1. 引言
真菌性角膜炎(FK)是一种难治性角膜感染，发病率约占感染性角膜炎的40%，且在发展中国家的发病率高于发达国家[1]。在亚洲和非洲等人口密集的地区，FK的发病率呈上升趋势。镰刀菌和曲霉菌是主要病原体[2]。与其他感染性角膜炎相比，由于缺乏有效的治疗药物和方法，真菌性角膜炎的预后较差，致盲率较高。临床上使用的抗真菌药物主要有多烯类、唑类和棘白菌素类，这些药物对角膜毒性大、渗透性差、治疗效果不理想[3]。因此，开发一种有效的抗真菌药物非常重要。
金诺芬是一种金基化合物，其被开发用于治疗类风湿性关节炎已有三十多年的历史，但随着越来越多的新型抗风湿药物的出现，其临床应用有所减少，但由于金诺芬在多种疾病模型中显示出治疗潜力，对它的研究仍在继续[4]。近年来，已有研究发现金诺芬对炎症通路和巯基氧化还原酶具有双重抑制作用，这使其成为癌症和微生物感染治疗的新候选药物。虽然金诺芬抗炎活性的确切机制尚未建立，但它对外周炎症通路的一系列影响已得到充分证实[5] [6]，已有报道显示金诺芬调节脂多糖(LPS)刺激的单核细胞和巨噬细胞分泌白细胞介素8 (IL-8)和白细胞介素6 (IL-6) [7]，Kim等人证实金诺芬调节细胞内信号传导途径，包括激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，抑制B细胞的核因子κ-轻链–增强子(NF-κB)的表达，抑制促炎细胞因子的表达[8]-[10]。
基于现有的研究成果，我们推测金诺芬可能是一种治疗FK的潜在药物。在我们的研究中，我们探究了金诺芬对角膜上皮细胞的毒性作用。然后，我们在体外测试了金诺芬对炎症的调节作用。我们的研究结果确定了金诺芬在烟曲霉中的抗炎相关机制，为角膜烟曲霉的治疗提供了一种新的选择。
2. 材料和方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 实验对象
健康的8周龄C57BL/6雌鼠购于山东济南朋悦有限公司，按照美国眼科和视觉研究协会(ARVO)标准进行处理。RAW264.7细胞购自中国科学院上海分院，HCEC由中国广东省广州市中山眼科中心眼表实验室提供，在37℃和5% CO2下在含有10%胎牛血清(Gibco)、0.075%生长因子(Gibco)、0.075%胰岛素(Solarbio，中国北京)、1%青霉素G (Gibco)和硫酸链霉素(Solarbio)的DMEM中培养。
2.1.2. 实验菌株
本次实验中所使用的烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus, AF)菌种来自于中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京)。将烟曲霉菌菌株置于含有沙氏培养液的锥形瓶中培养，并在37℃和120 r/min条件下孵育4~7天，收获菌丝并磨碎，加入磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，随后用75%乙醇灭活(4℃, 48 h)，加入DMEM培养基稀释使其浓度为1 × 1011 CFU/mL。
2.1.3. 主要实验试剂
将1 mg的金诺芬(MCE公司，美国)溶于1 mL的二甲基亚砜(DMSO)中，以1 mg/mL的储备液冻存于−20℃，后续用DMEM培养液将其稀释至所需浓度，使稀释后的DMSO体积分数为0.00458。Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒由碧云天提供；RNA exproreagent由艾科瑞生物公司提供；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒由Biolegend公司提供。
2.2. 实验方法
2.2.1. CCK-8实验
HCECs接种于96孔板中，并生长1至2天至80%密度，然后将Hcec与不同浓度的金诺芬(1、2、4、8、16、32、64 µg/mL)或DMSO (0.5%)混合孵育24小时，然后向每个孔中加入10 μL CCK-8 (Solarbio, Beijing, China)并孵育2小时。使用酶标仪读取450 nm处的吸光度。
2.2.2. 活死细胞染色实验
为了评估金诺芬对Hcecs细胞的毒性作用，将Hces细胞置于12孔板中培养，直到细胞密度达到约80%。加入烟曲霉菌孢子(1 × 105/mL)培养2小时，然后用不同浓度的金诺芬和DMSO培养。共同培养8h后，用Calcein AM和碘化丙啶(PI)的混合物在黑暗中对细胞样本染色30分钟，PBS洗涤三次。使用荧光显微镜(徕卡，200×)拍摄染色细胞。
2.2.3. 细胞刺激
Hcec细胞接种于12孔板，孵育至细胞密度约80%~90%后换液。将细胞分为Ｎ组、DMSO组、金诺芬组、AF组，AF + DMSO组及AF + 金诺芬组，加菌处理组每孔加入60 μL灭活烟曲霉菌丝，金诺芬处理组每组加入终浓度为4 µg/mL的溶液，8 h后收集细胞样本用于细胞RT-PCR实验(每组6孔)；24 h后收集细胞上清液，离心后取上清液用于细胞ELISA检测(每组8孔)。
2.2.4. 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测炎症因子
12孔板Hcec细胞用PBS洗涤3次后，每孔加入500 μL RNAexproreagent裂解液裂解，用200 μL无菌黄枪头充分研磨并收集细胞至EP管中，提取总RNA，使用HiScriptⅢRTSuperMix (南京诺唯赞公司)进行qRT-PCR反转录获得cDNA。最后，使用qRT-PCR仪进行扩增反应。引物序列见表1。
Table 1. Sequences of RT-qPCR primers
表1. RT-qPCR引物序列
Gene |
Primer Sequence (5'-3') |
Gen Bank |
β-actin (mouse) |
F: GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC R: GACTCATCGTACTCCTGCTTGC |
NM_007393.5 |
IL-1β (mouse) |
F: CGCAGCAGCACATCAACAAGAGC R: TGTCCTCATCCTGGAAGGTCCACG |
NM_008361.4 |
TNF-α (mouse) |
F: ACCCTCACACTCAGATCATCTT R: GGTTGTCTTTGAGATCCATGC |
NM_013693.3 |
CCL2 (mouse) |
F: CAGCAGGTGTCCCAAAGAAG R: ATTTGGTTCCGATCCAGGTT |
NM_011333.3 |
IL-6 (mouse) |
F: CACMGTCCGGAGAGGAGAC R: CAGAATTGCCATTGCACAAC |
NM_031168.1 |
2.2.5. 相关蛋白表达检测
应用ELISA试剂盒检测Hcec细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6以及CCL-2的蛋白表达，根据试剂盒说明书方法进行实验。使用酶标仪检测450 nm及570 nm波长处吸光度。
2.3. 统计学方法
使用SPSS26.0、GraphPadPrism9.0软件进行统计学处理。对于CCK-8、实时荧光定量PCR和ELISA数据，使用非配对双尾t检验确定统计学差异性，所有实验至少重复3次，用
± SEM表示，当P < 0.05时，认为数值具有统计学意义。
3. 结果
3.1. 金诺芬对Hcec细胞毒性的影响
为确定金诺芬的安全浓度，分别将不同浓度的金诺芬作用于Hcecs。CCK-8结果(图1(A))显示，当金诺芬浓度 ≤ 1 µg/mL时，HCECs的细胞活力不受影响，采用活死细胞染色实验进一步评估金诺芬对Hcec细胞的毒性作用，其中活细胞被染成绿色，死细胞被染成红色。结果如图1(B)所示，随着金诺芬浓度的增加，视野中绿色细胞的数量随之增加，而红色细胞的数量减少，1 µg/mL以上浓度的金诺芬溶液处理组Hcec细胞的存活率低于其他各组，差异有统计学意义(P < 0.05)。1 µg/mL浓度的金诺芬处理组的细胞存活率与正常对照组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。后续实验选择1 µg/mL作为研究浓度。
3.2. 各组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6以及CCL-2 mRNA表达水平比较
为了进一步探讨金诺芬在FK中的抗炎作用，我们进行了实时荧光定量PCR，结果如表2所示，AF和AF + DMSO组HCECs中，TNF-α、IL-1β、IL-6和CCL-2的表达均显著高于对照组(P < 0.05)。金诺芬处理组上述炎症因子水平显著低于AF + DMSO处理组。
Figure 1. Toxic effects of Auranofin on Hcecs cells
图1. 金诺芬对Hcecs细胞的毒性作用
Table 2. Comparison of the mRNA expression levels of TNF-α、IL-1β、IL-6 and CCL-2 (n = 4,
)
表2. 各组细胞TNF-α、IL-1β、IL-6以及CCL-2mRNA表达水平比较(n = 4,
)
组别 |
组别 |
TNF-α |
IL-1β |
IL-6 |
CCL-2 |
A组 |
N组 |
1.17 ± 0.25 |
2.21 ± 2.46 |
0.75 ± 0.62 |
1.03 ± 0.24 |
B组 |
AF组 |
40.6 ± 3.26 |
156.14 ± 10.64 |
96.75 ± 7.86 |
74.23 ± 5.72 |
C组 |
AF + DMSO组 |
38.3 ± 3.01 |
153.87 ± 10.24 |
94.29 ± 7.36 |
73.86 ± 5.53 |
D组 |
AF + 金诺芬组 |
17.2 ± 1.86 |
72.63 ± 5.12 |
45.72 ± 3.92 |
39.52 ± 2.98 |
(A组与B组相比差异具有统计学意义，P < 0.05；B组与C组间没有显著差异，P > 0.05，D组明显低于B组，P < 0.05)。
3.3. 各组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和CCL-2蛋白表达水平比较
金诺芬可显著降低HCECs中TNF-α、IL-1β、IL-6和CCL-2的蛋白水平，ELISA结果如图2显示，与Ｎ组相比，AF和AF + DMSO组中炎症递质TNF-α、IL-1β、IL-6和CCL-2的蛋白表达水平明显上调；金诺芬组与AF + DMSO组相比，炎症递质TNF-α、IL-1β、IL-6和CCL-2的蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(P < 0.01)。
3.4. Nrf2/HO-1信号通路参与金诺芬对烟曲霉角膜炎的抗炎作用
我们的结果(图3)表明，真菌刺激增加了HCECs中Nrf2和HO-1的表达，并且金诺芬处理增加了由烟曲霉诱导的HCECs中Nrf2和HO-1的mRNA水平，为了进一步确定金诺芬的抗炎作用是否与Nrf 2/HO-1轴有关，我们用BT (Nrf 2抑制剂)预处理HCECs，结果表明，BT预处理部分逆转了TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。当用ZnPP (HO-1抑制剂)预处理正常HCEC时，也可显著减弱金诺芬对RAW264.7细胞中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达的抑制作用。
Figure 2. Auranofin reduces the production of inflammatory mediators in Aspergillus fumigatus-induced HCECs
图2. 金诺芬减少烟曲霉诱导的HCECs中炎症介质的产生
Figure 3. Auranofin attenuates the inflammatory response by activating the Nrf2/HO-1 pathway
图3. 金诺芬通过激活Nrf2/HO-1通路减轻炎症反应
4. 讨论
真菌性角膜炎是致盲的重要原因之一[11]。真菌释放出来的大量有毒物质、酶和其他化学物质黏附在角膜上，刺激角膜产生一些趋化因子和细胞因子，引起炎症反应，严重的炎症反应会伤害角膜组织并损害视力[3]。目前，临床上治疗真菌性角膜炎的常用药物通常具有毒性高、渗透性低等缺点。因此，寻找新的有效治疗真菌性角膜炎的药物至关重要。
金诺芬是一种金基化合物，具有很强的抗真菌及抗炎能力[12]。然而，目前还没有实验验证金诺芬是否能应用于真菌性角膜炎的治疗。为了确定金诺芬的体外安全性，本文进行了CCK-8和活死细胞染色实验，结果显示，金诺芬浓度低于1 µg/mL时，体外培养的Hcecs活性不受金诺芬的影响。
本研究结果显示，金诺芬抑制由烟曲霉诱导的Hcecs中TNF-α、IL-1β、IL-6和CCL-2表达。过度的炎症反应可加重FK中的角膜损伤，不利于角膜修复[13]。先前的研究表明，在复发缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中，金诺芬的治疗减少了中枢神经系统和外周免疫细胞中多种炎症介质如IL-6、IL-17A、iNOS等的生成[14]。然而，金诺芬调节炎症介质表达的机制仍不清楚。
Nrf2是氧化反应的关键调节因子，调节数百个基因的表达，不仅包括编码抗氧化酶的基因，还包括参与包括炎症反应，癌症发生和转移，以及组织重塑和纤维化[15]等多种过程的一系列基因。由于其抗氧化能力，Nrf2在机制上参与各种全身性疾病，包括呼吸系统疾病[16]、心血管和脑血管疾病[17]、退行性疾病、肿瘤[18]，以及多种眼部疾病如干眼症、白内障、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性等。Nrf2与其调节分子和相互作用蛋白一起，在细胞中执行关键的抗氧化和抗炎功能。通过Nrf2调节的基因之一是血红素加氧酶-1 (HO-1)。在肺上皮细胞中，金诺芬可以直接抑制硫氧还蛋白还原酶(Txnrd) 1的活性，导致细胞ROS浓度增加并激活Nrf2依赖性反应，其也可以促进Nrf2从细胞质向细胞核的转移，进而增强Nrf2在抗氧化反应中的作用[19]。Ryuhei Hayashi已经证明，Nrf2信号传导在整个角膜上皮伤口愈合过程中被激活，并且其激活在角膜伤口愈合中起保护作用[20]。已经证实，HO-1诱导减弱了角膜上皮损伤所危及的炎症，如角膜炎，并加速伤口愈合。Nrf2/HO-1可能在真菌性角膜炎中发挥抗炎作用[21]。此外，已证明金诺芬可以激活Nrf2/HO-1信号通路减弱巨噬细胞中的炎症反应[19]。为了确定Nrf2/HO-1通路的作用，我们首先检测了感染后Hcecs细胞中Nrf2和HO-1的表达。在用烟曲霉刺激后，Nrf2和HO-1的表达增加，这表明Nrf2/HO-1信号通路可能参与FK中的免疫应答。然后，我们在金诺芬处理前给予Nrf2和HO-1的抑制剂预处理，发现细胞中炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平升高，提示当角膜受到烟曲霉菌感染时，金诺芬可通过激活Nrf2/HO-1信号通路表达并抑制介导的下游炎症反应来抑制过度炎症反应的发生。目前尚未有明确证据表明金诺芬可以通过直接与Nrf2结合从而发挥作用，我们将继续探索金诺芬发挥作用的分子机制。
综上所述，本研究结果显示，金诺芬在烟曲霉菌性角膜炎中具有抑制炎症的作用，其作用机制为激活Nrf2/HO-1信号通路从而抑制其介导的下游炎症级联反应。本研究结果为进一步探索金诺芬针对FK的临床试验提供了理论依据和实验数据。
致 谢
感谢刘星、段慧瑾、高成磊在本文学术及实验技术方面的指导与支持。
基金项目
山东省自然科学基金(编号ZR2023MH068)。
注 释
课题资助单位：山东省自然科学基金ZR2023MH068，未在学术会议上宣读或交流过、未以其他文种发表过。
NOTES
*通讯作者。