1. 引言
miRNA作为一类在生物基因组中广泛存在的非编码蛋白RNA，长度约为20~24个核苷酸[1]，许多报道证实了miRNA在生物学成长过程中发挥必要的调节控制功能[2]，miRNA在细胞中的异常表达会导致病症发生，是病变的重要因素，如癌症[3] [4]、心血管类疾病[5]、糖尿病[6]等，故此，将miRNA作为疾病诊断的重要标志物，检测miRNA在细胞内的表达水平在疾病早期的诊断中具有重大研究价值。但由于miRNA存在序列少、同源性高和含量低等的特点[7]，是定量分析检测miRNA的一大难点，检测miRNA的主要方法有实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR法) [8] [9]、微阵列法[10] [11]和Northern印迹法[12]等，由于其操作复杂、耗时长且试验成本高等局限性，因此需要建立一种简单快速有效的miRNA检测方法。
催化发夹自组装(CHA)技术于2008年由YIN等提出[13]，是一种无需酶的新型等温核酸扩增方法，室温下不经人工干预，仅可通过一对发夹探针与靶目标物DNA链结合即可实现N倍信号扩增[14]。其优势包括反应体系简单、高灵敏度、高特异性、低成本及常温自动化操作，克服了传统技术复杂、成本高和易受环境影响等问题。目前该技术已衍生出荧光[15]、电化学[16]、比色法[17]等多种检测手段，是一种多功能化可靠的技术。本研究以AgNCs纳米复合材料[18]作为电极修饰材料，结合CHA技术构建出信号放大策略为目的的电化学生物传感器，用于检测let-7amiRNA。验证了CHA结合电化学传感检测miRNA的可行性，有望为疾病快速诊断提供新思路。
基于此，设计出一对部分碱基互补的发夹探针链H1、H2，二者可在同一溶液中自由游离。当目标物let-7amiRNA存在时，即可触发CHA反应。H1发夹柄的3'端富含胞嘧啶，可用于探针银纳米簇(DNA-AgNCs)，而H2发夹的末端带有氨基。以let-7amiRNA作为目标物，首先在玻碳电极表面修饰一层导电性良好的纳米金，后借助Au-NH键将H2修饰至电极表面，使其作为捕获探针。封闭修饰电极的活性位点后，当目标物显现，便会立即形成DNA-AgNCs-H2双链复合物，进而引发CHA反应。此时，具有良好导电性的DNA-AgNCs (荧光基团)会被修饰到电极表面，增强电流信号，并引发链置换，促使反应不断连续进行，最终实现信号的扩增。
2. 实验部分
2.1. 主要仪器与试剂
SVC-SOOOVR高精度全自动交流稳压器(上海弘乐电气有限公司)；JA1203N电子天平(上海菁海仪器有限公司)；CHI660E电化学工作站(上海辰华科技有限公司)；JEM-2100透射电子显微镜(日本JEOL)。
硝酸银(AgNO3)和硼氢化钠(NaBH4)购自国药集团化学实际有限公司；氯化钾(KCl)购自天津市永大化学试剂有限公司；亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6·3H2O)购自天津市大茂化学试剂厂；铁氰化钾(K3Fe(CN)3)购自湖南湘中地质实验研究所；6-巯基己-1-醇(MCH)购自上海茂克林生化科技有限公司；氧化铝(Al2O3, 50 nm)抛光粉购自上海勒顿实业有限公司，所用化学试剂均为分析级试剂，未经再次纯化。溶液采用纯净水水配制。实验用水均为纯净水。
寡核苷酸序列均购自上海生工生物技术有限公司合成和纯化所得。所需核酸序列均已进行纯化。序列如表1所示，所用单链DNA/RNA均为冻干粉形式存在，使用前先用离心机以4000 rpm的转速离心后，加入适量的纯净水制备不同浓度溶液，置于漩涡震荡仪充分混匀备用。不使用时低温避光保存。实验中所用到的PBS均自行配置。
Table 1. Base sequences of the designed DNA oligonucleotides
表1. DNA寡核苷酸链碱基序列
寡核苷酸 |
序列(5'~3') |
DNA |
AACT ATAC AACC TACT AC TTGTATAGTT GCT AATCG TG CCAC CCAC CCTT |
H2 |
NH2-(CH2)6-GGGG TGGG GTGG GGTG GGA GA CGATT AACT ATAC AACC TACT AC TTGT ATAG TT GCT |
let-7a |
UGAG GUAG UAGG UUGU AUAG UU |
miR-21 |
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA |
miR-221 |
AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC |
miR-378 |
ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG |
2.2. DNA发夹模板合成银纳米簇
以DNA链为模板，用化学还原法制备银纳米簇。首先，取15 μL DNA (200 μM)、30 μL的Mg(NO3)2 (90 mM)和200 μL的20 mM PBS (pH = 7.0)缓冲液中混合，再加入新鲜配置的10μL AgNO3 (600 μM)溶液，在4℃下孵育30 min，使Ag+与发夹DNA链上的氨基互补配对后充分结合。然后将现配置的30 μL NaBH4 (600 μM)加入混合物中，剧烈震荡2分钟，混匀后在4℃下避光下放置2 h后得到有荧光性质的DNA-AgNCs，不使用此溶液时，放置恒温4℃下避光保存即可。
2.3. 电化学生物传感器的制备
电化学生物传感器的制备如图1所示，首先将玻碳电极(GCE，半径1 mm)用氧化铝细粉打磨抛光至电极表面光滑一致，蒸馏水清洗后室温下自然晾干，用循环伏安法测定其电化学性能，使氧化还原电位峰差值在0.1 V以内，说明电极处理干净。接着将电极浸入浓度为3%的氯金酸溶液中，在−0.2 V电压沉积30秒，使电极表面修饰得到一层均匀的纳米金，在去离子水中蘸洗，制得dpAu/GCE；然后用移液枪取5 μL浓度为0.5 μmol/L H2溶液滴落于电极表面，盖帽，并于4℃下孵育过夜，制得H2/dpAu/GCE；然后，取5 μL 1 mmol/L的MCH滴涂在修饰电极表面上，孵育60 min，得到MCH/H2/dpAu/GCE；最后在修饰电极表面滴涂各5 μL的DNA-AgNCs和let-7amiRNA，室温孵育60 min。传感器制备成功，过程中每一步都需要在清水中蘸洗，以除去未反应的滴涂物。
Figure 1. Schematic diagram of the sensor preparation
图1. 实验步骤原理简示
2.4. 电化学测量
采用循环伏安法(CV)测定电化学特性，对修饰的电极进行表征即进行以下操作，用修饰后的玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极作为对电极。设置参数：电位范围为−0.2 V~0.6 V，扫描速度为0.1 V/s，扫描段为4次。利用差分脉冲伏安法(DPV)在铁氰化钾溶液中进行定量检测，增加电化学检测灵敏度，DPV电位扫描范围为0.3 V~−0.1 V，振幅设置为0.01 V，调制时间为2 s。DNA-AgNCs纳米材料使用TEM进行形貌表征。
3. 结果与讨论
3.1. DNA-AgNCs的电镜表征
使用透射电子显微镜(TEM)对荧光基团DNA-AgNCs的形貌和特征进行表征(图2)。DNA-AgNCs拥有良好的光稳定性和生物相容性。DNA-AgNCs纳米粒子的形状与大小受DNA的限制，所制备的银纳米簇表现出圆球形结构和尺寸分散均匀，适用于生物传感。
Figure 2. TEM image of DNA-AgNCs
图2. DNA-AgNCs的透射电镜图
3.2. 修饰电极的表征和原理
采用循环伏安法(CV)对所制备的生物传感器进行电化学表征，如图3所示。GCE (曲线a)为裸电极未修饰任意活性物质，引入一层纳米金后，由于其优良导电率和催化活性，得到了电流信号相对于裸电极有明显的升高(曲线b)。利用Au-NH键将H2固载到修饰电极表面后，因DNA生物大分子，阻抗较大，因此CV电化学信号降低(曲线c)。同理，使用MCH来封闭非特异性结合位点时，信号大幅度下降(曲线d)。以上实验结果符合预期设想，证明该传感器制备成功。
a: GCE, b: DpAu/GCE, c: H2/DpAu/GCE, d: MCH/H2/DpAu/GCE.
Figure 3. CV curves of different modified electrodes
图3. 不同修饰电极的循环伏安图
3.3. 实验条件优化
为实现传感器在传感分析检测中性能的最大化，本研究对传感器的制备流程及测试条件展开了全面优化。着重探究目标物对所制备的电化学传感器电信号的作用，测定了在有无目标物miRNA情况下的差分脉冲伏安法(DPV)电流响应。
为了确定最佳实验条件，本研究系统考察了不同催化发夹自组装(CHA)反应时间(5、10、30、45、60、90、120分钟)对传感器性能的影响。实验数据如图4(B)所示，随着孵育时间的延长，电流响应值逐渐上升。当孵育时间达到60分钟时，电流响应值达到稳定状态且为最大值。这表明在该时间点，CHA反应充分进行，DNA-银纳米簇(DNA-AgNCs)与目标物let-7amiRNA (物料比1:1)在电极表面的反应达到最佳平衡。
基于上述实验结果，本实验最终选择将DNA-AgNCs和let-7amiRNA (1:1)滴加于电极表面后，电极孵育60分钟作为最优实验条件。在该条件下，传感器展现出最为优异的检测分析性能，能够为后续的检测工作提供稳定、可靠的数据支持。
(A) (B)
Figure 4. Optimization of experimental conditions. (A) Effect of target; (B) Effect of reaction time
图4. 实验条件优化(A)目标物的影响(B)反应时间的影响
3.4. 原理讨论
本研究构建信号放大的传感器检测miRNA，主要依托催化发夹自组装(CHA)技术。其核心原理在于验证反应前后目标物对所制备的电化学传感器电信号产生的作用。差分脉冲伏安法(DPV)具有较高的灵敏度，采用DPV测定有无目标物miRNA时的电流响应。
从图4(A)的实验数据能够直观地看出，在未添加目标物的情况下，传感器仅呈现出极为微弱的电流信号，表明此时电极表面的电化学反应程度很低。而当向体系中加入物料比为1:1的DNA-银纳米簇(DNA-AgNCs)和任意浓度的let-7a类miRNA后，峰响应电流值显著增强，产生了较强的信号。这一现象充分说明，目标物的加入促使电极表面发生了更为活跃的电化学反应，引发了显著的电流变化。此次实验结果不仅明确了目标物对传感器电信号具有显著影响，同时也验证了在有目标物存在的情况下，利用该电化学生物传感器进行检测实验具备可行性，为后续基于CHA技术的miRNA检测研究提供了有力的实验依据和方向指引。
进一步深入探究该传感器的工作机制，研究出其关键在于巧妙设计的核酸结构与CHA反应的协同作用,CHA技术原理初步于2008年被提出，优势在于与其他技术结合得到更高性能的检测传感，成为一大热点。如图1所示，设计一对部分碱基互补配对的特异性发夹链H1、H2，同时以单链let-7amiRNA为引发链。利用H1发夹末3'端富含胞嘧啶这一独特的结构特征，通过一系列化学合成得到簇状结构且带有荧光性质的DNA-AgNCs；而H2则被设计为5'端为富含鸟嘌呤，另一发夹端带有氨基的特殊结构。在初始状态下，DNA-AgNCs和H2两端发夹未打开时可稳定存在同一溶液体系中，当靶目标物miRNA出现时，miRNA凭借碱基互补配对原则与DNA-AgNCs实现特异性结合，DNA-AgNCs原本茎环结构被打开后暴露出teoheld区呈链状，形成miRNA-DNA-AgNCs的复合物，如图1中①；而后DNA-AgNCs暴露出与H2互补的序列，与H2粘性末端链杂交，形成DNA-AgNCs-H2杂交双链，如②进行；此时靶标miRNA被释放出参与下一轮CHA反应，随后进行一轮链置换反应，同时将导电性能好的DNA-AgNCs被修饰在电极表面，于③所示。
如图5所示，经历多次循环，催化出大量的DNA-AgNCs-H2链，更多miRNA链被持续激活，固载在电极表面的DNA-AgNCs被多次激发，达到信号扩增的目的。此机理工作中，无需酶催化、常温即可发生自发系数扩增反应，具有较强的灵敏度与特异性。
Figure 5. Comparison of signals before and after CHA’s autonomic response
图5. CHA自主反应前后信号对比
3.5. 线性响应
选择上述最优实验条件下，测定系列浓度内miRNA的响应峰电流，采用DPV法进而探究所构建化学传感器的灵敏度。在50 pM~100 nM范围浓度内，DPV的还原峰峰值持续增大(图6(A))，并呈现良好线性关系(图6(B))，线性方程为I(μA) = 19.271lgC(pg·mL−1) + 1.6592，这是由于miRNA不断置换引发更多的CHA反应，修饰电极上更多的DNA-AgNCs被固载，电流信号相继提升，在100 nM浓度下达到最高信号。经计算，检出限(S/N = 3)为16.67 pM，相关系数(R)为0.9715。该检测策略拥有较低的检测限和较宽数量级的检测范围，显示了优良的检测性能。
3.6. 选择性研究
为评估该体系是否能特异性识别目标物let-7amiRNA的序列，在不改变其他实验条件下，选用三组不同序列组的miRNA(miR-21, mi-221, miR-378)进行选择性实验，与目标物相比，其他三组非靶标链的目标物电流信号强度无显著性变化(图7)。此项数据表明，基于CHA反应原理制备的电化学生物传感器只有let-7amiRNA能够触发并产生强电流响应，而其他miRNA目标物检测的信号强度无法实现相应高度，该方法证实了制备的电化学传感器对let-7amiRNA实施的选择性研究表现出良好的结果。
(A) (B)
Figure 6. (A) Electrochemical signal in the concentration range of 50 pM~100 nM (a-g: 0.05, 0.1, 0.5, 2, 5, 50, 100 nM); (B) Calibration curve between the current peak and the logarithm of the concentration of miRNA in the concentration range of 50 pM~100 nM
图6. (A) 50 pM~100 nM浓度范围内(a-g: 0.05, 0.1, 0.5, 2, 5, 50, 100 nM)的电化学信号；(B) 50 pM~100 nM浓度范围内电流峰值与miRNA的浓度对数之间的校准曲线
Figure 7. Study of the selectivity of the CHA method
图7. CHA方法的选择性研究
4. 结论与分析
综上所述，本研究成功结合本研究成功构建了一种基于DNA-银纳米簇和等温无酶催化发夹自组装技术的新型电化学生物传感器，用于let-7a miRNA的检测。通过合理设计发夹链和巧妙利用DNA-AgNCs的优异性能，实现了对目标miRNA的特异性捕获和信号放大。该生物传感器在0.5 nM~1000 nM浓度范围内对let-7a miRNA具有良好的线性响应，检测限低至16.67 pM，且具有良好的特异性、稳定性和重复性。即设计一对部分碱基互补的发夹链H1和H2。H1用以合成DNA-AgNCs (信号探针)，在玻碳电极表面沉积一层dpAu，增加电活性。H2 (捕获探针)通过Au-NH键固载到修饰电极表面，存在目标物let-7a miRNA和DNA-AgNCs时，诱发CHA反应，将DNA-AgNCs置换到电极表面，产生电化学响应值放大的信号。该电化学传感器具有较低的检出限和良好的灵敏度与特异性、常温下自动化操作的特性，本文的研究为更快检测体内微量的let-7a miRNA目标物提供了线索，有望在未来的医学领域检测得到更广泛的研究和应用。