure 1. Mechanism of mini-gene construction plasmid
图1. 迷你基因构建质粒的机制
2. 结果
2.1. 迷你基因实验结果
我们通过计算机软件对Clinvar数据库中CFI的基因突变进行了分析，以预测它们对剪接的可能影响，具体数据如表1。值得注意的是，我们筛选出的7个突变中，只有一个(c.772G>A)具有致病性。一个突变(c.804G>A)的预测结果相互矛盾，它被证实为同义突变，BDGP和HSF都认为该突变可能影响剪接，然而Clinvar数据库将其分类为良性的。
Table 1. Screened CFI gene mutations and their predicted results
表1. 筛选出的CFI基因突变及其预测结果
突变 |
位置 |
蛋白改变 |
BDGP评分 |
Mobi detail |
HSF |
Clinvar |
c.482+6C>T |
内含子4 |
- |
0.36 → 0.83 |
0.40DG |
No significant impact on splicing signals |
Benign |
c.482+6C>A |
内含子4 |
- |
0.36 → 0.15 |
0.25DL |
New Acceptor splice site: Activation of a cryptic Acceptor site. Potential alteration of splicing (HSF) |
Benign/Likely benign |
c.482+8C>T |
内含子4 |
- |
0.36 → 0.16 |
0.36DG |
No significant impact on splicing signals |
Benign |
c.772G>A |
外显子5 |
(p.Ala258Thr) |
0..72 → 0 |
0.81DL |
Broken WT Donor Site; most probably affecting splicing |
Pathogenic/Likely pathogenic |
c.773-3C>T |
内含子6 |
- |
0.43 → 0.49 |
0.27AL |
No significant impact on splicing signals |
Uncertain significance |
c.804G>A |
外显子6 |
(p.Ser268=) |
0.89 → 0.19 |
0.17AL |
New Acceptor splice site: Activation of a cryptic Acceptor site. Potential alteration of splicing |
Benign |
c.1534+5G>T |
内含子13 |
- |
1 → 0.88
(0.9新) |
0.28DG |
No significant impact on splicing signals |
Benign/Likely benign |
迷你基因实验结果显示野生型3号外显子的PCR显示有一个154 bp的条带，包括SD6和SA2和3号外显子的全部序列。位于4号内含子上的c.482+6C>T突变使得5'剪接位点的BDGP评分从0.36上升至0.83,。HSF则预测该突变对剪接并无影响。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)显示该突变的迷你基因存在一个154 bp的条带。测序结果表明，其包括引物SD6、SA2和3号外显子的序列，与野生型的结果一致，这与HSF预测的剪接信号无变化相符。见图2A。
Figure 2. Gel electrophoresis results of CFI gene mutations
图2. CFI基因突变凝胶电泳结果
c.482+6C>A同样是位于4号内含子上的突变，它使得5'剪接位点的BDGP评分从0.36下降至0.15。HSF预测该突变可以导致新的受体剪接位点的激活，可能会影响剪接过程。测序结果显示该突变型与野生型产物没有差异，都是包含SD6和SA2和3号外显子的全部序列，长为154 bp。见图2A。
c.482+8C>T也是位于4号内含子上的突变，BDGP预测5'剪接位点的评分从0.36下降至0.16。然而HSF预测该突变对剪接并无影响。PCR结果显示该突变型和野生型的条带分子量大致相同，测序结果显示该突变同野生型测序结果一致，为阴性结果。见图2A。
5号外显子的PCR结果显示有两个不同的电泳条带，表明存在成熟的mRNA和一个缺少第5号外显子的缺陷mRNA，异常剪接百分率为28.9% (96,328/333,564)，如图2B。c.772G>A位于5号外显子上，该突变使得5'剪接位点的BDGP评分从0.72下降至0。HSF预测该突变会破坏野生型的剪接供体位点，很大概率影响剪接过程。PCR结果证实了这一点。野生型的PCR产物为长114 bp的条带，包含SD6、SA2和5号外显子序列。而突变型的PCR产物则显示存在单剪接异常产物，5号外显子完全跳变。见图2B。
位于6号内含子上的c.773-3C>T经BDGP预测可能会导致3'剪接位点评分由0.43上升至0.49。同时6号外显子上距离3'剪接位点67 bp的位置其评分为0.82。HSF则预测该突变对剪接过程无影响，PCR结果证实了HSF的预测结果。突变体同野生型产物相同，均包含SD6、SA2和6号外显子序列，这提示这一突变并未影响剪接过程，是阴性结果。见图2C。
c.804G>A是位于6号外显子上的同义突变，两种生物信息学工具均预测其具有致病性，BDGP预测该突变使得5'剪接位点评分从0.89下降至0.19，HSF预测该突变会导致潜在的受体位点的激活，可能对剪接过程产生影响。然而Clinvar将该位点分类成良性突变。PCR结果显示其突变型产物同野生型产物分子量一致，均为包含SD6、SA2和6号外显子的基因序列。见图2C。
c.1534+5G>T则是位于13号内含子上的突变，HSF预测其对剪接过程并无显著影响。BDGP预测典型5'位点评分从1下降至0.88，同时激活了一个新的剪接位点，位于，评分为0.9。测序结果显示该突变产生的条带同野生型一致，均为包含SD6、SA2和13号外显子的长为368bp的序列。见图2D。
2.2. ValexMap软件预测结果
VulexMap是一款专为基因组剪切调控研究设计的生物信息学可视化工具，该软件通过整合基因组坐标信息、剪接位点评分及表观遗传注释，生成基因图谱。该软件将外显子分为三种类型：脆弱外显子、弹性外显子、替代外显子。据该软件预测，CFI基因的3号、5号、6号、12号外显子均为脆弱外显子，这表明这些外显子上的基因变异对前mRNA剪接造成影响的可能性为中等。见图3。
Figure 3. Exon map predicted by VulexMap
图3. VulexMap预测外显子图谱
2.3. DEEPCLIP软件预测结果
DEEPCLIP是一种解析RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)与RNA分子之间的相互作用位点及调控机制的生物信息学工具。本次研究中我们选择了目前公认剪接相关的RNA结合蛋白(SRSF1和hnRNP)两种模型，预测了筛选出的7个突变在剪接过程与这两种蛋白结合的可能性，见表2。
Table 2. Prediction results from DEEPCLIP
表2. DEEPCLIP预测结果
突变 |
SRSF1 |
hnRNP |
c.482+6C>T |
0.516 |
0.391 |
c.482+6C>A |
0.516 |
0.391 |
c.482+8C>T |
0.516 |
0.391 |
c.772G>A |
0.194 |
0.559 |
c.773-3C>T |
0.128 |
0.081 |
c.804G>A |
0.172 |
0.064 |
c.1534+5G>T |
0.699 |
0.215 |
A第一条泳道为marker；第二条为HEK293T细胞空载质粒结果；第三条为HEK293T细胞CFI基因的3号外显子；第四、五、六条分别为HEK293T细胞中c.482+6C>A、c.482+6C>T、c.482+8C>T的结果。B第一条泳道为marker；第二条为HEK293T细胞空载质粒结果；第三条为HEK293T细胞CFI基因的5号外显子；第四条为HEK293T细胞中c.772G>A的结果。C第一条泳道为marker；第二条为HEK293T细胞空载质粒结果；第三条为HEK293T细胞CFI基因的6号外显子；第四、五条分别为HEK293T细胞中c.773-3C>T、c.804G>A的结果。D第一条泳道为marker；第二条为HEK293T细胞空载质粒结果；第三条为HEK293T细胞CFI基因的12号外显子；第四条为HEK293T细胞中c.1534+5G>T的结果。
3. 讨论
3.1. 选择性剪接
前体mRNA的选择性剪接在基因表达和编码蛋白质的多样性中起着关键作用，而人类具有最大程度的选择性剪接[10] [11]。至少70%的基因通过外显子的选择性剪接表达多种mRNA，这极大地扩展了转录组的信息量[12] [13]。通过选择性剪接，可以产生外显子跳跃、内含子保留等剪接异常事件。目前研究表明约有三分之一的选择性剪接引入了过早终止密码子(PTC)，从而通过无义介导的衰变(NMD)使mRNA降解。这种错误可能会导致疾病发生[10]。然而大多数基因仅表达一种转录本，这说明相当一部分选择性剪接产物只是发生了剪接水平上的改变，而并没有影响蛋白质的编码[14]。
目前研究表明发生选择性剪接的外显子长度多为3n，这导致剪接过程中跳过或包含此外显子不会导致阅读框偏移[15]。同时外显子的跳跃还与较弱的5'和3'剪接位点显著相关[15]。本实验中发生选择性剪接的5号外显子，长度为114 bp，为3的倍数，其跳跃不会引起转录过程移码突变，这与上述结论相符合。其3'剪接位点的BDGP评分为0.94，评分较高，而5'剪接位点的评分为0.74，评分较低。这些特点表明CFI基因的5号外显子已发生剪接突变。
VulexMap预测CFI基因3、5、6、12号外显子均为脆弱外显子，其上发生的突变较易对剪接过程产生影响。而7号外显子被预测为替代外显子，极易发生剪接突变。研究表明外显子的脆弱性由许多因素决定，例如ESE数量少、GC含量低以及外显子两侧的内含子较长，会使外显子更容易发生剪接突变[16]。目前研究表明内含子平均长度约3365 bp，而外显子的GC含量平均约41% [17]。我们发现CFI基因的7号外显子的GC含量为48%。其上游内含子长度2486 bp，下游内含子5259 bp。这一外显子的GC含量偏高，下游内含子长度偏大，均为较易发生剪接突变的影响因素。可惜的是，我们的实验并未筛选出7号外显子上的基因突变，没有通过实验验证这一基因是否容易发生剪接突变。
3.2. 外显子突变
外显子上的突变通常被认为对开放阅读框和蛋白质功能造成影响，然而越来越多的研究发现，外显子基因突变也可影响剪接过程。本实验中研究了两个外显子突变，其中c.772G>A使得对应的编码氨基酸的密码子由GCA变成ACA，对应编码的氨基酸由丙氨酸变成苏氨酸。而我们的迷你基因实验显示该突变导致5号外显子的全部跳跃，这导致114 bp的碱基缺失，不造成移码突变，但对蛋白质结构有显著影响。这可能是由于该突变位于5号外显子的最后一个碱基，该位置的突变很大可能影响典型剪接位点，从而导致剪接过程的改变。生物信息学软件的预测结果证实了这一可能。HSF预测该突变会导致野生型供体位点(Donor Site)的破坏。BDGP预测该位点会导致5'剪接位点评分显著下降，从0.72下降至0，这一评分的改变也暗示了该突变可能使剪接体对典型剪接位点的识别降低，从而导致外显子剪接跳跃。
c.804G>A突变是使得密码子由AGC变成AGU，这两种密码子对应编码的氨基酸均为丝氨酸，这证明该突变是同义突变。同义突变虽然不造成氨基酸的变化，但其可能通过影响密码子最优性而改变翻译延伸率和对应的mRNA的稳定性[12] [18]。同时研究证明，密码子周围环境对局部翻译速率同样有影响[19]。同时外显子剪接增强子和沉默子位于外显子上，负责调控剪接体对剪接位点的识别，当其发生同义突变时，将会影响剪接位点的识别[20] [21]。因此同义突变虽不改变氨基酸序列，但其对mRNA的稳定性及剪接位点识别的潜在影响仍能影响剪接过程。本实验中c.804G>A突变位于6号外显子上距离3'剪接位点32 bp、距5'剪接位点79 bp的位置上，BDGP分析该突变使得典型的5'剪接位点评分从0.89下降至0.19。而HSF预测该突变会导致一个潜在的受体位点的激活，改变剪接体对剪接位点的识别。而本次实验证实该突变产生的条带与野生型条带分子量基本一致，测序结果显示该突变为阴性结果，并未产生外显子突变。这也意味着该突变所在的位置并不是剪接调节因子如ESE、ESS等的位置。而HSF预测结果证实了该突变并未造成ESS和ESE的改变。
3.3. 剪接调控元件
前体mRNA生成成熟mRNA的过程十分复杂，涉及对内含子和外显子边界的精准识别与结合，这一过程需要许多剪接调控元件的参与。剪接调控元件包括顺式作用元件和反式作用因子，如外显子剪接增强子/沉默子、内含子剪接增强子/沉默子[22]。其中ESE和ISE，富含嘌呤序列，可以通过招募SR蛋白促进剪接体识别外显子，而ESS和ISS则富含嘧啶或特定序列(如UAGG)，可以通过与hnRNP蛋白结合抑制非经典剪接位点的识别[23]-[27]。而分支位点和多嘧啶区在内含子3'端剪接中起到关键作用，其中分支位点一般位于内含子3'端上游20~50 bp [28]。这些序列的变异可能破坏了剪接因子结合或改变了RNA的二级结构，从而导致异常剪接事件的发生，进而导致蛋白质功能缺陷。
DEEPCLIP是一种解析RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)与RNA分子之间的相互作用位点及调控机制的生物信息学工具[16] [29]。我们应用目前公认与剪接相关的RNA结合蛋白(SRSF1和hnRNP)两种模型预测了筛选出的CFI基因突变，其中c.772G>A这一突变的hnRNPA1模型的评分是0.559，这表明该突变很大概率影响hnRNPA1和ESS的结合，从而阻止剪接体与剪接位点的结合。迷你基因实验结果显示该突变会导致剪接体对外显子经典剪接位点识别能力下降，外显子完全跳跃，同样支持这一观点。
3.4. 迷你基因实验的优缺点
随着高通量测序技术的发展，单核苷酸变异对前mRNA剪接的影响日益受到关注，这类变异可能通过破坏剪接调控元件(如外显子剪接增强子/沉默子)或形成隐秘剪接位点，导致遗传性疾病的发生。准确区分基因突变的致病机制，对解析蛋白质结构–功能关系及制定精准治疗策略至关重要。尽管直接分析患者RNA被视为评估剪接异常的“金标准”[30] [31]，但其临床应用常受限于样本可及性以及野生型等位基因的共表达干扰(尤其在杂合突变中)。
在此背景下，迷你基因系统成为体外研究剪接突变的重要替代方案。其核心优势体现在三个方面：(1) 无需依赖患者生物样本，通过体外合成目标基因片段即可模拟突变效应；(2) 通过设计仅携带突变等位基因的质粒，可完全规避野生型等位基因的转录干扰；(3) 允许在多种细胞系中验证剪接模式的细胞类型依赖性[32]。
然而，该技术的局限性需谨慎考量。首先，体外转录环境可能无法完全模拟体内mRNA的复杂调控机制：一方面，mRNA二级结构(如G四链体)对剪接因子结合的影响在迷你基因模型中难以重现；另一方面，无义介导衰变(NMD)通路在异常转录本降解中的作用可能被低估，导致对截短蛋白的致病风险预测出现偏差[33]。同时迷你基因构建的内含子可能丢失部分调控序列，从而导致错误的外显子跳跃或内含子保留。本研究中，尽管通过RT-PCR鉴定了异常剪接事件，但未进一步检测补体因子I (CFI)的蛋白表达水平及功能活性。目前研究表明，超过50%的CFI基因突变会分泌异常的蛋白质，但仅有部分会表现出疾病表型[3]。这一数据表明这些剪接突变可能通过剂量效应或显性负效应驱动非典型溶血性尿毒症(aHUS)的发生。后续研究需结合蛋白质印迹实验与补体功能活性检测，以完善病理机制解析。
3.5. 基因治疗
近年来，针对遗传性疾病已经开发出了基因治疗这种新型治疗方法。其中一种方式是，通过合成的反义寡核苷酸(ASOs)与前mRNA的特定序列结合，阻断剪接信号，使剪接机制包含原本被跳过的外显子，从而恢复蛋白质正常的阅读框架。目前反义寡核苷酸药物已被广泛应用于改变体内剪接模式。CRISPR可用于治疗遗传疾病的方式有很多，包括同源定向修复(HDR)介导的基因校正、单碱基对校正、外显子缺失和通过插入和缺失(INDEL)突变的框架校正[34]-[36]。对于引起外显子跳跃的基因突变，Cas9可以引入破坏剪接位点的小插入或缺失突变(indels)，导致外显子包含，恢复正常的剪接模式。
目前，基于外显子包含的基因治疗在多种遗传性疾病中取得了显著进展。例如，Zorevunersen是一款设计用以治疗Dravet综合征的反义寡核苷酸药物，它靶向SCN1A基因。目前研究证明接受Zorevunersen治疗的患者在抽搐性癫痫发作频率上有显著降低[37]。因此针对造成外显子跳跃的基因突变研究新型基因治疗药物是可行的。
尽管基因治疗在遗传性疾病治疗中展现出巨大潜力，但仍面临一些挑战。对于反义寡核苷酸介导的外显子包含，如何提高ASOs的递送效率和特异性，以及如何降低其潜在的免疫原性，是需要解决的问题。对于CRISPR-Cas9介导的基因组编辑，体内递送和非特异性脱靶效应仍然是技术瓶颈[11] [37]。
基因治疗作为一种新兴的治疗策略，在遗传性疾病领域具有广阔的应用前景。通过不断优化治疗技术和深入研究其机制，有望为患者提供更有效的治疗方案，改善其生活质量和预后。
4. 总结
随着单细胞测序技术的发展，未来有望在单细胞水平上解析不同细胞类型和发育阶段的剪接模式，揭示剪接在细胞命运中的作用。同时，开发更高效的剪接调控工具，如基于CRISPR的剪接编辑技术，将为研究RNA剪接的功能和治疗相关疾病提供新的手段。
附表1
野生型 |
上游引物 |
突变型 |
上游引物 |
下游引物 |
下游引物 |
exon3 |
ccgctcgagatagcactgccgctgaca |
c.482+6C>A |
caacagtgagagcttgtatc |
ctagctagcatccagatacttcaacagac |
gatacaagctctcactgttg |
exon3 |
ccgctcgagatagcactgccgctgaca |
c.482+6C>T |
caacagtgagtgcttgtatc |
ctagctagcatccagatacttcaacagac |
gatacaagcactcactgttg |
exon3 |
ccgctcgagatagcactgccgctgaca |
c.482+8C>T |
caacagtgagcgtttgtatcag |
ctagctagcatccagatacttcaacagac |
ctgatacaaacgctcactgttg |
exon5 |
ccgctcgagtcctccccatctcagcaa |
c.772G>A |
ctgtgttgtaaaagtagacata |
ctagctagcgcaaacataagcaggaga |
tatgtctacttttacaacacag |
exon6 |
ccgctcgagtagcctctaaatcctcta |
c.773-3C>T |
tgtttgcatagcatgccaag |
ctagctagcgcaggtggaaaatgggta |
cttggcatgctatgcaaaca |
exon6 |
ccgctcgagtagcctctaaatcctcta |
c.804G>A |
cattgcaaatcaggtgtttgc |
ctagctagcgcaggtggaaaatgggta |
gcaaacacctgatttgcaatg |
exon12 |
ccgctcgagcccttgactatccatcca |
c.1534+5G>T |
gcaggtaattgccaagtggt |
ctagctagcaccttgctgtgctgctat |
accacttggcaattacctgc |