1. 引言
微血管病变是以微血管内皮细胞损伤为核心和启动因素，血液成分和神经体液共同参与，脏器组织细胞结构功能损伤，多维时空动态演变的复杂网络病变[1]。通络干预能使复杂网络关联节点趋于正常，保护微血管内皮细胞是解决微血管病变难题的核心机制[2]。“微血管枢纽学说”主张，在脑梗死突然发作后，脑表面的侧支血管系统好似一个“阀门”，它对脑缺血区域能否及时且有效地接收来自缺血周边区域的侧支循环血流起着决定性作用，同时还会将这些代偿血流输送至微细血管，以此滋养缺血的神经元组织，而“阀门”的工作状态关乎着缺血细胞的存亡[3] [4]。急性脑梗死发生之际，“阀门”的阻力显著增大，开启不畅，微血管的自律运动呈现出高频率、低振幅的特征，其流质与流场的动态耦合出现故障，具体表现为“高速低效振荡”，这就成为了缺血脑组织获取代偿血流的阻碍。所以，脑梗死急性发作之后，梗死区域的血流产生了何种变化，是否存在特定的变化规律，以及怎样依据这些变化快速、高效地重建微血管侧支循环，恢复缺血区域的血流供应，就成为了治疗的核心要点。有研究已证实，电针干预能够调控脑血管的收缩与舒张状态，使脑梗死后微血管的自律运动得以恢复，并且可以有力地推动脑梗死急性期侧支循环的构建，进而增加缺血半暗带和梗死区域的脑血流供应，减轻脑梗死对神经元造成的损伤[5]-[10]。血管新生可被视作增加侧支循环的另一种途径，然而相较于侧支循环的建立，血管新生所需的时间更长。就如同在病理状态下那样，在生理状态时，脑血管网络会依据组织对血流的需求以及血流供应自身的改变做出调节，这种调节能够通过血管发生、血管生成和动脉生成这三种不同机制来实现。大量研究显示，脑梗死发生后，缺血半暗带内的血管新生有所增加，也有研究认为脑梗死后血管新生的增多是为了清除堆积的代谢产物，不过从另一个角度来看，血管新生的增加无疑为血液流入梗死区域开辟了通道。本研究旨在通过建立脑缺血并颅骨缺损的SD大鼠模型，深入探究脑缺血并颅骨缺损时颅外向颅内供血的情况，以及这种供血模式对大鼠神经功能、脑梗死体积及脑组织中相关因子表达的影响[11]-[19]。
2. 材料与方法
2.1. 实验动物
本研究选用健康成年SD大鼠，体重在250~300 g之间。
2.2. 动物模型的建立
2.2.1. 脑缺血模型建立
采用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。术前将大鼠禁食12小时，不禁水。用4%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，将其仰卧位固定于手术台上，颈部正中剃毛、消毒，铺无菌巾。在手术显微镜下，沿颈部正中切开皮肤，钝性分离皮下组织和肌肉，暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。分别在CCA远心端和近心端、ECA处穿线备用，用微动脉夹暂时夹闭ICA，在CCA近心端结扎，然后在距CCA分叉部约4 mm处的ECA上剪一小口，将预先制备好的栓线(直径0.26 mm，头端光滑圆钝，在18 mm处做标记)经ECA切口插入ICA，松开ICA上的微动脉夹，缓慢推进栓线，使栓线前端进入大脑中动脉起始部，阻断大脑中动脉血流。插入深度以标记点到达CCA分叉处为准，此时轻轻系牢CCA远心端的细线，固定栓线，注意动作轻柔，避免牵拉ICA导致栓线脱出。缝合颈部皮肤，术后将大鼠置于温暖的环境中苏醒。
2.2.2. 颅骨缺损模型建立
在大鼠顶骨区域，用带有直径5 mm钻头的高速颅钻进行钻孔，制造颅骨缺损。在钻孔过程中，需不断用无菌生理盐水冲洗钻头，以降低局部温度，避免热损伤脑组织。钻孔时要注意控制力度和深度，避免损伤硬脑膜，确保硬脑膜的完整性。当颅骨全层被钻透，形成直径为5 mm的圆形骨缺损后，停止钻孔。用生理盐水冲洗创口，清除骨屑和血液，检查硬脑膜是否有破损，若有破损，需用5-0丝线进行修补。最后，用5-0丝线缝合皮下层，1#丝线缝合皮肤层，术后给予大鼠保暖，待其苏醒后分笼饲养。
2.3. 实验动物分组
假手术组：仅进行切开缝皮操作，不进行脑缺血和去骨瓣减压等实质性手术，共3只，假手术组作为空白对照。
实验组分为实验1组(脑缺血 + 去骨瓣减压手术)、实验2组(单纯去骨瓣减压)、实验3组(单纯脑缺血)、实验4组(脑缺血 + 去骨瓣减压术并硬脑膜切开反转)，每组各3只。
2.4. 实验观察指标及检测方法
相关因子表达检测
术后14天和30天，每组大鼠，经4%水合氯醛麻醉后，用4℃生理盐水经心脏灌流冲洗，随后用4%多聚甲醛溶液灌流固定。取脑，将脑组织置于4%多聚甲醛溶液中后固定24小时，然后依次经梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。将石蜡包埋的脑组织切成4 μm厚的切片，进行免疫组化染色。切片脱蜡至水后，用3%过氧化氢溶液孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。然后用枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)进行抗原修复，冷却后，用正常山羊血清封闭30分钟，以减少非特异性染色。分别加入兔抗大鼠VEGF、KI67、CD31一抗(稀释度1:100)，4℃孵育过夜。次日，用PBS冲洗后，加入生物素标记的山羊抗兔二抗(稀释度1:200)，37℃孵育30分钟。再用PBS冲洗，加入链霉亲和素–过氧化物酶复合物，37℃孵育30分钟。最后用DAB显色试剂盒显色，苏木精复染细胞核，盐酸酒精分化，氨水返蓝，脱水，透明，封片。在显微镜下观察，阳性表达为棕黄色颗粒，用图像分析软件分析阳性细胞的平均光密度值，以反映相关因子的表达水平。
2.5. 数据分析方法
使用SPSS 26.0统计软件对实验数据进行分析处理。所有计量资料以均数 ± 标准差(x ± s)表示。对于两组间的比较，若数据满足正态分布和方差齐性，采用独立样本t检验；若不满足正态分布或方差齐性，则采用非参数检验中的Mann-Whitney U检验。多组间比较采用单因素方差分析。对于计数资料，采用卡方检验，分析不同组之间的构成比是否存在显著差异。以P < 0.05作为差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. 不同分组在不同时间点CD31、KI67、VEGF积分光密度值对比
实验1组和实验4组的CD31表达显著高于其他组，表明脑缺血联合去骨瓣减压手术(实验1组)以及脑缺血联合去骨瓣减压并硬脑膜切开反转(实验4组)显著促进了血管生成(CD31为血管内皮细胞标志物)。实验3组(单纯脑缺血)的CD31表达也较高，但低于实验1组和实验4组。实验2组(单纯去骨瓣减压)和假手术组的CD31表达较低，表明单纯去骨瓣减压对血管生成的促进作用有限。实验1组的KI67表达显著高于其他组，表明脑缺血联合去骨瓣减压手术显著促进了细胞增殖(KI67为细胞增殖标志物)。实验4组的KI67表达也较高，但低于实验1组。实验2组和实验3组的KI67表达较低，表明单纯去骨瓣减压或单纯脑缺血对细胞增殖的促进作用较弱。假手术组的KI67表达为0，表明未进行实质性手术操作的大鼠未发生细胞增殖。实验1组的VEGF表达显著高于其他组，表明脑缺血联合去骨瓣减压手术显著促进了血管内皮生长因子(VEGF)的表达。实验4组的VEGF表达也较高，但低于实验1组。实验3组的VEGF表达显著高于实验2组和假手术组，表明单纯脑缺血也能促进VEGF表达，但效果弱于联合手术组。实验2组和假手术组的VEGF表达较低，表明单纯去骨瓣减压对VEGF表达的促进作用有限。实验1组和实验4组的CD31表达仍显著高于其他组，但较术后14天有所下降，表明血管生成活动在术后28天有所减弱。实验3组的CD31表达较术后14天显著下降，表明单纯脑缺血的血管生成作用随时间减弱。实验2组和假手术组的CD31表达无明显变化。实验1组和实验3组的KI67表达较术后14天显著下降，表明细胞增殖活动在术后28天减弱。实验4组的KI67表达也较术后14天下降，但高于实验2组和假手术组。实验2组和假手术组的KI67表达仍较低。实验1组和实验4组的VEGF表达仍显著高于其他组，但较术后14天有所下降，表明VEGF的表达随时间减弱。实验3组的VEGF表达较术后14天有所下降，但仍高于实验2组和假手术组。实验2组和假手术组的VEGF表达无明显变化。所有指标的组间比较均采用单因素方差分析，结果显示各组间差异显著(F值较大，P < 0.001)，表明不同手术处理对CD31、KI67和VEGF的表达有显著影响，见表1如下：
Table 1. Comparison of the integrated optical density values of CD31, KI67, and VEGF at different time points in different groups
表1. 不同分组在不同时间点CD31、KI67、VEGF积分光密度值对比
|
|
假手术组(n = 3) |
实验1组(n = 3) |
实验2组(n = 3) |
实验3组(n = 9) |
实验4组(n = 9) |
F |
14 D |
CD31积分光密度值 |
1633.25 ± 92.43 |
6353.30 ± 900.50 |
1663.69 ± 31.69 |
4934.39 ± 465.62 |
5922.99 ± 333.35 |
68.958 |
KI67积分光密度值 |
0.00 ± 0.00 |
14983.89 ± 2111.66 |
1199.39 ± 95.36 |
1332.82 ± 60.69 |
3990.57 ± 155.29 |
126.070 |
VEGF积分光密度值 |
1069.13 ± 222.53 |
19267.05 ± 1625.57 |
2268.06 ± 463.60 |
11037.04 ± 690.41 |
14468.77 ± 322.72 |
264.233 |
28 D |
CD31积分光密度值 |
1633.25 ± 92.43 |
4650.27 ± 108.86 |
1663.69 ± 31.69 |
2551.93 ± 403.92 |
5119.44 ± 506.21 |
93.522 |
KI67积分光密度值 |
0.00 ± 0.00 |
2042.49 ± 93.65 |
359.55 ± 13.15 |
2042.49 ± 93.65 |
1734.28 ± 580.56 |
40.644 |
VEGF积分光密度值 |
1069.13 ± 222.53 |
10899.12 ± 196.53 |
2268.06 ± 463.60 |
9656.78 ± 67.33 |
12688.50 ± 2131.57 |
86.335 |
3.2. 不同分组在不同时间点CD31、KI67、VEGF染色图像对比
免疫组化图像显示，实验1组(脑缺血 + 去骨瓣减压)在14天时血管新生(CD31)、细胞增殖(KI67)及血管生成因子(VEGF)表达均显著增强，且至28天时血管结构趋于成熟；硬脑膜切开(实验4组)虽部分促进修复，但血管有序性受损；单纯干预措施(实验2、3组)效果有限，与定量分析结果一致。图片结果(图1~6)进一步支持了缺血联合去骨瓣减压在血运重建中的协同效应及时间依赖性特征。
3.2.1. 各组14D CD31染色图像对比
假手术组CD31阳性染色区域稀疏，呈零星分布；实验1组(脑缺血 + 去骨瓣减压)染色密度显著增加，可见密集的棕黄色颗粒聚集于血管内皮，提示新生血管形成活跃；实验2组(单纯去骨瓣减压)染色强度与假手术组接近，无明显差异；实验3组(单纯脑缺血)染色密度中等，血管结构紊乱；实验4组(硬脑膜切开反转)染色强度较实验1组减弱，血管排列欠规则。见图片1如下，顺序为假手术组、实验1组、实验2组、实验3组、实验4组。
Figure 1. Comparison of 14D CD31 staining images of each group
图1. 各组14D CD31染色图像对比
3.2.2. 各组14D KI67染色图像对比
假手术组几乎无KI67阳性信号；实验1组细胞核内棕黄色颗粒广泛分布，神经元与胶质细胞增殖显著；实验2组仅少量阳性细胞散在分布；实验3组可见局部增殖灶，但范围有限；实验4组阳性细胞数量较实验1组减少，且分布不均。见图片2如下，顺序为假手术组、实验1组、实验2组、实验3组、实验4组。
Figure 2. Comparison of 14D KI67 staining images of each group
图2. 各组14D KI67染色图像对比
3.2.3. 各组14D VEGF染色图像对比
假手术组VEGF表达微弱；实验1组胞浆内棕黄色颗粒密集，血管周围染色尤为明显，提示VEGF高表达；实验2组仅局部弱阳性；实验3组表达中等，但分布不均；实验4组染色强度较实验1组降低，部分区域呈片状缺失。见图片3如下，顺序为假手术组、实验1组、实验2组、实验3组、实验4组。
Figure 3. Comparison of 14D VEGF staining images of each group
图3. 各组14D VEGF染色图像对比
3.2.4. 各组28D CD31染色图像对比
假手术组CD31表达持续低水平；实验1组血管网络密度进一步增加，新生血管结构成熟；实验2组染色强度较14D略有上升，但仍低于实验1组；实验3组血管密度下降，部分区域退行性改变；实验4组血管排列紊乱，染色强度显著低于实验1组。见图片4如下，顺序为假手术组、实验1组、实验2组、实验3组、实验4组。
Figure 4. Comparison of 28D CD31 staining images of each group
图4. 各组28D CD31染色图像对比
3.2.5. 各组28D KI67染色图像对比
假手术组KI67阳性细胞意外增多，可能与颅骨缺损应激相关；实验1组增殖信号几乎消失，提示早期增殖窗口关闭；实验2组仅零星阳性细胞；实验3组阳性细胞数量显著减少；实验4组仍可见少量增殖灶，但强度低于假手术组。见图片5如下，顺序为假手术组、实验1组、实验2组、实验3组、实验4组。
Figure 5. Comparison of 28D KI67 staining images of each group
图5. 各组28D KI67染色图像对比
3.2.6. 各组28D VEGF染色图像对比
假手术组VEGF表达仍处于基线水平；实验1组染色强度较14D减弱，但仍高于其他组；实验2组(单纯去骨瓣减压)VEGF表达显著升高，呈现弥漫性分布；实验3组表达下降，局部区域稀疏；实验4组染色强度介于实验1组与实验2组之间，但分布不均。见图片6如下，顺序为假手术组、实验1组、实验2组、实验3组、实验4组。
Figure 6. Comparison of 28D VEGF staining images of each group
图6. 各组28D VEGF染色图像对比
4. 讨论
本研究通过构建脑缺血合并颅骨缺损的SD大鼠模型，系统探讨了不同手术干预对缺血诱导的颅内外血运重建的影响。
4.1. 硬脑膜完整性对血管新生的双向调节作用
实验4组(硬脑膜切开反转)在术后28天的CD31表达(5119.44 ± 506.21)显著高于实验3组(单纯脑缺血，2551.93 ± 403.92)，但仍低于实验1组(脑缺血 + 去骨瓣减压，4650.27 ± 108.86) (F = 93.522, P < 0.001)。这一矛盾现象提示：硬脑膜切开可能通过降低颅内压促进早期侧支循环开放(术后14天CD31表达为5922.99 ± 333.35)，但长期来看，其破坏的机械屏障作用可能导致新生血管结构紊乱(术后28天CD31表达下降至5119.44)。从硬脑膜对颅内压的维持作用以及压力梯度对血管内皮细胞迁移的影响等方面可以推测，硬脑膜完整性可能通过维持脑组织–颅外组织的压力梯度，对血管内皮细胞定向迁移产生一定的影响。
4.2. 血管新生与细胞增殖的时序特征及干预特异性
在急性期(术后14天)，实验1组的KI67(14983.89 ± 2111.66)和VEGF(19267.05 ± 1625.57)表达均达到峰值，显著高于其他组(P < 0.001)，表明联合手术通过协同效应激活了早期增殖与血管生成信号。实验3组(单纯脑缺血)的VEGF表达(11037.04 ± 690.41)显著高于实验2组(单纯去骨瓣减压，2268.06 ± 463.60)，提示缺血本身是VEGF上调的主要诱因，而去骨瓣减压的机械刺激需联合缺血才能发挥协同作用。在亚急性期(术后28天)，实验1组的VEGF表达(10899.12 ± 196.53)仍显著高于实验3组(9656.78 ± 67.33) (P < 0.001)，但较术后14天下降43.4%，提示血管生成信号随时间自然衰减。
4.3. 干预方式对代偿性增殖的差异化调控
实验1组的KI67在28天仍保持较高水平(2042.49 ± 93.65)，显著高于实验4组(1734.28 ± 580.56)和实验3组(2042.49 ± 93.65) (F = 40.644, P < 0.001)，表明去骨瓣减压通过缓解缺血区机械压迫，延长了神经祖细胞的增殖周期。实验2组(单纯去骨瓣减压)的KI67在28天仅为359.55 ± 13.15，显著低于实验1组(P < 0.001)，提示缺乏缺血刺激时，单纯机械减压难以持续激活细胞增殖。假手术组的KI67始终为0，但颅骨缺损可能通过慢性低灌注应激诱导其他代偿机制(如胶质细胞活化)，需进一步通过GFAP等标志物验证。
4.4. 临床价值
本研究结果表明干预方式对血运重建的影响具有高度特异性，所有指标的组间差异均达统计学意义(P < 0.001)，且效应量较大。这些结果为临床决策提供了以下依据：(1) 脑缺血合并颅骨缺损时，去骨瓣减压联合血管再通(如实验1组)可最大化血运重建效益。(2) 硬脑膜切开虽可能减少早期梗死体积，但可能损害血管功能，建议术中尽量保留硬脑膜完整性或使用生物材料修复。(3) 术后14天内是调控VEGF/KI67通路的关键窗口期，延迟治疗可能导致代偿性增殖能力下降。
5. 结论
本研究证实，脑缺血联合去骨瓣减压手术通过协同激活VEGF/KI67/CD31通路，显著促进血管新生和细胞增殖，且硬脑膜完整性是维持血管功能的关键因素。未来需结合影像学动态监测血管形态及血流动力学变化，进一步验证上述分子机制，并探索靶向干预时序的治疗策略。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。