摘要: 研究背景：子宫内膜异位症(EMs)是一种雌激素依赖性的慢性炎症性疾病，影响约10%的育龄期女性。EMs症状的复杂性和不典型性严重影响患者的生理和心理健康并对社会经济造成沉重的负担。然而EMs的发病机制和有效的干预措施目前尚不完全清楚。饮食作为重要干预措施在多种慢性疾病中发挥作用，然而，关于饮食在EMs中的作用相关研究较少且多为观察性研究。孟德尔随机化(MR)利用遗传变异作为工具变量可以弥补传统观察性研究的不足，因而被广泛应用于探索可改变的暴露与疾病之间的因果关系。研究方法：本研究利用双向双样本MR分析方法探究饮食与EMs之间的因果关系。分别从IEU数据库和芬兰基因联盟中获取与饮食和EMs有关的全基因组关联研究(GWAS)数据。将基因位点显著性阈值设定为P < 5 × 10
−6，并通过去除连锁不平衡(LD)及剔除与结局相关的混杂SNP等方法严格筛选出代表暴露的工具变量(IV)后进行MR分析。进一步地，利用中介MR分析探究二者之间潜在的中介因素，探究了血脂在饮食和EMs中的中介效应。为了评估研究结果的稳定性，还进行了多种敏感性分析。研究结果：本研究主要基于IVW方法，有力地证明了干果和油性鱼类的摄入与EMs之间存在因果关系，以及TG在饮食和EMs之间的中介作用。具体而言，在所有饮食因素中，干果摄入(OR = 0.72, 95% CI: 0.56~0.93, P = 0.01)和油性鱼类摄入(OR = 0.80, 95% CI: 0.66~0.97, P = 0.02)与EMs发生风险降低有关。血脂水平与EMs之间的因果关系发现TG是EMs发生的危险因素(OR = 1.15, 95% CI: 1.07-1.23, P < 0.01)。进一步发现，干果(OR = 0.81, 95% CI: 0.75~0.88, P < 0.01)和油性鱼类摄入(OR = 0.86, 95% CI: 0.81~0.91, P < 0.01)均可降低TG水平，且中介MR分析显示TG在干果和油性鱼类摄入对EMs的保护性作用中均起到中介效应，中介比例分别为9% (P = 0.001)和10% (P = 0.002)。研究结论：本研究利用MR分析发现干果和油性鱼类的摄入与EMs发生风险降低有关。血脂水平尤其是TG水平与EMs的发生风险增加有关。干果和油性鱼类对EMs的保护作用部分是通过降低TG水平实现的。
Abstract: Background: Endometriosis (EMs) is an estrogen-dependent chronic inflammatory disease with a high prevalence, affecting approximately 10% of women of reproductive age. The complexity and atypical nature of EMs symptoms severely impact patients’ physical and mental health and impose a significant socioeconomic burden. However, the pathogenesis and effective interventions for EMs remain incompletely understood. Diet, as an important intervention, plays a role in various chronic diseases. Nevertheless, research on the role of diet in EMs is limited and predominantly observational. Mendelian randomization (MR), which uses genetic variants as instrumental variables, can address the limitations of traditional observational studies and is widely used to explore causal relationships between modifiable exposures and diseases. Methods: This study employed a bidirectional two-sample Mendelian randomization (MR) approach to investigate the causal relationship between diet and EMs. Genome-wide association study (GWAS) data related to diet and EMs were obtained from the IEU database and the Finnish Gene Consortium, respectively. Genetic loci with a significance threshold of P < 5 × 10−6 were selected, and instrumental variables (IVs) representing exposures were rigorously screened by removing linkage disequilibrium (LD) and excluding SNPs associated with confounding factors. Furthermore, mediation MR analysis was conducted to explore potential mediating factors between diet and EMs, specifically focusing on blood lipids. Finally, various sensitivity analyses were performed to evaluate the robustness of the findings. Results: Based primarily on the IVW method, this study provided strong evidence for a causal relationship between the intake of dried fruits and oily fish and EMs, as well as the mediating role of triglycerides (TG) in the relationship between diet and EMs. Specifically, among all dietary factors, the intake of dried fruits (OR = 0.72, 95% CI: 0.56~0.93, P = 0.01) and oily fish (OR = 0.80, 95% CI: 0.66~0.97, P = 0.02) was associated with a reduced risk of endometriosis. Subsequently, we explored the causal relationship between blood lipid levels and EMs and found that TG is a risk factor for EMs (OR = 1.15, 95% CI: 1.07~1.23, P < 0.01). Further analysis revealed that both dried fruit (OR = 0.81, 95% CI: 0.75~0.88, P < 0.01) and oily fish intake (OR = 0.86, 95% CI: 0.81~0.91, P < 0.01) could reduce TG levels. Mediation MR analysis showed that TG mediated the protective effects of dried fruits and oily fish on EMs, with mediation proportions of 9% (P = 0.001) and 10% (P = 0.002), respectively. Conclusions: This study, using MR analysis, found that the intake of dried fruits and oily fish is associated with a reduced risk of EMs. Blood lipid levels, particularly TG, are associated with an increased risk of endometriosis. The protective effects of dried fruits and oily fish on EMs are partially mediated by reducing TG levels.
1. 引言
子宫内膜异位症(Endometriosis, EMs)是一种雌激素依赖性的慢性炎症性疾病，特征为子宫内膜样组织(腺体和间质)在子宫腔外异常生长，常见于盆腔腹膜、卵巢、肠道等部位[1]。EMs发病率高，影响了全球约10%的育龄女性[2]。由于其临床症状复杂和不典型，目前对EMs的识别和干预仍存在不足，这给社会经济带来沉重的负担[3]。有研究表明，饮食因素与其他雌激素依赖性疾病(如乳腺癌和子宫内膜癌)的致病和治疗之间存在关联[4] [5]，类似地，部分观察性研究提示饮食模式可能与EMs发生风险存在关联[6]，这些暗示营养干预可能成为预防EMs的新方向，但现有证据存在显著局限性。
目前有关饮食与EMs的研究主要是传统观察性研究，难以规避混杂偏倚。饮食摄入通常与生活方式、社会经济地位等存在强相关性，而现有统计模型往往无法完全校正这些混杂因素。其次，反向因果关系可能扭曲真实关联。这些方法学缺陷使得观察性研究得出的关联难以直接转化为临床干预靶点。
孟德尔随机化(Mendelian Randomization, MR)作为新兴的因果推断工具，为突破上述困境提供了新的可能[7]。该方法利用遗传变异作为工具变量(Instrumental Variables, IVs)，模拟随机对照试验的因果推断逻辑。其核心优势体现在：(1) 基因型在配子形成时随机分配，可有效避免传统混杂因素干扰；(2) 疾病发生不会改变个体基因型，从而消除反向因果偏倚；(3) 基于全基因组关联研究(GWAS)的遗传工具具有客观测量特性，显著降低暴露测量误差。近年来，MR分析已在心血管代谢性疾病领域成功识别出多个因果性饮食因素[8]。
本研究首次将MR方法应用于EMs营养病因学研究领域，突破传统观察性研究的因果推断瓶颈，为疾病预防提供更可靠的证据等级。
2. 研究方法
本研究是一项双向双样本MR分析联合中介MR分析，使用的是全基因组关联研究(GWAS)的汇总统计数据。为了确保结果的有效性，我们必须遵守孟德尔随机化三大假设[9]。这些假设包括(1) 我们选择的工具变量(IVs)与所研究的暴露因素之间存在很强的关联；(2) 这些IVs与我们所研究的结果之间完全不存在关联；(3) 我们还必须确保本研究纳入的IVs不受任何可能扭曲研究结果的混杂因素的影响。
2.1. 数据来源
本研究采用的膳食因素汇总结果包括牛肉摄入量、咖啡摄入量、熟蔬菜摄入量、干果摄入量、新鲜水果摄入量、羊肉/羊肉摄入量、肉类消费量、牛奶摄入量、非油性鱼类摄入量、油性鱼类摄入量、猪肉摄入量、家禽摄入量、沙拉/生蔬菜摄入量、茶摄入。中介因素(血脂)包括低密度脂胆固醇、高密度脂胆固醇、总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)，载脂蛋白A (Apo A)和载脂蛋白B (Apo B)。所调查的暴露和中介因素的基因组研究汇总数据来自IEU全球基因组研究数据库。该计划得到了布里斯托尔大学MRC综合流行病学组的支持，它汇编并分析了各种来源的GWAS数据，包括英国生物库、已发表文献和芬兰基因生物库。由于分析中使用的数据是公开的、匿名的和去标识化的，因此这项研究被认为无须经过伦理审查机构的批准。研究还从芬兰基因生物库中提取了EMs的GWAS数据，该生物库包括77,257名欧洲血统的参与者，其中有8288例EMs病例和68,969例对照。本研究使用的GWAS摘要级数据由IEU开放GWAS项目发布。
2.2. IVs的选择
在MR分析中，遗传变异，尤其是单核苷酸多态性(SNPs)，通常被用作IV来研究暴露因素与结果之间的因果关系，选择的全基因组显著性阈值定义为P < 5 × 10−6。在本研究中，我们筛选了不同数量的SNPs作为各种暴露因素的IVs。所有的SNP在全基因组阈值下都是显著的，并且不存在连锁不平衡(LD，R2 ≥ 0.001且在10 mb以内)，也没有与已知的EMs风险位点重叠。在 MR 分析中，我们使用F统计量来评估IV的强度。该指标的计算公式(F = R2 × (N − k − 1)/k × (1 − R2))考虑了一系列变量，包括总方差(R2)、样本量(N)和分析中包含的IV数量(k)。弱遗传工具的定义是F统计量小于10的工具，这些工具被排除在我们的分析之外。
2.3. 统计方法
在这项研究中，我们采用了四种不同的MR统计分析方法，包括逆方差加权法(IVW)、加权中位法(WM)、MR-Egger和加权模式，来评估膳食因素对EMs的因果效应。这些MR方法对水平多向性的假设各不相同，由于IVW方法是通过对Wald值进行荟萃分析来估计因果关系，因此IVW方法被用作主要方法。WM法用于剔除无效仪器，最大允许比例为50%。相比之下，MR-Egger方法允许所有工具失效，并通过检查截距项来评估潜在的方向性多效性，加权模式则作为前三种方法的补充。IVW模型的异质性使用Cochran’s Q检验进行评估，P值小于0.05表示存在异质性。此外，我们还评估了IVs的水平多效性水平。我们进行了Leave-one-out剔除分析，以评估单个SNP对结果的影响。
进一步地，在本研究中还采用中介MR分析研究脂质谱(LDL-c、HDL-c、TC、TG、Apo-A和Apo-B)在干果和油性鱼类摄入与EMs之间关系中的潜在中介作用。中介MR分析的原理如图1所示。在中介MR分析中，βa是饮食对中介的影响，βb是中介对EMs的影响，βc则表示饮食对EMs的总效应(Total effect, TE)，βc'表示饮食对EMs的直接效应(Direct effect, DE) (βc' = βc – βa * βb)。我们通过将间接效应(IE) (βa * βb)除以总效应(βc)，使用系数和多变量delta方法的乘积量化饮食因素通过中介对EMs的间接影响。
Figure 1. Schematic diagram of the principle of mediated Mendelian randomization
图1. 中介孟德尔随机化原理示意图
本研究使用R软件(4.2.0版)以及TwoSampleMR软件包进行分析。采用的显著性水平为P < 0.05，MR估计值以概率比(OR)和95%置信区间(CI)表示。
3. 结果
在这项研究中，我们调查了14种不同饮食暴露因素与EMs之间的因果关系。表1显示了14种饮食因素的基线数据特征。以IVW法为主要的研究方法，共发现2种显著的因果关系(P < 0.05)。我们发现，干果摄入量与EMs风险的降低有明显关联(OR = 0.72 (0.56~0.93), P = 0.01)。此外，我们还发现油性鱼类摄入量是EMs的保护性因素(OR = 0.80 (0.66~0.97), P = 0.02)。然而，我们并未发现牛肉摄入量、咖啡摄入量、熟蔬菜摄入量、新鲜水果摄入量、羊肉/羊肉摄入量、肉类消费量、牛奶摄入量、非油性鱼类摄入量、猪肉摄入量、家禽摄入量、沙拉/生蔬菜摄入量、茶摄入共13种饮食因素与EMs之间存在因果关系(P > 0.05)，结果如图2所示。
为了确保结果的稳定性，我们对干果和油性鱼类摄入与EMs之间进行敏感性分析。Cochran’s Q检验显示，干果摄入与EMs之间存在异质性(P = 0.02)，但油性鱼类与EMs之间不存在显著异质性(P = 0.80)。尽管干果摄入相关IVs存在异质性，但Weight median分析方法(图3)仍显示干果摄入与EMs之间存在显著的因果关系(OR = 0.66 (0.46~0.94), P = 0.02)，这表明MR分析结果不受异质性的影响。水平多效性显示干果摄入(P = 0.97)、油性鱼类摄入(P = 0.15)与EMs之间的IVs不存在水平多效性。Leave-one-out剔除分析同样表明在剔除单个SNP后干果和油性鱼类摄入与EMs的因果关系仍存在。以上敏感性分析表明，干果和油性鱼类与EMs之间的因果关系具有稳健性。
Figure 2. Forest plot of causal associations between genetically predicted dietary factors and EMs
图2. 基因预测的饮食因素与EMs之间因果关联森林图
Figure 3. Forest plot of genetically predicted causal associations between dried fruit and oily fish intake and EMs
图3. 基因预测的干果和油性鱼类摄入与EMs之间因果关联森林图
为了避免反向因果关系对本研究的干扰，我们将EMs作为暴露将14种饮食作为结局进行反向MR分析(图4)。反向MR分析显示EMs似乎与蔬菜的摄入增加相关(OR = 1.01 (1.00~1.01), P = 0.02)，然而并未发现EMs与干果摄入和油性鱼类摄入之间存在反向因果关系。这表明，干果摄入和油性鱼类摄入与EMs之间不受反向因果关系的影响。
Figure 4. Forest plot of causal association between genetically predicted EMs and dietary factors
图4. 基因预测的EMs与饮食因素之间因果关联森林图
既往观察性研究表明血脂似乎在EMs的发生发展中起作用，而血脂同样作为饮食干预的一个重要身体成分是否在与EMs之间起到中介作用呢？为了明确这一问题，我们首先将血脂水平作为暴露，将EMs作为结局开展MR分析以探究血脂水平与EMs之间的因果关系。MR结果显示TG (OR = 1.15 (1.07~1.23), P < 0.01)和Apo B (OR = 1.08 (1.00~1.16), P = 0.04)水平与EMs发生风险升高有因果关系。然而TC (P = 0.21)、LDL-c (P = 0.23)、HDL-c (P = 0.22)和Apo A (P = 0.85)与EMs之间未显示具有显著因果关系(图5)。敏感性分析显示，TG和Apo B对EMs不存在异质性和水平多效性，且反向MR分析未显示EMs能影响血脂水平。
进一步地，我们利用MR分析探究干果摄入和油性鱼类摄入对血脂水平的影响。MR分析显示，干果摄入可以降低TG (OR = 0.81 (0.75~0.88), P < 0.01)水平同时可以升高HDL-c (OR = 1.17 (1.08~1.28), P < 0.01)和Apo A (OR = 1.12 (1.03~1.21), P = 0.01)水平(图6)。类似地，我们发现油性鱼类摄入同样可以降低TG (OR = 0.86 (0.81~0.91), P < 0.01)水平同时可以升高HDL-c (OR = 1.15 (1.08~1.23), P < 0.01)和Apo A (OR = 1.07 (1.00~1.14), P = 0.04)水平(图7)。敏感性分析显示，干果摄入和油性鱼类摄入均不存在异质性和水平多效性。
上述双样本MR分析表明，干果摄入和油性鱼类摄入可能通过降低TG水平进而降低EMs的发生风险，为了证实TG在饮食和EMs之间的中介效应，我们利用中介MR分析对饮食、TG和EMs三者之间中介效应及其占比。中介MR分析表明，干果摄入对EMs的总效应(TE)为−0.33，直接效应(DE)为−0.30，而干果摄入通过TG作为中介对EMs的间接效应(IE)为−0.03，TG在其中的中介比例为9%且中介效应具有统计学意义(P = 0.001)。同样地，中介MR分析也表明，油性鱼类摄入对EMs的TE为−0.22，DE
Figure 5. Forest plot of causal association between genetically predicted blood lipid levels and EMs
图5. 基因预测的血脂水平与EMs之间因果关联森林图
Figure 6. Forest plot of the causal association between genetically predicted dried fruit intake and blood lipids
图6. 基因预测的干果摄入与血脂之间因果关联森林图
Figure 7. Forest plot of genetically predicted causal association between oily fish intake and lipids
图7. 基因预测的油性鱼类摄入与血脂之间因果关联森林图
为−0.20，而油性鱼类摄入通过TG作为中介对EMs的IE为−0.02，TG在其中的中介比例为10%且中介效应具有统计学意义(P = 0.002)。
4. 讨论
饮食因素可以调节类固醇激素代谢、影响肌肉收缩、调节炎症、氧化应激和月经周期，从而在EMs的发生发展中起到重要作用[10]。本研究发现干果和油性鱼类摄入是EMs的保护性因素，可降低EMs发生的风险。干果中丰富的膳食纤维可能通过多重途径影响雌激素代谢：①促进肠道菌群介导的雌激素分解代谢，降低循环雌激素水平；②增加性激素结合球蛋白(SHBG)合成，减少生物可利用雌激素；③通过调节胆汁酸循环抑制雌激素的肠肝再吸收。这一机制与EMs的雌激素依赖性病理特征高度吻合。此外，干果中高浓度的维生素E、多酚类物质及硒元素具有强大的抗氧化能力[11]。子宫内膜异位微环境中活性氧(ROS)的过度产生已被证实可促进病灶血管生成和细胞增殖[12]。
油性鱼类富含的ω-3多不饱和脂肪酸(特别是EPA和DHA)已被证实具有显著的抗炎作用。其通过竞争性抑制促炎性前列腺素E2和白三烯B4的合成[13]，同时促进消退素(resolvins)和保护素(protectins)等促消退介质的生成，可能有效缓解EMs特征性的慢性炎症状态。值得注意的是，近期研究发现子宫内膜异位病灶中环氧合酶-2 (COX-2)表达显著上调[14]，而ω-3脂肪酸可能通过下调COX-2通路发挥治疗作用。
与血脂水平相关的MR分析显示，TG水平升高(OR = 1.15, P < 0.01)和Apo B水平升高(OR = 1.08, P = 0.04)与EMs风险增加显著相关，而TC、LDL-c、HDL-c和Apo A未显示显著影响。这一结果与既往研究一致，表明TG可能是EMs的关键代谢风险因素。TG可能通过以下机制促进EMs发生：1. 炎症激活：高TG水平可增加游离脂肪酸(FFAs)释放，激活Toll样受体(TLR4)和核因子κB (NF-κB)通路，促进促炎因子(如IL-6、TNF-α)分泌，进而增强子宫内膜细胞的黏附与侵袭能力。2. 氧化应激：TG代谢过程中产生的活性氧(ROS)可导致脂质过氧化，损伤子宫内膜细胞DNA，促进异位病灶形成。3.雌激素代谢调控：TG水平升高可能影响雌激素的生物利用度，因为脂蛋白(如VLDL)可携带雌激素前体，促进局部雌激素合成，而雌激素是EMs的关键驱动因子。
此外，我们的研究发现，干果(OR = 0.81)和油性鱼类(OR = 0.86)摄入均可显著降低TG水平，并降低EMs风险。干果富含α-亚麻酸(ALA)，而油性鱼类富含二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。这些多不饱和脂肪酸(PUFA)可通过下调SREBP-1c抑制肝脏TG合成并通过激活PPARα促进脂肪酸β氧化。此外，EPA和DHA还可减少VLDL-c分泌，从而降低循环TG水平。除了PUFA，干果中可溶性膳食纤维可延缓肠道脂质吸收，减少肝脏TG合成。另外，干果中的维生素E和多酚类物质可减轻氧化应激，间接改善脂代谢。
中介MR分析显示，TG在干果和油性鱼类摄入与EMs关系中的中介比例分别为9%和10%，这提示TG可能只是部分中介了饮食对EMs的影响，表明TG是饮食影响EMs的重要但非唯一途径，还有其他更重要的中介通路或机制未被发现。
本研究是首个利用MR分析从多角度探究饮食、脂质、EMs三者之间因果关系的研究，我们强调了TG在饮食和EMs之间的关键中介作用。本研究的意义在于为EMs提供饮食干预策略，我们的研究表明，增加干果和油性鱼类摄入可作为降低TG、预防EMs的潜在措施。另外对EMs高风险女性(如家族史、不孕症患者)应监测TG水平，必要时给予降脂干预。
然而，本研究仍存在一定的局限性。首先，研究对象基本上是欧洲血统的个体，因此将研究结果外推到其他人群可能受到一定的限制。其次，由于数据库本身的限制，在此MR分析中数据采集阶段无法进行人群的性别筛选，可能对最终结果产生影响。但由于相关SNP不处于性染色体上，性别对最终结果的影响较小。此外，尽管MR方法可以有效控制混杂因素，但仍可能存在一些未被发现的混杂因素，例如生活方式、环境因素等，这些因素可能同时影响饮食、血脂和EMs的风险。最后，由于客观因素限制，相关细胞和动物实验暂时无法开展，因此进一步的实验和临床验证研究对于探索潜在的分子机制及深化临床意义至关重要。期待未来开展更多的干预试验并结合多组学整合分析探索饮食-代谢-生殖轴的相互作用，为EMs的精准预防提供新策略。
5. 小结
本研究发现干果和油性鱼类的摄入与EMs发生风险降低有关，血脂水平尤其是甘油三酯(TG)水平与EMs的发生风险增加有关，且干果和油性鱼类对EMs的保护作用部分是通过降低TG水平实现的。这对拓展EMs疾病相关认知及指导日常干预具有重要意义。
NOTES
*通讯作者。