茶皂素对真菌液体发酵产纤维素酶的影响及酶学特性研究

Study on the Effect of Tea Saponin on Fungal Liquid Fermentation to Produce Cellulase and Its Enzymatic Characteristics

摘要: 本实验对厚垣镰孢霉HML278采用液体发酵产纤维素酶，加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%不同浓度的茶皂素，探究茶皂素对其产纤维素酶的影响。实验结果显示，加入0.6%浓度的茶皂素的纤维素酶活性最高。在酶学特性研究中，酶的最适温度为60℃，最适pH为6.4。在金属离子对酶活性的探究中，发现Li⁺、K⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺对酶促反应具有促进作用，其中Ca²⁺、Mn²⁺对酶促反应的促进作用最强；而Co²⁺、Al³⁺对酶促反应具有抑制作用。

Abstract: This experiment used liquid fermentation to produce cellulase from Fusarium graminearum HML278, and added tea saponin at different concentrations of 0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8%, and 1.0% to investigate the effect of tea saponin on its cellulase production. The experimental results showed that the cellulase activity was highest when 0.6% concentration of tea saponin was added. In the study of enzymatic characteristics, the optimal temperature and pH for the enzyme are 60˚C and 6.4, respectively. In the exploration of metal ions on enzyme activity, it was found that Li⁺, K⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, and Fe³⁺ have a promoting effect on enzymatic reactions, among which Ca²⁺ and Mn²⁺ have the strongest promoting effect on enzymatic reactions; Co²⁺ and Al³⁺ have inhibitory effects on enzymatic reactions.

1. 引言

纤维素酶是重要的酶制剂，广泛应用于生物能源、医药、食品、饲料、纺织、造纸、清洁用品等多个行业，属工业消耗的第三大酶类[1] [2]。纤维素在自然界中分布极为广泛且含量丰富，纤维素酶可将富含纤维素的工业废料和农副产品等有效转化，对于提高原料利用率、综合利用资源等具有重要意义。纤维素酶已广泛应用于纺织、造纸、饲料、食品及能源等行业。纺织行业：纤维素酶用于牛仔纺织物的生物去石、纺织物及服饰软化、纺织物纤维的生物抛光及纺织物表面染料的去除等方面。造纸行业：纸浆和纸张作为一种可循环利用的再生资源，其回收及利用对于节约能源、减轻环境污染具有重要意义，纤维素酶可以防止纸张变黄，显著提高纸张的亮度和清洁度。饲料行业：纤维素酶可以使营养物质更易被动物消化系统分解吸收，提高饲料的营养价值。食品行业：纤维素酶在食品行业的应用极其广泛，啤酒、白酒、酱油生产中大量应用[3]。在生物能源领域，纤维素酶可将自然界中蕴藏的生物质转化成乙醇等清洁燃料，不仅能缓解化石燃料的短缺，改善能源危机，缓解因人类过度开发利用导致化石燃料日益枯竭的现状，也有助于环境保护[4] [5]。

第二代生物乙醇以富含木质纤维素的玉米芯、秸秆、蔗渣等农林废弃物为原料降解为还原性糖，再发酵成生物乙醇，又称纤维素乙醇[6] [7]。广西是我国甘蔗生产的主要地区之一，蔗糖年产量约660万吨，产量占全国总量的一半以上，具有非常可观的蔗渣产量[8]。蔗渣纤维素含量达45%~50%，半纤维素22%~30%，其木质素分子质量和聚合度较低，并且含有丰富的多糖类物质，具有开发优势[9]-[11]，是纤维素乙醇产业来源丰富、价格低廉的优质生物质能原料，如能经生物转化成为燃料乙醇，具有很高的社会效益和经济价值[11] [12]。蔗渣的充分利用可为广西经济发展助力，减少焚烧污染环境，实现有机废弃物资源利用和环境保护效益的最大化。

纤维素是由100~1000个D-吡喃型葡萄糖由β-(1,4)-糖苷键连接的没有分支的同多糖，是地球上最丰富的可再生碳源物质[13] [14]。纤维素酶系主要有葡聚糖内切酶(endo-1,4-β-D-glucanase, E.C 3.2.1.4, EG)、葡聚糖外切酶(exo-1,4-β-D-glucanase, E.C 3.2.1.91, CBH，也称纤维二糖水解酶)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase, EC 3.2.1.21, BG)三类，纤维素酶系可协同水解纤维素为葡萄糖[15] [16]。

厚垣镰孢霉(Fusarium chlamydosporum)属于真菌，是镰刀菌属。项目前期从亚热带区域广西环江县木论国家自然保护区取样筛选得到高产纤维素酶菌株新种：厚垣镰孢霉Fusarium chlamydosporum HML278 [17]。发现厚垣镰孢霉HML278可产完整纤维素酶，分离纯化得到两种耐热新β-葡萄糖苷酶(BGFH1和BGFH2)，其中BGFH1分子量93 kDa，最适反应温度60℃，70℃以下稳定，pH 4~10之间较稳定，具有潜在的应用价值[18]。

茶皂素(tea saponin)又称茶皂苷或皂角苷，茶皂素具有很多表面活性性能，是一种十分优质的生物表面活性剂，除了具备与化学表面活性剂同样的性能外，生物表面活性剂还有能生物被降解、生产资本投入少以及在高温高压下能起作用等显著优势[19] [20]。茶皂素可以改变细胞通透性，添加后微生物细胞产酶会增多。本次实验对厚垣镰孢霉HML278采用液体发酵使其产纤维素酶，加入不同浓度的茶皂素，探究茶皂素对其产纤维素酶的影响。

2. 材料与方法

2.1. 试验材料与仪器

2.1.1. 供试菌种

厚垣镰孢霉HML278，河池学院微生物及植物资源开发利用广西高校重点实验室保存。

2.1.2. 培养基及实验试剂

1) DNS显色液，按照文献[10] [11]配制。

2) pH 4.8、0.05 mol/L柠檬酸缓冲液，按照文献[12] [13]配制。

3) 种子培养基：马铃薯琼脂糖培养基(PDA) [21] [22]。

4) 液体发酵培养基：称取NaNO₃ 2 g，K₂HPO₄ 1 g，KCl 0.5 g，MgSO₄ 0.5 g，FeSO₄ 0.01 g，麦芽糖10 g，酵母浸膏10 g，配制成1000 mL的培养基，pH自然，121℃，20 min [23]。

2.1.3. 主要仪器

分析天平，JA2003B，上海越平仪器有限公司；自动高压灭菌器，HVE-50，华粤企业集团有限公司；无菌操作工作台，SW-CJ-1F，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；立式全温振荡培养箱，MQL-621R，上海旻泉仪器有限公司；冷冻离心机，AvantiJ-E，美国贝克曼库尔特有限公司；紫外可见分光光度计，8453，美国安捷伦；电热鼓风干燥箱，DHG-9075A，上海一恒科学仪器有限公司。

2.2. 试验方法

2.2.1. 菌种的活化

在实验室中把保藏在冰箱的厚垣镰孢霉HML278菌种取出，在无菌操作工作台中将菌种接到灭好菌的PDA斜面培养基中，然后将其放入已调至28℃的恒温培养箱中培养3 d，待用。

2.2.2. 不同茶皂素浓度培养液的制备

取6个250 mL的三角锥瓶，量取150 mL发酵培养液于250 mL三角瓶中，加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%不同茶皂素，其中一瓶作空白对照。在温度28℃，摇床转速180 r/min条件下培养3 d。

2.2.3. 纤维素酶的粗酶提取

将摇床培养5 d后的培养液，用8层滤布过滤，用离心机5000 r/min，离心10 min，取其上清液即为粗酶液，将其放入冰箱暂存，待用[24]。

2.2.4. 葡萄糖标准曲线的制定[25]

精密称取50 mg无水葡萄糖(预先在100℃的恒温干燥箱中干燥至恒重)，放置于100 mL烧杯中将其溶解，而后将其用玻璃棒转移至50 mL的容量瓶中，定容，配制得其浓度为1 mg/ml的葡萄糖标准溶液。取6支试管，分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的葡萄糖标准溶液，然后按序加入蒸馏水至2.4 mL，添加2 mL DNS液，摇匀，用沸水煮沸5 min，取出将其置于冷水中冷却至室温，加蒸馏水全部稀释至10 mL，震荡摇匀。另外，再取一支试管，在不加葡萄糖标准液的情况下，按同样的方法制成空白对照液。于已调好波长为540 nm的紫外可见分光光度计下，测定光吸收值，并以吸收值A为横坐标，以葡萄糖含量(mg/mL)为纵坐标，绘制其标准曲线[26]。

2.2.5. 产酶活性的检验方法

1) 滤纸(FP)酶活测定

取稀释酶液1 mL，于25 mL具塞试管中，加pH 4.8、0.05 mol/L柠檬酸缓冲液1 mL，再加卷曲的滤纸1张约50 mg，50℃恒温60 min，取出加DNS显色液2 mL，让其反应终止，再将其置于沸水中水煮5 min，取出用冷水将其冷却至室温，再用蒸馏水定容至25 mL，摇匀，于紫外可见分光光度计在540 nm波长测定其吸收值，对照样先于沸水中水煮20 min灭活。三次平行试验，取其平均值[27]。

2) 酶活力单位定义

根据实际情况以及具体实验设计，本论文定义每h催化水解底物生成1 mol葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位U [28]。

3) 酶活力计算公式

$滤纸酶活力\left(\text{U/mL}\right)=\frac{葡萄糖\left(\text{mg}\right)\times \text{1}\left(\text{min}\right)\times \text{1000}\left(\mu \text{ mol/m mol}\right)}{\text{180}\left(\text{mg/mol}\right)\times \text{60}\left(\text{min}\right)\times 反应中酶液加入量\left(\text{mL}\right)}\times 稀释倍数$

2.2.6. 纤维素酶的酶学特性研究方法[29] [30]

1、不同pH对纤维素酶活性及酸碱稳定性的影响

1) 不同pH对纤维素酶活性的影响

分别配制pH值为3.0、3.4、4.0、4.4、5.0、5.4、6.0、6.4、7.0、7.4、8.0、8.4的柠檬酸缓冲液用于稀释粗酶液，分别测定其酶活，以最高酶活值为100%，比较纤维素酶在不同pH下酶促反应中的相对酶活力，最后确定最适酶促反应pH值。

2) 不同pH对纤维素酶酸碱稳定性的影响

分别配制pH值为3.0、3.4、4.0、4.4、5.0、5.4、6.0、6.4、7.0、7.4、8.0、8.4的柠檬酸缓冲液用于稀释粗酶液，在4℃下放置一夜后，在最适酶促反应条件下测定其酶活，以未经缓冲液处理过的粗酶液的酶活力为对照，对pH对酶的稳定性进行评价。

2、不同温度对纤维素酶活性及热稳定性的影响

1) 不同温度对纤维素酶活性的影响

在最适pH下，分别设定30℃、36℃、40℃、46℃、50℃、56℃、60℃、66℃、70℃、76℃、80℃、86℃在水浴中恒温1.5 h后，分别测定其酶活，以最高酶活值为100%，比较纤维素酶在不同温度下酶促反应中的相对酶活力，最后确定最适酶促反应的温度。

2) 不同温度对纤维素酶热稳定性的影响

取稀释酶液1 mL，分别设定30℃、36℃、40℃、46℃、50℃、56℃、60℃、66℃、70℃、76℃、80℃、86℃在水浴中恒温预处理1.5 h后，再按照常规方法分别测定其酶活，以未做特殊处理的粗酶液作对照，评价两种酶的热稳定性。

3、不同金属离子对酶活性的影响

在最适温度、pH条件下，向酶系中分别加入1 mL 0.01 mol/L的Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、B³⁺、Zn²⁺、Mo³⁺、Cu²⁺保温60 min后，测定酶的活性[31] [32]。

3. 结果与分析

3.1. 葡萄糖标准曲线的制作

取7支具塞刻度试管编号，分别加入浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液，见表1。

Table 1. Preparation of glucose standard curve

表1. 葡萄糖标准曲线制作

管号	1 mg/mL葡萄糖 标准液(mL)	蒸馏水	DNS	葡萄糖含量	光密度值
		(mL)	(mL)	(mg)	(OD-540 nm)
0	0	2.4	2.0	0	0
1	0.2	2.2	2.0	0.2	0.14462
2	0.4	2.0	2.0	0.4	0.26253
3	0.6	1.8	2.0	0.6	0.43178
4	0.8	1.6	2.0	0.8	0.55566
5	1.0	1.4	2.0	1.0	0.69939
6	1.2	1.2	2.0	1.2	0.85710

Figure 1. Glucose standard curve

图1. 葡萄糖标准曲线

可知线性回归的方程为y = 0.7138x + 0.0078，R² = 0.9983，说明线性关系良好，见图1。

3.2. 不同茶皂素浓度对产酶的影响

取6个250 mL的三角锥瓶，量取150 mL发酵培养液于250 mL三角瓶中，加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%不同浓度的茶皂素，其中一瓶作空白对照。

茶皂素对厚垣镰孢霉HML278液体发酵产纤维素酶具有促进的作用。其中添加0.6%的茶皂素对厚垣镰孢霉HML278液体发酵产纤维素酶的促进作用最大；当茶皂素浓度低于0.6%时，随着浓度的升高，其促进作用逐步增强；当茶皂素浓度高于0.6%时，随着浓度的升高，其促进作用逐渐降低，见图2。

Figure 2. Effect of tea saponin on cellulase production by Fusarium oxysporum HML278 during liquid fermentation

图2. 茶皂素对厚垣镰孢霉HML278液体发酵产纤维素酶的影响

3.3. 纤维素酶的酶学特性研究

3.3.1. 不同pH对纤维素酶活性的影响

分别配制pH值为3.0、3.4、4.0、4.4、5.0、5.4、6.0、6.4、7.0、7.4、8.0、8.4的柠檬酸缓冲液用于稀释粗酶液，分别测定其酶活，以最高酶活值为100%，比较纤维素酶在不同pH下酶促反应中的相对酶活力。

Figure 3. Effect of different pH values on cellulase activity

图3. 不同pH对纤维素酶活性的影响

酶促反应的最适pH为6.4。当pH低于6.4时，酶促反应随着pH的升高，酶促反应逐步增强；当pH高于6.4时，酶促反应随着pH的升高，酶促反应逐步被削减变弱，见图3。

3.3.2. 不同pH对纤维素酶酸碱稳定性的影响

分别配制pH值为3.0、3.4、4.0、4.4、5.0、5.4、6.0、6.4、7.0、7.4、8.0、8.4的柠檬酸缓冲液用于稀释粗酶液，在4℃下放置一夜后，在最适酶促反应条件下测定其酶活，用未经柠檬酸缓冲液处理过的粗酶液的酶活力为对照组。以最高酶活值为100%，比较纤维素酶在不同pH下酶的酸碱稳定性。

Figure 4. Effect of different pH values on the acid-base stability of enzymes

图4. 不同pH对酶酸碱稳定性的影响

当pH为5.0~7.4时，酶的活性维持在50%以上，说明当pH为5.0~7.4时，酶具有较强的酸碱稳定性，其中pH为6.4时，酶的活力最高，则酶的酸碱稳定性最强；当pH低于5.0和pH高于7.4时，酶的活性都较低，同时可以看出当pH低于5.0相较于pH高于7.4时，酶的活性显然更低，则表明此酶更耐碱，不耐酸，见图4。

3.3.3. 不同温度对纤维素酶活性的影响

在最适pH下，分别设定30℃、36℃、40℃、46℃、50℃、56℃、60℃、66℃、70℃、76℃、80℃、86℃在水浴中恒温60 min后，分别测定其酶活，以最高酶活值为100%，比较纤维素酶在不同温度下酶促反应中的相对酶活力。

Figure 5. Effect of different temperatures on enzyme-producing activity

图5. 不同温度对产酶活力的影响

酶促反应的最适温度为60℃。温度在30℃~60℃时，随着温度的升高，温度对酶促反应的作用也在逐步增强；在65℃时，相对酶活力为71.5%，还具有较强的酶活力；在温度为70℃、76℃、80℃、86℃时，纤维素酶的酶活力已不足40%，说明酶促反应作用较低，见图5。

3.3.4. 不同温度对纤维素酶热稳定性的影响

取稀释酶液1 mL，分别设定30℃、36℃、40℃、46℃、50℃、56℃、60℃、66℃、70℃、76℃、80℃、86℃在水浴中恒温预处理1.5 h后，再按照常规方法分别测定其酶活，以未做特殊处理的粗酶液作对照，评价两种酶的热稳定性。

Figure 6. Effect of different temperatures on the thermal stability of cellulase

图6. 不同温度对纤维素酶热稳定性的影响

温度在46℃~66℃范围时，纤维素酶具有较强的热稳定性；其中温度为60℃时，酶的热稳定性最强；温度小于46℃和大于66℃时，酶的热稳定性较弱，说明低温能抑制酶的活性，高温对酶的抑制作用更强，甚至能使酶失活，见图6。

3.3.5. 不同金属离子对纤维素酶活力的影响

在最适温度、pH条件下，向酶系中分别加入1 mL 0.01 mol/L的Li⁺、K⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Al³⁺、Co²⁺、Fe³⁺保温60 min后，测定酶的活性。

Table 2. Effects of metal ions on cellulase activity

表2. 金属离子对纤维素酶活性的影响

金属离子	纤维素酶的相对酶活力(%)
对照组	100
Co^2+	45
Al^3+	71
K^+	116
Li^+	124
Zn^2+	178
Mn^2+	202
Fe^3+	227
Mn^2+	262
Ca^2+	298

在该酶中加入Li⁺、K⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺后，该酶的酶活力增强，其中加入Ca²⁺、Mn²⁺后酶活力最强；而加入Co²⁺、Al³⁺后，该酶的酶活力减弱。说明Li⁺、K⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺对酶促反应具有促进作用，其中Ca²⁺、Mn²⁺对酶促反应的促进作用最强；表明这些金属离子可能在酶的催化过程中起到了重要的辅助作用，可能是调节酶的构象和活性中心状态来提高活性水平，增强了酶的催化效率。而Co²⁺、Al³⁺对酶促反应具有抑制作用，这些抑制效果可能与这些金属离子干扰了酶的活性中心或改变了酶的构象有关，重金属离子与酶活性中心的关键基团相互作用，形成稳定的复合物，阻断酶与底物的结合，导致酶活性下降。见表2。

4. 结论与展望

茶皂素作为一种生物表面活性剂，对于细胞膜的通透性具有改善的作用，通过此次试验发现，当茶皂素浓度为0.6%时，所得到的厚垣镰孢霉HML278液体发酵产纤维素酶的活性最高，过多或过少，酶的活性都明显较低。

本次对厚垣镰孢霉HML278液体发酵产纤维素酶进行酶学特性研究，得出酶的最适温度为60℃，最适pH为6.4。在温度为60℃时，酶的热稳定性较强，在pH为6.4时，酶的酸碱稳定性较强。在金属离子对酶活性的探究中，发现Li⁺、K⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺对酶促反应均具有促进作用，其中Ca²⁺、Mn²⁺对酶促反应的促进作用最强；而Co²⁺、Al³⁺对酶促反应具有抑制作用。