1. 引言
自噬是一种主要的降解机制，其中细胞质蛋白质和细胞器被分离成自噬体并被溶酶体降解。自噬不仅对细胞应激和病原体清除很重要，而且参与生物体的生长、发育和衰老。研究表明，自噬可导致多种人类疾病，如癌症[1]-[3]。
自噬在肿瘤生物学中起着双重作用[4] [5]。目前已证实，自噬基因BECN1在子宫颈癌症、癌症、卵巢癌过程中表达水平降低。尽管BECN1-knokout小鼠可以存活，但淋巴瘤、癌症或癌症的发病率显著增加，自噬活性明显减弱[1]。然而，BECN1在癌症和其他肿瘤中高度表达[4]。
肝细胞癌是原发性肝癌最常见的病理类型，占75%~85%，其发病率和病死率在肿瘤中分别位居第六位和第三位[6]。肝细胞癌起病隐匿，患者就诊时多处于中晚期。迄今为止，肝细胞癌的诊断和疗效评估主要依赖于影像学和AFP、异常凝血酶原(PIVKA II)及HSP90α等血清学标志物的检测，但其灵敏度和特异性尚不能满足临床早期诊断和治疗的需求[7] [8]。因此，亟需发现新的基因或蛋白为肝细胞癌的早期诊断、预后评估及治疗提供有效标志物或靶标。
自噬与肝细胞癌的发生、预后和治疗相关[9]-[14]。有文献报道Hif-1α诱导m6A阅读蛋白YTHDF1的表达，通过促进ATG2A和ATG14的转录，驱动缺氧诱导的肝细胞自噬和肝癌的恶性化[9]。CDK9抑制可通过调节SIRT1-FOXO3-BNIP3轴，阻断pink1-prkn3介导的线粒体自噬的启动，增强肝细胞癌线粒体功能障碍的治疗效果[10]。STOML2通过促进pink1介导的线粒体自噬和调节对乐伐替尼的敏感性来增强肝细胞癌的转移[11]。PNO1通过MAPK信号通路调控肝癌细胞自噬和凋亡[12]。Desideri E课题组研究表明通过伴侣介导的自噬破坏YAP1和IL6ST的降解，可促进正常细胞和肝癌细胞的增殖和迁移[13]。在肝细胞癌中，淫羊藿苷增强线粒体自噬并与阿霉素协同诱导免疫原性细胞死亡[14]。
细胞自噬为肝细胞癌的治疗提供了一种新思路。通过抑制具有细胞保护效应的自噬反应或促进可诱导凋亡的细胞自噬有可能成为肝细胞癌生物治疗中的重要靶点。
MARCH2是我们在10,000多的质粒库中通过生物信息学分析，找到同时具有LC3作用膜序和Ub结合膜序的208个基因，再经SQSTM1-Luc筛选平台筛选出的自噬相关基因[15]。
MARCH2基因是Bartee课题组在2004年发现，定位于19p13.2，基因全长25,746 bp，其开放读码框编码246个氨基酸，相对分子量27 kDa。MARCH2是定位于内质网、溶酶体和内体的二次跨膜蛋白，能降解细胞表面转铁蛋白受体和共刺激分子B7.2。MARCH2与STX6结合，参与高尔基体和内体之间运输。MARCH2与DLG1相互作用促进DLG1泛素化，减弱DLG1在细胞连接点的表达，影响细胞的极性。MARCH2与β2AR相互作用，促进β2AR的泛素化，调节细胞表面的β2AR水平。MARCH2通过与CAL和STX6结合泛素化并降解CFTR。
目前对MARCH2的研究主要是囊泡运输方面，而对MARCH2与自噬的相关性研究罕有报道。因此，我们的目的就是要研究MARCH2在肝细胞癌HUH7细胞自噬过程中的功能以及分子机制。由于在肝细胞癌发病机制中自噬有关键作用，增加对肝细胞癌中自噬的了解有助于发现治疗的靶点，降低疾病的发生率，改善生存。
2. 材料和方法
2.1. 抗体和试剂
p62/SQSTM1抗体购自香港MBL公司；LC3B抗体购自Sigma Aldrich公司；cleaved-PARP抗体购自美国CST公司；cleaved-caspase 3抗体购自美国Abcam公司；二抗购自美国Rockland公司；bafilomycin A1 (BafA1)、Rapamycin购自美国Sigma Aldrich公司。
2.2. 质粒构建
使用上游引物(5′-CGGAATTCATGCTGGAAGCCATGGCGGAGC-3′)和下游引物(5′-CCCAAGCTTTCAGGGCTCTCCAGATTTGGG-3′)通过PCR从HeLa细胞中扩增MARCH2 cDNA。然后通过EcoRI和HindIII消化将插入物从质粒中释放出来，亚克隆到pcDNA.3.1/myc His(-)B(Life Technologies, V85520)的EcoRI位点，构建pcDB-MACH2质粒，在本研究中缩写为MARCH2。GFP-LC3B质粒由美国西奈山医学院岳振宇教授惠赠。
2.3. 细胞培养及转染
HUH7细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，常规传代。使用MegaTran 1.0进行pcDB-MACH2或空载体质粒转染，并用G418筛选，以建立MARCH2过表达的肝细胞癌HUH7细胞系，空载体转染作为对照。
2.4. Western Blotting法
HUH7细胞总蛋白的提取，蛋白定量，10%牛奶(TBST液配制)室温封闭1 h；加入相应的一抗，４℃过夜；然后加入相应的DyLight 680/800标记的二抗(1:10,000)，室温避光反应1 h；用Odyssey Infrared Imager检测荧光信号分析灰度值。
2.5. 细胞活力检测
使用MTS试剂盒检测细胞活力，取出MTS试剂于室温下静置90 min或37℃水浴10 min溶解。于培养有100 μl细胞(5000~10,000个)/孔的96孔培养板中加入20 μl MTS试剂，复孔3~5组，并设置对照组。将96孔培养板放回培养箱，37℃、5% CO2的环境下孵育1~4小时；若立刻检测可直接进行下一步，若之后检测，可在每孔加入25 μl 10% SDS终止反应，室温下避光保存于湿盒中，在18 h之内检测。用酶标仪于490 nm处测定OD值。结果分析：将各测试孔的OD值减去对照孔或调零孔OD值。各平行孔的OD值取平均数。细胞活力% = 实验组OD/对照组OD × 100%。
2.6. EdU掺入检测
使用EdU检测试剂盒检测细胞增殖，细胞在普通培养基中培养，并铺在盖玻片上。将EdU溶解在0.9%无菌NaCl中，在0.22 μm下过滤，在收获细胞前4小时加入培养基中。然后立即将细胞固定在4%多聚甲醛中，并按照说明进行。细胞核用Hoechst 33342复染。
2.7. 细胞周期检测
将细胞一式三份铺在六孔板上，并在37℃下孵育不同时间。然后收集细胞，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4; pH 7.4; Solarbio, P1010)洗涤三次，用70%冰冷的乙醇固定过夜。在测试前，加入RNase (100 μg/ml)，再用碘化丙啶(PI, 50 μg/ml)对细胞进行染色。于30分钟内收集细胞并用FACSCalibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson)进行分析。
2.8. 细胞凋亡检测
细胞凋亡水平通过FITC-Annexin V染色检测试剂盒和流式细胞术检测。将一式三份的六孔板中的细胞用胰蛋白酶消化并重新悬浮在含有5 ul FITC偶联的膜联蛋白V的100 ul缓冲液(10 mM HEPES, pH 7.4, 140 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5 mM KCl, 2.5 mM CaCl2)中，在室温下在黑暗中孵育30分钟。然后，收获细胞并用FACSCalibur流式细胞仪进行分析。
2.9. 激光共聚焦显微镜观察
将细胞铺入共聚焦小皿中大约长至60%~80%密度，使用Megatran1.0转染带荧光蛋白标签或不带标签的相应蛋白表达质粒，转染24小时后，细胞用4%多聚甲醛固定或进一步进行免疫荧光染色，Hoechst33342染核，PBS冲洗三次，置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。在50个细胞中评估每个细胞的GFP-LC3B数量，并从三次独立的实验中获得统计数据。
2.10. 流式细胞术
将处理过的细胞用胰蛋白酶化并重新悬浮在100 μL缓冲液(10 mM HEPES, pH 7.4, 140 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5 mM KCl, 2.5 mM CaCl2)中，然后用Annexin V-FITC (Solarbio, CA1020-20)避光染色30分钟，加入碘化丙啶(PI, Solarbio)染色5分钟，用FACSCalibur流式细胞仪进行分析。
2.11. 统计分析
数据以平均值 ± 标准差表示。使用Student t检验对连续变量进行组间差异分析。本研究中的统计学意义设定为p < 0.05。所有报告的p值都是双侧的。所有分析均使用GraphPad Prism 5进行。
3. 结果
3.1. MARCH2的过表达促进肝细胞癌HUH7细胞增殖
为了研究MARCH2对肝细胞癌HUH7细胞增殖的影响，我们首先建立了能够稳定过表达MARCH2的肝细胞癌HUH7细胞系。如图1(A)所示，MARCH2在肝细胞癌HUH7细胞系中高度表达。接下来，我们进行了MTS检测，以评估MARCH2过表达细胞系的细胞存活率。生长曲线显示，与对照组相比，MARCH2过表达细胞系(HUH7)的细胞存活率显著提高(图1(B))。
我们还测量了肝细胞癌HUH7细胞系中5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)掺入的水平(即，一种替代[3H]胸苷摄取的非放射性测定方法，用于测量体外细胞增殖)。我们观察到，在MARCH2过表达的肝细胞癌HUH7细胞(从~37%到58%)中，EdU阳性细胞(即增殖细胞)的百分比显著增加(图1(C)和图1(D))。
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Figure 1. Overexpression of MARCH2 promotes hepatocellular carcinoma HUH7 cells growth. (A) Expression of MARCH2 in hepatocellular carcinoma HUH7 cells was analyzed by Western blot. ACTB was detected as the protein loading control. (B) Cells growth of hepatocellular carcinoma HUH7 cells with or without of MARCH2-overexpression was detected by MTS assay. Data were mean ± SD from three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01. (C) Cells were plated in glass slides and incorporated with EdU. 4 h later, the indicated cells were performed by immunofluorescence assay Nuclei were stained with Hoechst 33342. Representative confocal microscopy images were shown. (D) Quantification of the percentage of EdU positive cells in 200 cells were shown from five randomly selected areas from each slide. Each bar represents the mean ± SD from three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01
图1. MARCH2过表达促进肝细胞癌HUH7细胞的生长。(A) 通过Western blot分析MARCH2在肝细胞癌HUH7细胞中的表达。(B) MTS法检测MARCH2过表达的肝细胞癌HUH7细胞的生长情况。数据为三个独立实验的平均值 ± 标准差，*p < 0.05，**p < 0.01。(C) 将细胞置于载玻片上，并掺入EdU。4小时后，通过免疫荧光法对指示的细胞进行检测。用Hoechst 33342对细胞核进行染色。显示了代表性的共聚焦显微镜图像。(D) 从每张载玻片中随机选择的五个区域显示了200个细胞中EdU阳性细胞百分比的定量。每条线代表三个独立实验的平均值 ± 标准差，*p < 0.05，**p < 0.01
由于凋亡是影响细胞存活率的一个因素，我们检测到磷脂酰丝氨酸(PS)的暴露，这是细胞凋亡的关键生化标志。使用FITC标记的膜联蛋白V (其特异性结合PS)通过流式细胞术可以很容易地识别凋亡细胞表面PS的暴露。使用该检测方法，我们检测了MARCH2过表达的肝细胞癌HUH7细胞凋亡的百分比。通过PI染色评估质膜完整性。流式细胞术分析的数据显示，MARCH2过表达和对照细胞之间的细胞凋亡没有显著差异(图2(A)和图2(B))。此外，对凋亡相关蛋白caspase-3和PARP进行了测试，切割的caspase-3/PARP水平在MARCH2过表达和对照细胞之间没有明显变化，这意味着MARCH2过表达未能影响细胞凋亡(图2(C))。
同时，用流式细胞术进行细胞周期分析，结果显示，MARCH2过表达的肝细胞癌HUH7细胞中S期细胞群增多，与MARCH2过表达的肝细胞癌HUH7细胞中G0/G1期细胞群减少有关，肝细胞癌HUH7细胞中G2/M期没有变化(图3(A)~(D))，表明MARCH2过表达导致肝细胞癌HUH7细胞的生长加速。
总之，这些数据表明，MARCH2的过表达促进了肝细胞癌HUH7细胞的生长，但未能诱导细胞凋亡。
3.2. MARCH2抑制肝细胞癌HUH7细胞的自噬
在发现MARCH2促进肝细胞癌HUH7细胞增殖后，我们研究了其可能的机制。由于肝细胞癌确实
Figure 2. Overexpression of MARCH2 fails to affect hepatocellular carcinoma HUH7 cells apoptosis. (A) Representative apoptosis profiles of hepatocellular carcinoma HUH7 cells with or without of MARCH2-overexpression from flow cytometry with PI/Annexin-V double staining. (B) The percentage of apoptotic cells [Annexin]-[V Positive (%) + PI Positive (%)] was calculated. The data represent the means ± SEM of at least three independent experiments. (C) The level of cleaved-caspase 3 and cleaved-PARP in hepatocellular carcinoma HUH7 cells with or without of MARCH2-overexpression were tested by western blotting
图2. MARCH2的过表达不影响肝细胞癌HUH7细胞的凋亡。(A) 通过PI/Annexin-V双染色流式细胞术检测MARCH2过表达的肝细胞癌HUH7细胞的凋亡情况。(B) 计算凋亡细胞的百分比[膜联蛋白]-[V阳性(%) + 阳性(百分比)]。数据表示至少三个独立实验的平均值 ± SEM。(C) 通过蛋白质印迹检测肝细胞癌HUH7细胞中MARCH2过表达的cleaved-caspase 3和切割cleaved-PARP的水平
Figure 3. Overexpression of MARCH2 enhances cell population in the S phase. (A) Cell cycle of hepatocellular carcinoma HUH7 cells with or without of MARCH2-overexpression was detected by flow cytometry. (B-D) G0/G1, G2/M and S phase cells were calculated. Each bar represents the mean ± SD from three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01
图3. MARCH2过表达的肝细胞癌HUH7细胞中S期细胞群增多。(A) 流式细胞术检测有或没有MARCH2过表达的肝细胞癌HUH7细胞的细胞周期。(B-D)计算G0/G1、G2/M和S期细胞。每条线代表三个独立实验的平均值 ± 标准差，*p < 0.05，**p < 0.01
有进行自噬的倾向[9]-[14]，肝细胞癌的增殖很可能受到自噬的调节。此外，由于MARCH2是一种自噬相关蛋白，我们假设MARCH2过表达引起的肝细胞癌HUH7细胞增殖加速可能与自噬有关。
我们评估了MARCH2对自噬活性的影响。共聚焦显微镜的数据显示，与对照组相比，MARCH2过表达减少了GFP-LC3B的点状分布。由于GFP-LC3B斑点与自噬体的数量相关，GFP-LC3B斑点的减少可能是由于自噬体形成减少或溶酶体清除自噬体增加。为了分析MARCH2过表达细胞中的自噬状态，我们在存在或不存在巴非霉素A1 (BafA1)的情况下培养细胞，BafA1通过抑制液泡HCATPase (V-ATPase)来阻止自噬体和溶酶体之间的融合。我们观察到，BafA1处理导致MARCH2转染细胞中的GFP-LC3B点比对照细胞多(图4(A)和图4(B))。根据这些结果，我们接下来通过蛋白质印迹测量了LC3B的转化率。我们观察到，MARCH2在肝细胞癌HUH7细胞中的过表达降低了内源性LC3B-II的水平。在有或没有BafA1的葡萄糖饥饿细胞中观察到类似的结果(图4(C)和图4(D))。此外，在MARCH2过表达细胞中观察到内源性自噬底物SQSTM1条带比对照细胞增加(图4(E)和图4(F))，表明MARCH2过度表达阻断了自噬底物的清除，从而抑制了肝细胞癌HUH7细胞的自噬通量。
接下来，我们在MARCH2过表达细胞系中使用常用自噬诱导剂雷帕霉素来检测肝细胞癌HUH7细胞的生长。结果表明，挽救的自噬可以逆转癌细胞加速的增殖率(图5)。
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Figure 4. MARCH2 injures autophagy in hepatocellular carcinoma HUH7 cells. (A) The indicated cell lines with or without MARCH2-overexpression were infected with GFP-LC3 for 24 h, then treated with or without Glucose free DMEM for the last 8 h and/or BafA1 (10 nM) for the last 6 h. Representative confocal microscopy images of GFP-LC3B distribution obtained from the indicated cell lines are shown. (B) Quantification of GFP-LC3B puncta per cell treated as in (A). Data are means ± SD of at least 100 cells scored. **p < 0.01, ***p < 0.001. (C) The levels of LC3B-II were detected in the cells treated as in (A) by western blot. (D) Quantification of LC3B-II levels relative to ACTB in cells treated as in (C). Average value in control cells was normalized as 1. Data are means ± SD of results from 3 experiments (*p < 0.05, **p < 0.01). (E) The levels of SQSTM1 in the indicated cell lines with or without MARCH2-overexpression were analyzed by Western blot. (F) Quantification of amounts of SQSTM1 relative to ACTB in cells treated as in (E). The average value in control cells was normalized as 1. Data are means ± SD of results from 3 experiments (**p < 0.01, ***p < 0.001)
图4. MARCH2抑制肝细胞癌HUH7细胞的自噬。(A) 将具有或不具有MARCH2过表达的指示细胞系用GFP-LC3转染24小时，然后在最后8小时用或不用无葡萄糖DMEM和/或在最后6小时用BafA1 (10 nM)处理。显示了从指示细胞系获得的GFP-LC3B分布的代表性共聚焦显微镜图像。(B) 按(A)处理的每个细胞GFP-LC3B斑点定量。数据为至少100个细胞评分的平均值 ± 标准差，**p < 0.01，***p < 0.001。(C) 通过蛋白质印迹检测如(A)中处理的细胞中LC3B-II的水平。(D) 如(C)所述处理的细胞中LC3B-II水平相对于ACTB的定量。对照细胞的平均值标准化为1。数据为3个实验结果的平均值±标准差(*p < 0.05, **p < 0.01)。(E) 通过Western blot分析具有或不具有MARCH2过表达的指示细胞系中SQSTM1的水平。(F) 如(E)所述处理的细胞中SQSTM1相对于ACTB的定量。对照细胞的平均值被归一化为1。数据为3个实验结果的平均值 ± 标准差(**p < 0.01, ***p < 0.001)
Figure 5. Rescued autophagy can bring the proliferation rate of tumor cells back to the control level. Cells growth of hepatocellular carcinoma HUH7 cells with or without of MARCH2-overexpression and/or rapamycin was detected by MTS assay. Data were mean ± SD from three independent experiments
图5. 挽救的自噬可以逆转癌细胞加速的增殖率。MTS法检测有或没有MARCH2过表达和/或雷帕霉素的肝细胞癌HUH7细胞的生长情况。数据为三个独立实验的平均值 ± 标准差
这些数据表明，MARCH2过表达通过抑制自噬对肝细胞癌HUH7细胞产生促肿瘤活性。
4. 讨论
众所周知，自噬在肿瘤生物学中起着双重作用。自噬最初被认为可以抑制肿瘤的发生，这种肿瘤抑制的间接证据是自噬的失活导致癌基因和肿瘤抑制基因的改变，如AKT扩增、PI3K突变和PTEN23缺失。这意味着自噬的激活可以阻断癌症细胞的转化。自噬作为肿瘤抑制因子的更直接证据是对ATG5、ATG7和BECN1等核心自噬分子的遗传研究。研究表明，自噬缺陷会增加肿瘤的发生率[16] [17]。从机制的角度来看，自噬的抑制导致ROS的积累、DNA损伤和线粒体缺陷的增加，这些都与肿瘤发生有关[18]。具体来说，线粒体自噬可以减少受损线粒体，相反，自噬缺陷会导致受损线粒体在细胞内积累和线粒体氧化代谢所产生的活性氧(ROS)产生增加，而ROS在肿瘤转移复发中呈现出双向性和复杂性，一方面ROS可以通过损害线粒体基因、激活肿瘤相关通路等方式促进肿瘤进展；另一方面，ROS积累过量可能使线粒体等细胞器甚至细胞受到损伤，从而抑制肿瘤进展[18]。此外，放疗是一种重要的肿瘤治疗策略，可直接或间接引起肿瘤细胞的DNA损伤。自噬是一种与DNA损伤相关的生理过程。电离辐射可以引起Parkin/BNIP3介导的线粒体自噬，增强DNA损伤，提高肿瘤细胞的放射敏感性，最终促进肿瘤细胞死亡[18]。自噬的失活导致肿瘤发生中SQSTM1的增加[17]。相比之下，自噬可以通过SQSTM1减少来抑制肿瘤发生。SQSTM1的过表达参与肾细胞癌的发展[19]。在癌症组织中，SQSTM1的表达上调，并与胃癌的低分化有关[20]。SQSTM1缺乏抑制肿瘤发生[21]，可能是因为氧化应激增加，也可能是因为SQSTM1是多种癌症基因途径的信号适配器，包括MTOR、NRF2和NF-κB [22]。MAP1LC3B的低表达与低Beclin-1相关，预示着胃癌的淋巴结转移和预后不良[23]。
肿瘤细胞也依赖于自噬，可能是因为缺乏微环境，而代谢增强、生物合成需要增加，否则增殖会降低。例如，自噬在缺氧环境中上调，这对肿瘤细胞的生长很重要[24]。在RAS转化的癌症细胞中自噬上调，促进RAS转化的癌症细胞的生长、存活、肿瘤[25]-[27]、侵袭和转移[28]。在RAS驱动的肿瘤中，自噬缺陷可导致线粒体代谢紊乱和对应激的敏感性。这些结果表明了一个新的概念，即RAS驱动的肿瘤可能是自噬成瘾[25] [27] [29]。ATG17/FIP200的缺陷也抑制了T抗原驱动的乳腺癌症的生长，这表明自噬在促进肿瘤发生中起着重要作用。自噬成瘾在癌症中的概念可能更广泛地适用。自噬相关基因在肿瘤发生发展中的作用以及潜在的临床应用需要进一步探索。
在这项研究中，我们研究了MARCH2与肝细胞癌之间的关系。我们发现MARCH2过表达通过负调控自噬促进肝细胞癌HUH7细胞的增殖，表明自噬可以负调控肝细胞癌HUH7细胞的增殖。敲除MARCH2是否抑制肝细胞癌还有待确定。总之，MARCH2可能是肝细胞癌治疗的新靶点。
基金项目
本研究由山东省医药卫生科技项目(202304010866)；临沂市重点研发计划(医学类) (2023YX0096)资助。
NOTES
*通讯作者。