肠球菌poxtA基因的遗传多样性及进化研究进展

Genetic Diversity and Evolutionary Research Progress of the poxtA Gene in Enterococcus

摘要: 肠球菌作为重要的条件致病菌，其多重耐药性(MDR)特别是对利奈唑胺的耐药性日益严峻，对临床治疗构成重大挑战。poxtA基因作为ABC-F家族核糖体保护蛋白的编码基因，可介导肠球菌对恶唑烷酮类、氯霉素类和四环素类药物的耐药性。本文介绍了poxtA基因的发现、功能和基因环境的多样性，并系统总结了该基因在全球范围内的分布与流行特征。poxtA基因多位于质粒中，与插入元件IS1216E密切相关，且常与optrA、cfr、fexB等耐药基因共携带。poxtA基因广泛分布于人类、动物和环境来源的肠球菌中，其中屎肠球菌和粪肠球菌为主要携带菌种，属于克隆复合群17 (CC17)的菌株在临床环境中占据主导地位。需要注意的是，兽用抗生素的滥用加速了poxtA的进化与传播。需加强耐药基因的跨宿主传播监测，优化抗生素使用策略，以避免利奈唑胺耐药基因的流行。

Abstract: Enterococcus, as a critical opportunistic pathogen, poses escalating challenges in clinical treatment due to the rising prevalence of multidrug resistance (MDR), particularly linezolid resistance. The poxtA gene, encoding an ABC-F family protein, mediates resistance to oxazolidinones, phenicols, and tetracyclines. This article reviews the discovery, functional role, and genetic environment diversity of the poxtA gene, while systematically summarizing its global distribution and epidemiological characteristics. The poxtA gene is predominantly located on plasmids, closely associated with the insertion element IS1216E, and frequently co-carried with resistance genes such as optrA, cfr, and fexB. It is widely distributed in Enterococcus strains of human, animal, and environmental origins, with E. faecium and E. faecalis serving as primary carriers. Strains belonging to clonal complex 17 (CC17) dominate clinical settings. Notably, the misuse of veterinary antibiotics has accelerated the evolution and dissemination of poxtA. Enhanced monitoring of cross-host transmission of resistance genes and optimized antibiotic stewardship are imperative to curb the spread of linezolid resistance determinants.

1. 引言

肠球菌属于条件致病菌，它们主要定植在人类和动物的肠道中。肠球菌引起的感染主要包括尿路感染、心内膜炎和血流感染[1]。2022年，在中国抗菌药物耐药监测系统(CARSS)和中国细菌耐药监测网(CHINET)收集的所有临床分离株中，屎肠球菌和粪肠球菌的检出率均为革兰阳性菌的前三位，仅次于金黄色葡萄球[2]。

近来，多重耐药(MDR)肠球菌的数量不断增长，其流行和传播给临床治疗带来更大的挑战。在我国，约67%的肠球菌具有多重耐药性。在人类来源的肠球菌中，近50%为MDR表型，且屎肠球菌多于粪肠球菌。而MDR粪肠球菌更多地来源于牲畜和农场环境[3]。据调查显示，2021~2022年我国万古霉素耐药肠球菌(VRE)在患者来源的革兰阳性菌中的检出率为1.6%，利奈唑胺非敏感粪肠球菌和屎肠球菌的检出率均有明显升高[4]。大多数携带恶唑烷酮类耐药基因的肠球菌属于粪肠球菌或屎肠球菌，它们是人类和动物中的主要肠球菌种类，也是全球最重要的革兰阳性院内病原体[5]。

利奈唑胺是美国食品药品监督管理局(FDA)首个批准用于临床治疗的人工合成恶唑烷酮类抗生素，通过与细菌23S rRNA的肽基转移酶中心结合来抑制细菌蛋白质的合成。主要用于治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)及耐万古霉素肠球菌(VRE)引起的肺炎、皮肤及软组织感染，是临床环境中针对多重耐药革兰阳性菌感染的最后手段之一[6]。因此利奈唑胺耐药肠球菌(LRE)的增多和传播具有很大的风险和危害。

2. poxtA基因概述

2.1. poxtA基因的发现与作用机制

恶唑烷酮类抗生素的耐药机制主要分为基因突变，如23S rRNA、编码核糖体蛋白L3、L4、L22的基因突变，以及获得性耐药基因cfr及其变体、optrA和poxtA。poxtA基因编码ABC-F家族核糖体保护蛋白，其通过药物置换的耐药机制，驱动结合在核糖体上的抗生素解离，使得细菌被抗生素抑制的蛋白质翻译过程得到恢复，从而介导细菌对恶唑烷酮类、苯酚类和四环素类药物的敏感性降低[7]。2018年，poxtA首次被发现于意大利一名病人来源的MRSA中并被报道[7]。同年，在希腊的一株屎肠球菌相关的研究中也报道了poxtA基因[8]。但有研究表明，poxtA出现的实际时间早于它被报道的时间。在2016之前，poxtA就已在临床肠球菌中出现和传播[9]。2021年，在玻利维亚查科人类来源的鸡肠球菌中，发现了poxtA样基因poxtA2，在同年报道的韩国动物来源的粪肠球菌中，也发现了同样的poxtA2序列[10]。经过对其基因环境的分析，研究者们推断poxtA2为poxtA的祖先[11]。

2.2. poxtA基因对肠球菌耐药表型的影响

携带poxtA基因的肠球菌常对四环素及氟苯尼考耐药，而对利奈唑胺的表现，可能为敏感、中介或耐药[12] [13]，耐药的MIC值从8到32 mg/L不等。我国江苏省某养殖场猪源肠球菌中的poxtA阳性率为20.9%，这些菌株均对氟苯尼考、四环素耐药，而对利奈唑胺的耐药率27.14%，因此poxtA阳性菌株不一定会对利奈唑胺耐药，该基因功能尚待深入探讨[14]。poxtA与其他恶唑烷酮类耐药机制共同存在时，可导致更高水平的利奈唑胺MIC值。有报道称在西班牙分离得到的5株同时携带poxtA和optrA基因的菌株中，有4株引起了侵袭性院内感染，包含腹腔脓肿、关节感染、腹水感染和菌血症[15]。

2.3. poxtA在肠球菌中的分布与流行情况

虽然poxtA在中国临床标本的检出率较低且有关报道相对较少[16]，但poxtA基因目前已广泛存在于人类、动物和环境中。屎肠球菌是最常见的携带poxtA基因的肠球菌。最新的研究显示，在比利时临床分离的LRE中，poxtA基因在利奈唑胺耐药粪肠球菌(LREfs)和利奈唑胺耐药屎肠球菌(LREfm)中的检出率分别为3%和23% [17]。在西班牙，一项对临床2015~2018年LRE分离株的研究显示，poxtA存在于6.2%的LRE菌株中，其中LREfm和LREfs分别占比13.9%和1.6% [15]。2017年，对中国养殖场中猪和鸡的粪便拭子进行肠球菌的分离和检测，发现8.65%的屎肠球菌和0.73%的粪肠球菌携带poxtA基因，这些阳性菌株来自中国的八个省份，表明了poxtA在中国食用动物中的广泛传播。在波兰动物来源的食品样本中，26.9%的分离株为LRE，其中64%携带poxtA基因，均为粪肠球菌[18]。在日本农场环境中，poxtA阳性肠球菌的检出率也高达6.8%，包含了屎肠球菌、希拉肠球菌和泰国肠球菌[13]。在中国养殖场猪来源的分离株中也检测到了携带poxtA基因的希拉肠球菌和酪黄肠球菌[19]。可以看出，在人类来源的样本中，屎肠球菌为携带poxtA的主要优势菌株，而动物相关来源的poxtA阳性的肠球菌属菌株，种类则更加丰富。需要注意的是，在海洋环境中也有poxtA基因的检出。研究者们在意大利沿海地区泥沙样本中发现了3株携带poxtA基因的屎肠球菌[12]。除了患病宿主，poxtA也被发现存在于健康动物和人群中。针对葡萄牙健康志愿者的肠道菌群，研究者们进行了筛选和鉴定，发现了携带poxtA的屎肠球菌[20]。除此之外，在西班牙健康的猪、狗、白鹳和养猪户的鼻腔或气管标本中，也都发现了LRE，且白鹳所携带的LRE为poxtA阳性的屎肠球菌菌株。因鸟类的迁徙性及活动范围大，其携带的poxtA基因更易传播到其他生物系统[5]。

3. poxtA基因的遗传多样性

3.1. poxtA与其他耐药基因的共携带

poxtA在临床环境中既可作为单一的恶唑烷酮类耐药基因存在于肠球菌中，也常与optrA共同携带[19]。在近期的报道中，也证实了同时携带optrA、poxtA、cfr肠球菌的存在[19] [21]。同时携带三个恶唑烷酮类获得性耐药基因的酪黄肠球菌对利奈唑胺的耐药性(MIC = 16 mg/L)明显高于同研究中仅携带poxtA或携带poxtA和optrA的肠球菌(MIC ≤ 4 mg/L)。poxtA也常与其他抗菌药物耐药基因共携带，如氟苯尼考耐药基因fexB和poxtA基因在屎肠球菌中被同时检测到[22]。同时携带四个恶唑烷酮和氟苯尼考耐药基因(fexB、poxtA、fexA、optrA)的屎肠球菌P47，具有较高的利奈唑胺(8 mg/L)和氟苯尼考(256 mg/L) MIC [23]。在poxtA的上游，还常检测到四环素抗性基因tet (M)和tet (L)的存在[12] [15]。poxtA与其他耐药基因的共携带使得利奈唑胺抗性与氟苯尼考抗性常同时出现，对临床最后手段抗生素和兽用抗生素的同时耐药，加大了人畜耐药基因传播的风险。并且，常赋予细菌更明显的耐药性和更复杂的耐药表型，给临床治疗带来更大的挑战和困难。超过95%利奈唑胺耐药的肠球菌同时对多种抗生素耐药，特别是四环素类和大环内酯类[18]。

3.2. poxtA的位置和相关的移动性元件

大多数poxtA位于质粒上，但也有poxtA曾在染色体中出现，相关研究的S1-PFGE杂交结果提示了其在染色体和质粒的双重位置[12]。移动性元件(MEG)促进了poxtA的传播和流行。在大部分携带poxtA的质粒中，IS1216E元件多以相同方向插入到poxtA的两侧，也有IS1216E以相反方向排列于poxtA2侧翼的报道[24]。fextB也常与IS1216E相关联，位于poxtA的上游或下游[25]。IS1216样元件通过介导poxtA-IS1216片段的重组，促进了poxtA的传播和流行。Tn6246、Tn6657和Tn6349均是被报道的能够携带poxtA和fexB基因的转座子[26]。在意大利一项研究中，希拉肠球菌和屎肠球菌分离株携带poxtA的质粒仅共享Tn6657样区域，表明转座子在肠球菌中的广泛传播[12]。

3.3. poxtA阳性肠球菌的多种序列类型

从不同地区和物种中分离出的poxtA阳性肠球菌的序列类型(ST)具有多样性。在一项针对比利时2013~2021年期间LRE的研究中，poxtA阳性粪肠球菌ST型均被认定为480，而携带poxtA基因的屎肠球菌则为ST18和ST117，且该ST117菌株同时携带van基因[17]。在西班牙一项针对2015~2018年临床分离菌株的研究显示，同时携带optrA和poxtA基因的屎肠球菌分离株属于ST25、ST323和ST17，而同时携带optrA和poxtA基因的粪肠球菌属于ST480。仅携带poxtA基因的屎肠球菌分离株属于ST117 [15]。ST17、ST18、ST117和ST323均属于克隆复合群17 (CC17)，它是与医院环境高度适应的遗传谱系。ST17是医院相关分支A1的祖先，后被命名为CC17，随着适应性原件的不断积累，现CC17屎肠球菌在医院感染中已占有很大的优势，包括的ST型别有17、117、78、18、203、323、725等[27]。同样，在巴基斯坦临床标本中分离得到的poxtA阳性LREfm，除一株不可分型外，均属于CC17 [21]。由此可见，克隆复合群17的poxtA阳性屎肠球菌已在临床环境中广泛传播和流行。并且，在家畜、野生动物和环境中已有关于CC17屎肠球菌的多次报道，需警惕其引起人畜共患疾病并转移到人类的风险[28]。除CC17外，poxtA阳性屎肠球菌近期也被证明聚集在另一个克隆复合体——CC94 [12]。作为传统分支的CC94在患者标本中的频繁出现，表明了它正在向医院环境的扩散，以及LRE危害性的不断扩大[3]。在我国，宠物来源的LRE分离株呈现多种ST型，其中LREfm主要为ST80 [29]，食用动物来源的poxtA阳性屎肠球菌也涵盖了多种ST型别，如ST29、ST156、ST1818、ST1819和ST1820 [19] [23]。

4. 对poxtA基因传播和进化的相关研究

4.1. poxtA基因的传播方式

poxtA基因同时存在克隆传播和水平转移传播两种方式。通过MLST分型、S1-PFGE、Southern blot和全基因组测序等研究方法，发现poxtA阳性利奈唑胺耐药菌株具有多样性的来源及复杂的基因遗传环境[14]。大量研究已证明，poxtA基因能够实现种内或种间的转移，如从屎肠球菌转移至屎肠球菌或粪肠球菌，或是从希拉肠球菌转移至屎肠球菌[12]，并且不同国家和地区间的poxtA基因环境也存在一定的相似性[13] [19]。有研究发现Inc18质粒和IS1216E介导的水平转移及克隆传播共同促进了猪场poxtA的传播。共轭质粒的水平转移是耐药基因传播的重要途径，而Inc18家族包含重要的共轭质粒，其广泛存在于肠球菌中，对poxtA基因的传播发挥了重要作用[30]。通过全基因测序发现，来自中国某猪场的肠球菌poxtA质粒，大部分(6/7)属于Inc18家族的rep2质粒[19]。也有研究表明，poxtA阳性屎肠球菌和粪肠球菌在传播方式上存在差异。通过对爱尔兰临床来源菌株的分析，研究者们发现，poxtA基因在屎肠球菌中主要通过移动元件在多个ST型中传播。而poxtA阳性的粪肠球菌均属于同一个ST型——ST480，且等位基因差异小，表明了克隆传播的存在[31]。

4.2. poxtA相关的系统发育分析

研究者们通过结合大量NCBI数据库中的基因数据进行系统发育分析，发现从宠物中分离出的LREfs，能够在宠物、农场动物、人类和环境间形成混合进化簇，说明存在跨宿主传播的可能性[29]。而对更大范围菌株的分析，即对属于7个属的携带利奈唑胺耐药基因的菌株进行的系统发育分析，也验证了利奈唑胺耐药基因在生态系统中的流动。同一物种的菌株仍存在明显的系统发育距离和多克隆结构，表现为多样化的系统发育谱系，进一步证明了水平转移的发生和流行。当然，克隆传播也存在于特定的生态位中[32]。

4.3. 影响poxtA基因进化的因素

在不同地区间的克隆传播，或许与兽用抗生素的大量使用有关[15]。在一项对仔猪使用氟苯尼考并监测肠道微生物组的实验中，氟苯尼考被证实能够共选择多种抗菌素的耐药基因，包括poxtA。研究者们在仔猪氟苯尼考耐药的肠球菌(鸟肠球菌、屎肠球菌和粪肠球菌)分离株中，检测到了携带fexB和poxtA的质粒[33]。除兽用抗生素外，利奈唑胺也被报道能够影响poxtA阳性肠球菌的进化。在利奈唑胺暴露下，粪肠球菌所携带的poxtA基因可通过扩增来抵抗抗生素压力，且具有药物浓度依赖性。在利奈唑胺浓度达到32 mg/L时，除poxtA拷贝数增加外，粪肠球菌还会产生23S rRNA的突变来抵抗抗生素压力。但poxtA串联序列并不稳定，在抗生素压力消失时容易丢失[34]。

5. 结论与讨论

以屎肠球菌和粪肠球菌为代表的肠球菌，不仅是人类感染中的主要病原体，也是动物中的常见致病菌[29]。目前，在食用动物和养殖场环境中有大量MDR肠球菌的报道，且LRE检出率也正在逐步上升。可能是因为氯霉素、四环素及氟苯尼考等抗生素在农场中的广泛使用，不仅能够对兽用抗生素耐药的肠球菌产生选择作用，也能通过共选择对临床耐药性产生影响。已有多个报道称，动物来源的LRE可通过直接或间接途径，如食用农产品、职业暴露、动物粪便及污水对人类构成传播和感染风险[29] [35]。农民和农场环境之间以及养宠家庭和宠物之间的密切互动使得动物在耐药肠球菌的传播中起着重要作用。并且，食用动物的加工和消费以及农场堆肥和污水的处理等过程，均可能污染食物链，这增加了食物作为载体传播LRE的风险。有研究发现，在我国农场、食物和患者腹泻粪便标本中存在相同ST型的屎肠球菌和粪肠球菌，进一步证明了病原体依托食物链传播的可能性[3]。食用动物中抗菌素的使用与人类公共卫生相关耐药性之间的关系是一个复杂且有争议的话题。

poxtA基因在多种生态位中广泛存在。水平转移在驱动poxtA基因在人–动物–环境中的传播发挥至关重要的作用。在作为最后手段的抗生素的耐药性不断增加的情况下，需引起人们对公共卫生风险的担忧和重视，持续监测临床的耐药基因储存库和健康人群的肠道微生物组。

NOTES

^*通讯作者。