低氧诱导自噬促进T2DM大鼠骨折愈合

Hypoxia-Induced Autophagy Promotes Fracture Healing in Type 2 Diabetes Mellitus Rats

摘要: 目的：研究低氧状态下自噬对2型糖尿病(Diabetes mellitus type 2, T2DM)合并股骨骨折大鼠模型不同时间点的骨折愈合程度及低氧诱导因子-1α (HIF-1α)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、Runt-相关转录因子-2 (Runx2)、微管相关蛋白1A/1B-轻链3 (LC3II/I)表达情况。方法：大鼠随机分为高糖高脂饲养前(Control)组、高糖高脂饲养8周后(HFD)组及T2DM模型(T2DM)组，采用高糖髙脂饲料联合链脲佐菌素制备T2DM模型，在T2DM模型基础上制作股骨骨折模型。实验大鼠分为对照组(T2DM合并股骨骨折模型组，Model)及治疗组(氯化钴(CoCl₂)治疗的T2DM合并股骨骨折模型组，Treatment)，根据检测时间点每组继续分为造模后7 d、28 d、42 d的三个亚组。X线评估股骨愈合情况，WB检测HIF-1α、ALP、Runx2、LC3II/I表达。结果：T2DM合并股骨骨折模型随时间的增长，治疗组在第28 d相比于对照组已有较好的恢复，骨组织中ALP、Runx2表达增加，自噬蛋白LC3II/I的检测结果显示随时间增长自噬水平有所减弱。结论：低氧可以诱导自噬来促进T2DM大鼠骨折愈合。

Abstract: Objective: To investigate fracture healing and hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α), alkaline phosphatase (ALP), runt-related transcription factor 2 (Runx2), and microtubule associated protein-II/I (LC3II/I) expression at different time points in T2DM rats with femoral fracture under hypoxic conditions. Methods: The rats were randomly divided into high-sugar and high-fat pre-feeding groups, high-sugar and high-fat feeding groups after 8 weeks of feeding and a T2DM model group, T2DM was prepared with high-glucose and high-fat diet combined with streptavidin. Femoral fractures were modeled on the basis of T2DM. Experimental rats were divided into a control group (T2DM with femoral fracture model group, Model) and a treatment group (CoCl₂ treatment group, Treatment) and continued to be divided into three subgroups on days 7, 28, and 42 post-molecularization for each group at the time of measurement. Femoral healing was assessed by X-ray. HIF-1α, ALP, Runx2, and LC3II/I expression was measured by Western blotting. Result: In the T2DM combined femoral fracture model, as time progresses, the treatment group shows better recovery compared to the control group at day 28. The expression of ALP and Runx2 in bone tissue increases, and the detection results of autophagy protein LC3II/I indicate that autophagy levels weaken over time. Conclusion: Hypoxia can induce autophagy to promote fracture healing in T2DM rats.

1. 前言

发生骨折时，骨折端局部产生的低氧环境可以检测出低氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF)-1α [1]，有研究表明[2] HIF-1α不仅能够诱导断端的骨髓间充质干细胞发生迁移，并且能够抑制成骨细胞转换，在骨折愈合早期积累大量成骨细胞，帮助骨折处愈合[3]。自噬是体内一种复杂的调节方式，在低氧等应激环境时参与受损细胞器和线粒体的溶酶体降解。而对于发生骨折的糖尿病患者，体内的高糖环境会阻碍成骨细胞的活力和功能，影响骨折愈合进程，近来一些学者[4]认为，自噬是在高糖环境中维持成骨细胞活力和功能的重要机制。但目前关于低氧条件下机体是否通过自噬对高糖环境下骨折愈合进行调节的研究证据尚不明确，本研究通过对大鼠空腔糖耐量(IPGTT)及胰岛素敏感性指数(ISI)进行检测，建立糖尿病大鼠骨折模型，通过皮下注射氯化钴(CoCl₂)制造低氧环境，对比术后7 d、28 d及42 d对照组和治疗组低氧诱导因子(HIF-1α)表达情况及X线中骨折愈合的程度评价低氧对骨折愈合的影响，WB检测自噬标志物(ALP、Runx2、LC3II/Ⅰ)表达，对不同时间节点下两组T2DM大鼠骨折自噬水平进行检测，探讨高糖环境中自噬对骨折愈合的影响及机制，为临床上治疗合并2型糖尿病的骨折患者提供新的思路和方法。

2. 材料及方法

2.1. 伦理声明

本研究方案已取得商丘市第一人民医院伦理委员会批准，本实验严格遵守国际通行的动物福利及伦理准则，贯彻执行国家有关实验动物管理法律、法规和政策。伦理号202030301。

2.2. 实验试剂和仪器

Wistar雄性大鼠200 g左右，共60只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司；链脲佐菌素(源叶生物，18883-66-4)；CoCl₂ (SIGMA, MKCL2511)；氯化钴(CoCl₂) (美国Sigma公司)；大鼠胰岛素(INS)试剂盒(MM-0587R1，酶免)；Mouse Anti-GAPDH (HC301, TransGen Biotech, 1/2000)；HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (GB23301, Servicebio, 1/2000)；Rabbit Anti ALP (DF6225, Affinity, 1/500)；Rabbit Anti Runx2 (AF5186, Affinity, 1/1000)；Rabbit Anti LC3 (#12741, CST, 1/500)；HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) (GB23303, Servicebio, 1/2000)；血常规检测仪(KT-6610VET，锦瑞)；全自动酶标仪(WD-2102B，六一)。

2.3. T2DM大鼠模型的建立

大鼠适应性饲养7 d，适应性饲养结束前，检测大鼠空腹血糖(FPG)、空腹血清胰岛素(FINS)，计算胰岛素敏感性指数(ISI = 1/(FPG * FINS))和进行腹腔注射糖耐量试验(IPGTT)。空腹血糖 < 7.0 mmol/L者入选实验。适应性饲喂结束后，大鼠随机分为高糖高脂饲养前(Control)组、高糖高脂饲养8周后(HFD)组及T2DM模型(T2DM)组，HFD组采用高糖髙脂饲料连续饲养8周，期间自由饮水采食。高糖高脂饲料饲喂结束前，检测大鼠FPG、FINS，计算ISI，进行IPGTT实验。高糖高脂饲料饲喂结束后，在非空腹状态下，按照大鼠体重一次性腹腔注射30 mg/Kg 2%链脲佐菌素(STZ)，72 h内监测随机血糖，随机血糖值高于30 mmol/L者腹腔注射胰岛素1~2 U/Kg；血糖值过低(尤其出现精神萎靡症状)注射葡萄糖溶液。1周后检测FPG，空腹血糖 ≥ 7.0 mmol/L即为成功T2DM组模型。成功模型检测FINS，计算ISI，进行IPGTT实验。

2.4. 胰岛素敏感性指数(ISI)计算

高糖高脂饲养前(Model)组、高糖高脂饲养8周后(HFD)组及T2DM模型(T2DM)组构建后，分别采集大鼠空腹12 h后血清，检测空腹血糖(FPG)，ELISA检测血清胰岛素(FINS)含量，计算胰岛素敏感性指数(ISI = 1/(FPG * FINS))。

2.5. 空腔糖耐量(IPGTT)检测

高糖高脂饲养前(Control)组、高糖高脂饲养8周后(HFD)组及T2DM模型(T2DM)组构建后分别做空腹糖耐量检测，其中T2DM模型组给予高糖高脂饲养8周，非空腹下给予1次性腹腔注射30 mg/kg的2% STZ (链脲佐菌)，分别使大鼠空腹12 h后腹腔注射2 g/kg的葡萄糖，在注射后的0、15、30、60、90、120 min检测血糖[5]。

2.6. 动物分组

通过检测大鼠FPG、FINS，计算ISI及IPGTT，确定T2DM大鼠模型[6]。共14只实验室大鼠成模。成功成模的T2DM大鼠构建T2DM合并股骨骨折模型[7]，术前1周，所有的大鼠按照实验分组分笼，均饲养在同一环境下。手术时，所有的大鼠均采用乙醚吸入基础麻醉后，再用10%水合氯醛(150 mg/Kg)腹腔注射麻醉，麻醉生效后，将大鼠右侧卧位，充分显露左侧下肢，一次性备皮刀备皮后，以5%碘酊，75%酒精常规消毒左下肢，在外侧沿股骨表面，自左侧髋部至左膝部切开皮肤，钝性分离皮下筋膜、肌肉，用骨剥分离股骨表面软组织，充分显露股骨干，于股骨骨干中部用3.0线锯横行锯断股骨，造成股骨干横行骨折，然后使用1.0克氏针。行股骨骨折髓内固定，检查骨折端对位良好，无移位及成角后，3-0不可吸收缝线．逐层缝合伤口。术后3天内，所有动物局部注射青霉素注射液40万单位/只，预防感染。14只T2DM大鼠模型随机分为对照组(T2DM合并股骨骨折模型组，Model)及治疗组(氯化钴(CoCl₂)治疗的T2DM合并股骨骨折模型组，Treatment)，治疗组大鼠给予15 mg/kg的CoCl₂皮下注射处理，每天1次连续7 d。

2.7. X线检测

在术后第7 d、28 d、42 d分别做X线检测骨愈合情况，取术后不同时期股骨骨折的骨组织样本。根据Walker EC [8]骨痂体积的测算方法，测量骨痂体积百分比(percent bone volume)，进而评价骨折愈合质量。

2.8. 蛋白免疫印迹法(Western Blotting, WB)检测

使用WB检测法检测HIF-1α及自噬标志物ALP、Runx2、LC3II/Ⅰ表达。即取50 mg的骨组织样本于离心管内，加入1 mL的裂解液，研磨充分后离心取上清，取上清液。加入缓冲溶液，煮沸5 min。用BCA蛋质定量试剂盒检测细胞上清中蛋白质浓度，绘制标准曲线。制作SDS-PAGE胶，上样，开始跑胶，电泳60 V压缩蛋白，80 V分离蛋白，当条带跑至胶板一半的时候配置1 × 转膜液，并预冷。根据预计条带的位置裁剪好PVDF膜(约1~2 cm)，甲醇激活15 s。切好大小合适含有内参或目的条带的胶，放好“三明治”(海绵–滤纸–胶–膜–滤纸–海绵)，用1 × 转膜液将“三明治”浸没，用300 mA恒流转膜。用1 × TBST配置3%的脱脂牛奶封闭液，封闭1 h。将PVDF膜孵育一抗过夜。洗膜，用1 × TBST浸泡10 min后弃掉，重复3次。将PVDF膜孵育二抗2 h。洗膜，用1 × TBST浸泡10 min后弃掉，重复3次。用发光液浸湿PVDF膜后放置于超高灵敏度化学发光成像系统样品放置区运行程序显影成像。

2.9. 统计分析

应用SPSS 20.0软件进行统计分析。所有实验重复3次，定量结果采用均数 ± 标准差($\overline{x}\pm s$ )表示。显著性分析采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。

3. 实验结果

3.1. 高脂饲养及T2DM对胰岛素敏感性的影响

在高脂饲养前(Control)、高脂饲养后(HFD)及构建T2DM模型后检测空腹胰岛素含量，计算胰岛素敏感性指数(ISI = 1/FPG * FINS)，T2DM组的ISI明显降低(见表1)。

T2DM组的ISI明显降低(见表1)，与Control、HFD相比均有显著性(P < 0.05) (见图1)。

Table 1. Insulin sensitivity

表1. 胰岛素敏感性

组别	数量(n)	FPG (mmol/L)	FINS (mU/L)	ISI
Control	18	5.19944 ± 0.50814	2.2631 ± 0.53696	0.0857 ± 0.01836
HFD	17	6.0059 ± 0.33066	3.6819 ± 3.11324	0.0608 ± 0.02432
T2DM	14	9.8429 ± 0.88380	1.9895 ± 1.57675	0.0380 ± 0.01647

Figure 1. Insulin sensitivity index

图1. 胰岛素敏感指数

3.2. 高脂饲养及T2DM空腹糖耐量(IGPTT)检测

在高脂饲养前(Control)、高脂饲养后(HFD)及构建T2DM模型后分别做空腔糖耐量检测。T2DM模型构建后耐糖能力减弱，0、15、30、60、90、120 min与Control、HFD组均有显著差异(P < 0.05)，见图2。

Figure 2. Glucose tolerance test

图2. 糖耐量检测

3.3. CoCl₂治疗对骨愈合的影响

A. 术后正位X线片，显示对照组大鼠术后7 d股骨干骨折X线表现；B. 术后正位X线片，显示对照组大鼠术后28 d股骨干骨折X线表现；C. 术后正位X线片，显示对照组大鼠术后42 d股骨干骨折X线表现。

D. 术后正位X线片，显示治疗组大鼠术后7 d股骨干骨折X线表现；E. 术后正位X线片，显示治疗组大鼠术后28 d股骨干骨折X线表现；F. 术后正位X线片，显示治疗组大鼠术42 d股骨干骨折X线表现。

Figure 3. X-ray examination

图3. X线检查

术后7 d，X线检查显示治疗组有少量骨痂，对照组未发现(见图3)，差异具有统计学差异(P < 0.05)；术后28 d对照组和治疗组X线测量的骨痂体积均较7 d时增加，且差异有统计学差异(P < 0.05)，同时，在骨折的28 d对照组存在骨缺损，术后28 d治疗组的骨痂体积比对照组骨痂体积大，此差异具有统计学差异(P < 0.05)；42 d时，对照组和治疗组在X线片上测量的骨痂体积均较28 d有所增长，且差异均具有统计学差异(P < 0.05)，同时，术后42 d时，治疗组较对照组骨痂体积更大，此差异具有统计学差异(P < 0.05) (见图4)。

Figure 4. Percentage of callus volume

图4. 骨痂体积百分比

3.4. 两组骨痂组织中HIF-1α表达水平检测

Figure 5. The expression level of HIF-1α

图5. HIF-1α表达水平

在第7 d及28 d时检测治疗组HIF-1α蛋白表达水平较对照组组显著增加(P < 0.05)，在42 d时两组差异不明显(P > 0.05) (见图5)。

3.5. CoCl₂治疗对ALP、Runx2、LC3Ⅱ/Ⅰ表达影响

Figure 6. Detect the expression levels of ALP, Runx2, and LC3II/Ⅰ by Western Blot (WB)

图6. WB检测ALP、Runx2、LC3II/Ⅰ的表达情况

通过蛋白免疫印迹法检测不同时间点骨样本中ALP、Runx2、LC3II/Ⅰ的表达。随时间增长ALP、Runx2蛋白的表达均为上升趋势，且在治疗组中表达高于对照组，差异具有显著性(P < 0.05)。自噬蛋白LC3II/Ⅰ的检测结果显示随时间增长自噬水平有所减弱，在治疗组中表达低于对照组，差异具有显著性(P < 0.05) (见图6)。

4. 讨论

本实验中通过对大鼠空腔糖耐量(IPGTT)及胰岛素敏感性指数(ISI)进行检测，筛选出符合条件的T2DM大鼠模型，将建立的糖尿病大鼠骨折模型随机分为对照组及治疗组。通过对治疗组皮下注射CoCl₂模拟低氧环境，检测出低氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF)-1α过表达。已有研究发现过表达的HIF-1α在促进骨折愈合中占据重要地位[9]，但具体机制仍然不明确。有可能的机制是[10] HIF-1α通过上调成骨细胞因子Runx2和调节microRNAs的表达，促进VEGF的表达从而促进骨痂中血管的生长，同时通过成骨–血管生成偶联，对成骨细胞、破骨细胞等骨系细胞进行直接调控，从而达到促进骨折愈合的作用。本研究发现CoCl₂治疗组大鼠HIF-1α的表达较对照组明显增加，联系术后7 d、28 d及42 d治疗组X线检查骨折愈合的程度相比于对照组也有较好的恢复，且结果具有统计学意义，再次证明了低氧环境可以促进骨折的愈合。

此前我们的研究[11] [12]已经证明了自噬与骨折愈合的相关性，在骨折等严重创伤时会引起局部和系统性的免疫反应，如IL-6、IL-8/IL-10以及HMGBl等都显著增加。并且一定程度的自噬可以促进大鼠的骨折愈合。另外，低氧环境可以诱导自噬已在多种领域得到证实[13] [14]，我们猜想自噬在低氧促进愈合的机制中发挥作用。因此本研究中，我们留意了检测骨折后不同时期自噬相关蛋白(ALP、Runx2、LC3II/Ⅰ)表达水平。观察到7 d时治疗组大鼠的骨折处ALP、Runx2水平较对照组升高，X线见骨折处骨痂明显形成，在28 d，治疗组骨折端已有较好的恢复，骨折线已基本连续，并且检测到治疗组的自噬标志物同样地高于对照组，这证明自噬水平在一定范围内的增强可促进糖尿病大鼠骨折愈合。42 d时，我们观察到LC3II/Ⅰ有所下降，推测骨折愈合、炎症因子等因素基本达到平衡，低氧引起自噬的显著性降低。Zhang P等人[15]通过抑制TGF-β1信号增强自噬水平观察到糖尿病大鼠骨缺损的愈合增快。这也与我们观察到自噬帮助糖尿病大鼠骨折愈合的现象相一致。

综上证实低氧可以增加自噬水平促进骨折愈合，但是本研究中尚不够深入，具体的机制尚待下一步探究。

5. 结论

在本研究中，我们发现低氧环境可以通过自噬一定程度上促进大鼠骨折的愈合程度，并且可以促进合并有2型糖尿病大鼠的骨折愈合程度，这为以后治疗合并2型糖尿病的骨折患者提供了新的治疗思路。但本研究仍不够深入，需要我们进一步完善。

NOTES

^*通讯作者。