富血小板血浆对大鼠皮瓣成活影响的实验研究

Experimental Study on the Effect of Platelet-Rich Plasma on the Survival of Rat Skin Flaps

摘要: 目的：研究富血小板血浆(PRP)对大鼠皮瓣术后成活情况的影响。方法：选取7~8周龄健康成年SD大鼠18只，其中6只大鼠用于制备PRP，其余12只大鼠按照随机数字表法均分为对照组和PRP注射组，每组6只。2组大鼠均建立背部皮瓣模型。PRP注射组在术中于皮瓣基底部注射PRP，对照组按照相同方法注射等量生理盐水。于术后第5天处死大鼠，拍照计算皮瓣坏死比例；采集皮瓣组织，逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测白介素-1β (IL-1β)、白介素-18 (IL-18)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1 (Caspase-1)的mRNA表达；免疫组化染色评价血管内皮生长因子(VEGF)、CD34表达。结果：在术后第5天，与对照组相比，PRP注射组的皮瓣坏死比例明显减少(P < 0.05)，IL-1β、IL-18、Caspase-1的mRNA表达明显降低(P < 0.05)。VEGF、CD34表达明显增加(P < 0.05)。结论：PRP能有效改善大鼠皮瓣的成活。

Abstract: Objective: To study the effect of platelet-rich plasma (PRP) on the survival of rat skin flaps after surgery. Methods: Eighteen healthy adult Sprague-Dawley (SD) rats aged 7~8 weeks were selected. Six of the rats were used to prepare platelet-rich plasma (PRP). The remaining 12 rats were evenly divided into a control group and a PRP injection group according to the random number table method, with 6 rats in each group. A dorsal skin flap model was established in both groups. In the PRP injection group, PRP was injected into the base of the skin flap during the operation, while in the control group, an equal volume of normal saline was injected in the same way. The rats were sacrificed on the 5th day after the operation. Photos were taken to calculate the necrosis ratio of the skin flaps. Skin flap tissues were collected. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the mRNA expressions of interleukin-1β (IL-1β), interleukin-18 (IL-18), and cysteine-aspartic acid specific protease-1 (Caspase-1). Immunohistochemical staining was used to evaluate the expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and CD34. Results: On the 5^th day after the operation, compared with the control group, the necrosis ratio of the skin flaps in the PRP injection group was significantly reduced (P < 0.05), and the mRNA expressions of interleukin-1β (IL-1β), interleukin-18 (IL-18), and cysteine-aspartic acid specific protease-1 (Caspase-1) were significantly decreased (P < 0.05). The expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and CD34 were significantly increased (P < 0.05). Conclusion: PRP can effectively improve the survival of rat skin flaps.

1. 引言

皮瓣移植是烧伤整形外科的一项重要技术，可有效解决因创伤、肿瘤等产生的体表缺损等问题[1]，然而，皮瓣坏死作为皮瓣移植术后常见的并发症，严重制约了皮瓣手术的临床应用。近年来，随着皮瓣设计的不断完善和各种创新类药物的应用，皮瓣术后的成活率有所提升，但在临床中，皮瓣坏死的情况仍屡见不鲜。富血小板血浆(platelet rich plasma, PRP)是借助离心手段，从全血里分离得到的部分血浆，其中含有丰富的血小板及多种细胞因子，在降低炎症反应、增加血管生成等方面展示出了显著的疗效[2]。本研究旨在通过建立SD大鼠皮瓣模型，将PRP应用于大鼠皮瓣移植手术中，观察PRP对皮瓣术后成活的影响。

2. 材料与方法

2.1. 主要试剂与仪器

白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)抗体试剂、白介素-18 (interleukin-18, IL-18)抗体试剂、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1 (cysteinyl aspartate specific proteinase-1, Caspase-1)抗体试剂购自安诺伦生物科技有限公司，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)抗体试剂购自圣克鲁斯生物技术有限公司，CD34抗体试剂购自赛默飞世尔科技公司，RNeasy试剂盒购自上海玉博生物科技有限公司，QuantiTect试剂盒购自北京百奥创新科技有限公司，PCR引物购自苏州金唯智生物科技有限公司，低温高速离心机、台式高速大容量离心机购自德国艾本德股份公司，高速低温组织研磨仪购自武汉赛维尔生物科技有限公司，逆转录–聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)仪购自美国应用生物系统有限公司，DP74高分辨率生物显微镜购自奥林巴斯投资有限公司，瑞沃德R540增强型小动物麻醉机购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司，DW-HL5超低温冷冻储存箱购自中科美菱低温科技股份有限公司，BC-5390CRP全自动血液细胞分析仪购自迈瑞医疗国际股份有限公司。

2.2. 实验动物与分组

由安徽医科大学实验动物中心[许可证：SYXK(皖)2017-006]提供18只健康雌性SPF级SD大鼠，重量210~240 g，7~8周龄。大鼠在室温20℃~28℃、湿度45%~75%条件下，每笼饲养3只。实验期间大鼠自由进食、饮水。动物实验按照安徽医科大学实验动物伦理委员会审批(编号：LLSC20241735)。18只SD大鼠按照随机数字表法分成PRP制备组6只、皮瓣模型制作组12只，12只皮瓣模型制作组大鼠再采用随机数字表法分为对照组6只、PRP注射组6只。

2.3. PRP制备

随机从6只PRP制备组大鼠中挑选1只，用3.5%的异氟烷吸入麻醉后，大鼠取仰卧位固定，消毒铺巾并沿腹中线剪开大鼠皮肤，拨开肠管，暴露下腔静脉，用采血针从下腔静脉抽取全血置于抗凝管中，随后处死大鼠。把获取的全血放置于离心机中，在22℃下以200 g离心力(转子半径为11 cm)离心20分钟。全血经过离心后会分成三层，上层为黄色的血浆上清层，中层为黄白色的血小板和白细胞层，下层为颜色较深的红细胞层，由于血小板密度与血浆相近，大部分血小板会存留在血浆中，为了最大程度保留全部血小板，将上清液至中间层以下处转移到另一个试管内，然后再次将其置于离心机中，在22℃下以200 g离心力离心10分钟，最后弃去血浆层的上层部分，剩余的即为PRP。单独留取约0.2 ml的PRP，使用血液细胞分析仪计数PRP中血小板的数量。

2.4. 皮瓣处理

随机从12只皮瓣模型制作组大鼠中调选1只，以大鼠背部后正中线与两侧肩胛下角连线交点为A、后正中线上距离点A下方1 cm、7.5 cm为点B、C；分别以点B、C为起始点平行于肩胛下角连线向右侧2 cm描绘点D、E；取BD、CE中点分别计为F、G；最后连接DEFG四点，该区域即为皮瓣区域，规格为1 * 6.5 cm²。将大鼠3.5%异氟烷诱导麻醉3 min后，将异氟烷浓度调至维持浓度2%，俯卧位固定大鼠，对大鼠背部进行备皮、消毒、铺巾。沿标记线切开大鼠皮肤及浅筋膜层，用组织剪将浅筋膜层与深筋膜层分离。仅保留大鼠胸背动脉穿支作为皮瓣供血动脉。PRP注射组及对照组的大鼠均依此设计皮瓣模型。手术中，PRP注射组按100 uL/cm²剂量将PRP与生理盐水配置成1 ml混合液并注射于皮瓣基底部，对照组则在相同位置注射1 ml生理盐水，然后将皮瓣原位全层缝合。

2.5. 相机拍摄下皮瓣坏死比例测定

使用相机对各组大鼠术后第5天皮瓣进行拍照，将皮瓣出现灰黑皱缩、质地坚硬、毛发生长稀疏或不生长、切开组织不流血的状态定义为坏死。利用ImageProPlus6.0软件对拍摄的照片进行分析，将大鼠皮瓣坏死区域转化为几何图案，按照几何图案的计算方法来计算皮瓣坏死比例。

2.6. 皮瓣组织取材

采集各组大鼠皮瓣末端0.5~1.5 cm组织标本，将皮瓣组织标本沿水平正中线剖开，平均分成两份，皮瓣末端1~1.5 cm部分置于−80℃冰箱冷冻保存，用于RT-PCR检测，皮瓣末端0.5~1 cm部分用10%福尔马林固定后，置于阴冷干燥处保存，用于常规石蜡包埋切片后进行免疫组化染色。

2.7. RT-PCR检测

取各组大鼠皮瓣组织，用高速低温组织研磨仪充分研磨裂解组织，按照RNeasy试剂盒说明提取组织中的总RNA，所得的RNA按照QuantiTect试剂盒说明逆转录为cDNA。以稀释后的cDNA (约100 ng/µl)作为PCR反应模板，将配制好的PCR反应体系放入离心机中行瞬时离心，离心后放入RT-PCR仪中进行PCR扩增。读取RT-PCR检测基因的Ct值，计算目的基因的Ct值与内参基因的Ct值之差，得出ΔCt值。将PRP注射组的ΔCt值减去对照组的ΔCt均值，得到ΔΔCt，使用2^−ΔΔCt方法测量IL-1β、IL-18和Caspase-1的相对表达量。

2.8. 免疫组化染色评分

取各组大鼠皮瓣组织行常规石蜡切片、二甲苯脱蜡、乙醇梯度浓度水化后，按DAB试剂盒说明行免疫组化染色，在400倍显微镜下拍摄切片图像，观察各组大鼠皮瓣中VEGF和CD34的表达情况，采用半定量法对染色结果进行评分。每张染色满意的切片随机选取6个400倍镜视野进行评分，6次评分的平均分为最终得分。以棕黄染色颗粒定位于细胞质或细胞膜上为阳性，计数阳性细胞占皮肤组织细胞的百分比。具体评分标准如下：1. 着色：无着色为0分，浅黄色为1分，浅棕色为2分，棕褐色为3分。2. 阳性细胞百分比：0计0分，1%~24%计1分，25%~49%计2分，50%~74%计3分，75%~100%计4分。3. 着色强度与阳性细胞百分比得分的乘积结果为最终总分。

2.9. 统计学方法

实验全部数据采用SPSS 27.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用均数 ± 标准差($\overline{x}\pm s$ )表示。组间比较用独立样本t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. PRP中血小板的数量

为确保所提取的PRP为适宜浓度，本研究对应用在PRP注射组大鼠的PRP中的血小板数量进行了计数。见表1。

Table 1. Summary of platelet counts in Platelet-Rich Plasma (PRP) corresponding to rats in the PRP injection group

表1. PRP注射组大鼠对应PRP中的血小板计数汇总

样本	PRP中血小板数(10^9/L)
1	3296
2	3483
3	3261
4	3530
5	3319
6	3117

3.2. 皮瓣坏死比例

术后第5天，对照组皮瓣近端呈粉红色，中端开始颜色逐渐晦暗，伴少量黑痂附着，表面无毛发生长，弹性降低且针刺无明显出血。PRP注射组近端至中端大部分区域色泽红润，远端开始颜色逐渐晦暗，表面毛发稀疏，弹性尚可且针刺可见少量出血。与对照组相比，PRP注射组皮瓣坏死比例明显降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。见图1和表2。

Figure 1. Observation of the necrosis ratio of skin flaps in the two groups of rats on the fifth day after the operation

图1. 2组大鼠术后第五天皮瓣坏死比例观察

Table 2. Statistical table of the necrosis ratio of skin flaps in the two groups of rats on the fifth day after the operation (%, $\overline{x}\pm s$ )

表2. 2组大鼠术后第五天皮瓣坏死比例统计表(%, $\overline{x}\pm s$ )

组别	只数	坏死比例
对照组	6	38.60 ± 8.50
PRP注射组	6	16.22 ± 2.16
F值		5.203
P值		<0.001

3.3. RT-PCR检测结果

RT-PCR结果术后第5天，与对照组相比，PRP注射组皮瓣IL-1β、IL-18、Caspase-1的mRNA相对表达量均明显降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表3。

Table 3. Statistical table of the relative expressions of IL-1β, IL-18 and Caspase-1 in the skin flap tissues of the two groups of rats on the fifth day after the operation ($\overline{x}\pm s$ )

表3. 2组大鼠术后第五天皮瓣组织IL-1β、IL-18、Caspase-1相对表达量统计表($\overline{x}\pm s$ )

组别	只数	IL-1β	IL-18	Caspase-1
对照组	6	8.66 ± 0.59	8.83 ± 0.62	8.35 ± 0.31
PRP注射组	6	3.66 ± 0.51	5.22 ± 0.95	4.32 ± 0.33
F值		0.189	1.162	0.002
P值		<0.001	<0.001	<0.001

3.4. 免疫组化染色评分结果

免疫组化染色评分术后第5天，对照组偶见棕黄色VEGF和CD34表达，PRP注射组可见大量棕黄色VEGF和CD34表达。与对照组相比，PRP注射组VEGF和CD34评分均明显升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表4。

Table 4. Statistical table of the immunohistochemical scores of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and CD34 in the two groups of rats on the fifth day after the operation ($\overline{x}\pm s$ )

表4. 2组大鼠术后第五天VEGF和CD34免疫组化评分得分统计表($\overline{x}\pm s$ )

组别	只数	VEGF	CD34
对照组	6	3.00 ± 0.63	2.17 ± 0.75
PRP注射组	6	4.50 ± 1.22	4.00 ± 1.67
F值		4.706	4.206
P值		<0.05	<0.05

4. 讨论

皮瓣愈合是一个涉及血管重建、组织修复以及外部干预共同作用的动态过程，其包含了普通伤口的修复和移植组织血供的重建等机制。皮瓣愈合的生理阶段依次为炎症期、增殖期和成熟期，每个阶段具有独特的细胞活动、组织变化及功能恢复特点，这些阶段相互关联、相互影响，任何一个或多个阶段受到干扰，都可能阻碍皮瓣愈合，进而导致不可逆的坏死。

皮瓣移植后，新生血管的形成是保障皮瓣存活的关键。PRP中的α-颗粒能够释放多种生长因子，其中包括血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子-β (TGF-β)、表皮细胞生长因子(EGF)以及血管内皮生长因子(VEGF)等。这些生长因子均具有促进细胞增殖与分化的功能，能够加速血管和上皮组织的生成，从而促进组织修复[3] [4]。VEGF是一种特异性作用于血管内皮细胞的生长因子，它可以与血管内皮表面的相应受体结合，进而刺激内皮细胞增殖，诱导新血管生成[5]，是目前研究较为广泛的血小板生长因子之一。CD34是一种高度糖基化的跨膜蛋白，主要在毛细血管管腔、细胞膜突起以及内皮细胞交叉区表达，CD34作为一种重要的血管生成标志物，能够反映组织内血管的密度，被广泛应用于评估新生血管的形成情况[6] [7]。在本研究中，通过对大鼠皮瓣组织进行免疫组化染色发现，在大鼠皮瓣手术过程中使用PRP，可使血管生成相关因子VEGF和CD34的表达上调，并且PRP注射组大鼠皮瓣的成活率明显高于对照组。基于此，笔者推测PRP能够通过促进血管生成来提高皮瓣的成活率，改善皮瓣的存活状况。

适度的炎症反应是机体对伤口愈合的自然反应[8]，有助于招募免疫细胞和生长因子至损伤处，促进伤口愈合[9]。然而，过度的炎症反应也可导致微血管痉挛、血栓形成或缺血[10]，从而危及皮瓣的存活。PRP中α-颗粒中的炎症介质具备调节免疫和炎症细胞向损伤部位聚集的能力，从而对局部炎症进行调控，这是PRP参与组织修复的重要机制之一[11]。Caspase-1是一种半胱天冬酶，当细胞感知病原体入侵或机体损伤时，NLRP3等炎症小体组装、招募并激活Caspase-1 [12]，通过切割炎症细胞因子前体，如前体白细胞介素-1β (pro-IL-1β)和前体白细胞介素-18 (pro-IL-18)，生成具有活性的白细胞介素-1β (IL-1β)和白细胞介素-18 (IL-18)，从而在炎症反应中发挥重要作用[13]-[16]。本研究的RT-PCR数据表明，在大鼠皮瓣术中使用PRP可以显著降低术后皮瓣组织中IL-1β、IL-18、Caspase-1的表达，且PRP注射组大鼠皮瓣的成活率显著高于对照组，因此笔者推测PRP能够通过抑制皮瓣术后炎症反应来改善皮瓣的成活。

综上所述，在大鼠皮瓣手术过程中注射PRP，能够显著提高术后皮瓣的成活率，其作用机制可能与促进血管生成、抑制炎症反应相关，术中注射PRP或许可作为临床上提升皮瓣手术成功率的一种有效手段。

5. 局限与展望

本实验存在几点不足之处。其一，由于大鼠血量有限，实验采用的是同种异体PRP，而非自体PRP，尽管已有多项研究[17] [18]证实异体PRP在治疗中的安全性与有效性，但仍可能引发潜在免疫反应，进而对实验结果产生影响。其二，实验在术后第5天处死大鼠，未能探究PRP对皮瓣存活的长期影响。其三，本实验未对PRP给药的最佳方式和时间、PRP使用激活剂的必要性和不同激活方式的影响、不同浓度PRP之间的剂量效应关系以及PRP中具体哪些生长因子或细胞因子起主要作用等方面展开探讨，这使得研究结论的说服力不足，因此，后续仍需开展更多研究，以明确PRP在皮瓣手术中的临床意义。

利益冲突

所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明

张世豪：实验操作、论文撰写、数据整理、统计学分析；方林森：研究指导、论文修改、经费支持。

NOTES

^*通讯作者。