桑枝总生物碱改善糖尿病肾病小鼠肾损伤作用机制研究

Research on the Mechanism of Sangzhi Alkaloids in Improving Renal Injury in Diabetic Kidney Disease Mice

摘要: 目的：探讨桑枝总生物碱(Sangzhi alkaloids, SZ-A)对糖尿病肾病小鼠肾损伤的改善作用机制。方法：将db/m小鼠作为对照组、db/db小鼠随机分为模型组(db/db组)和桑枝总生物碱治疗组(SZ-A组)，SZ-A组小鼠接受SZ-A灌胃12周处理。对各组小鼠检测体重、空腹血糖以及血清ALP、BUN、CREA等指标，并结合HE、PAS染色观察肾组织病理改变，同时利用ELISA和Western blot检测氧化应激、炎症因子(TNF-α, IL-6, IL-1β)和纤维化标志物(TGF-β1, Collagen IV, α-SMA)以及凋亡相关蛋白(Cleaved Caspase-3, Bax, Bcl-2)的表达水平。结果：db/db小鼠较db/m组呈现显著高血糖及肾功能异常，表现为血清ALP、BUN、CREA水平升高，同时伴随氧化应激标志物SOD活性下降与MDA、LDH水平上升。该组小鼠肾脏组织出现显著炎症反应，TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子表达增强，并伴有TGF-β1介导的纤维化进程加速，Collagen IV和α-SMA异常沉积。p38 MAPK通路异常激活及Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2凋亡调控失衡进一步加重肾损伤(P < 0.05)。经SZ-A治疗后，上述高血糖、肾功能障碍、氧化损伤及炎症反应均获显著缓解，肾组织纤维化程度减轻，病理结构改善，同时TGF-β1/p38 MAPK信号转导及细胞凋亡相关蛋白表达趋于正常化(P < 0.05)。结论：SZ-A能显著改善糖尿病肾病小鼠的肾损伤，其作用机制可能与抑制TGF-β1/p38 MAPK纤维化信号通路以及调控细胞凋亡和炎症反应密切相关。

Abstract: Objective: To investigate the mechanism by which Sangzhi alkaloids (SZ-A) improve kidney injury in mice with diabetic kidney disease. Methods: The db/m mice were used as the control group, while the db/db mice were randomly divided into a model group (db/db group) and a treatment group administered with Sangzhi alkaloids (SZ-A group). The SZ-A group received SZ-A via gavage for 12 weeks. Body weight, fasting blood glucose, and serum levels of ALP, BUN, CREA, and other indicators were measured in each group. Additionally, HE and PAS staining were employed to observe pathological changes in the kidney tissue. The expression levels of oxidative stress markers, inflammatory factors (TNF-α, IL-6, IL-1β), fibrosis markers (TGF-β1, Collagen IV, α-SMA), and apoptosis-related proteins (Cleaved Caspase-3, Bax, Bcl-2) were assessed using ELISA and Western blot. Results: The db/db mice exhibited significantly higher blood glucose levels and renal dysfunction compared to the db/m group, characterized by elevated serum ALP, BUN, and CREA levels, along with decreased SOD activity and increased levels of MDA and LDH as markers of oxidative stress. This group displayed significant inflammatory responses, with enhanced expression of pro-inflammatory factors TNF-α, IL-6, and IL-1β, alongside accelerated fibrosis mediated by TGF-β1, resulting in abnormal deposition of Collagen IV and α-SMA. Abnormal activation of the p38 MAPK pathway and imbalances in apoptosis regulation involving Cleaved Caspase-3, Bax, and Bcl-2 further exacerbated kidney injury (P < 0.05). Following treatment with SZ-A, the aforementioned high blood glucose levels, renal dysfunction, oxidative damage, and inflammatory responses were significantly alleviated, with reduced kidney tissue fibrosis and improvements in pathological structure. Concurrently, TGF-β1/p38 MAPK signal transduction and the expression of apoptosis-related proteins tended toward normalization (P < 0.05). Conclusion: SZ-A significantly improves kidney injury in diabetic nephropathy mice, and its mechanism of action may be closely related to the inhibition of the TGF-β1/p38 MAPK fibrotic signaling pathway and the regulation of apoptosis and inflammatory responses.

1. 引言

糖尿病肾病(diabetic kidney disease, DKD)是终末期肾病的主要原因之一，其发病机制与TGF-β1/p38 MAPK信号轴介导的肾损伤及纤维化密切相关[1]-[3]。尽管该信号通路已成为重要治疗靶点，但现有TGF-β1抑制剂因显著的肝肾毒性限制了临床应用。桑枝总生物碱(Sangzhi alkaloids, SZ-A)作为创新型降糖中药，虽已证实其降糖作用，但其对DKD特异性病理进程的调控作用尚未阐明[4]。本研究基于2型糖尿病db/db小鼠模型，系统评估SZ-A对2型糖尿病db/db小鼠肾损伤及纤维化的影响，并探讨其肾脏保护作用是否与抑制TGF-β1/p38 MAPK信号通路的激活有关，为开发天然来源的DKD靶向治疗策略提供实验依据。

2. 材料与方法

2.1. 主要试剂与仪器

桑枝总生物碱片购自北京五和博澳药业有限公司；苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin, HE)染色试剂盒、过碘酸雪夫(Periodic Acid-Schiff, PAS)染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠肿瘤坏死因子α (Tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素6 (interleukin-6, IL-6)、白细胞介素1β (interleukin-1β, IL-1β)酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)活性、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；兔源多克隆p-p38 MAPK、鼠源单克隆p38 MAPK、兔源多克隆Cleaved Caspase 3、兔源多克隆α-SMA、兔源多克隆Bax、兔源多克隆Bcl-2、鼠源单克隆β-actin一抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；兔源单克隆TGF-β1、兔源多克隆Collagen IV一抗购自美国abcam生物技术公司；彩虹245蛋白Marker、彩虹180蛋白Marker、荧光兔二抗、荧光鼠二抗购自VICMED公司；手动移液器和高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；Synergy2多功能酶标仪购自美国BioTek公司；第四代蛋白质电泳仪和电转仪购自美国Bio-Rad公司；Odyssey CLx双色红外荧光少扫描成像系统购自美国LI-COR公司；奥林巴斯BX43正置明场显微镜购自日本奥林巴斯株式会社。

2.2. 实验小鼠分组及处理

10只雄性6~7周龄的健康SPF级db/m (C57BLKS/J-lepr^db/+)小鼠和20只雄性6~7周龄的健康SPF级db/db (C57BLKS/J-lepr^db/db)小鼠购自南京生物医药研究院，并饲养于南京医科大学康达学院动物实验中心的SPF级动物房。实验期间，小鼠均可自由饮水和进食，饲养环境为室温24℃~26℃，湿度50%~60%，光暗周期为12 h交替。将正常db/m小鼠设为对照组(db/m组)，20只2型糖尿病db/db小鼠采用简单随机抽样分为糖尿病肾病组(db/db组)和桑枝总生物碱治疗组(SZ-A组)。SZ-A组小鼠每天给予200 mg/kg的桑枝总生物碱灌胃处理，db/m和db/db组小鼠分别给予等量的生理盐水灌胃处理。经过连续12周的实验干预后，对各组小鼠进行相应的标本采集和实验指标检测。

2.3. 样品准备

在实验期间，定期检测各组小鼠体重和空腹血糖水平。药物治疗12周后，对小鼠进行麻醉，采集血液样本，并通过高速离心收集血清。利用全自动生化分析仪测定血清碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)、尿素氮(Blood Urea Nitrogen, BUN)和肌酐(Creatinine, CREA)水平。快速剥离小鼠肾脏，经过冲洗后用滤纸吸干并称重。右肾用于氧化标志物检测、炎症因子分析及Western blot相关蛋白检测。左肾多聚甲醛固定，进行石蜡包埋，并切成4 μm的切片，用于光学显微镜下的形态学观察和免疫组化检测。

2.4. 氧化应激标志物和炎症因子检测

将新鲜肾组织制成匀浆后，根据试剂盒说明书进行以下测定：采用黄嘌呤氧化酶法测定肾组织中的SOD酶活性，使用硫代巴比妥酸法测定MDA水平，以及通过比色法测定LDH水平。采用ELISA法检测肾组织中TNF-α、IL-6和IL-1β炎症因子水平。

2.5. HE染色和PAS染色

将肾组织石蜡切片脱蜡至水后，根据试剂盒说明书进行苏木精-伊红(HE)染色和PAS染色，并在光学显微镜下观察肾组织的形态变化。对于PAS染色的切片，进行肾小球系膜扩张指数评分[5]。具体评分标准如下：正常肾小球为0分；系膜基质增生占肾小球面积的比例小于10%为1分；占比10%至20%为2分；占比20%至30%为3分；占比30%至40%为4分；占比大于40%为5分。计算每张切片3个视野下平均得分，作为肾小球系膜扩张指数评分。

2.6. 免疫组化检测肾组织TGF-β1、Collagen IV和α-SMA的表达

将肾组织石蜡切片脱蜡至水后，使用10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)在95℃下进行热诱导抗原修复20 min。抗原修复后，将组织置于室温下浓度为10% BSA封闭缓冲液溶液中封闭30 min。随后，用TGF-β1、Collagen IV和α-SMA抗体在4℃下过夜孵育。孵育后，充分洗涤切片，并使用过氧化物酶抑制剂在室温下淬灭内源性过氧化物酶活性30 min。接着，使用Invitrogen山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP二抗(1:500)进行孵育。最后，应用Thermo Scientific金属增强型DAB底物试剂盒进行比色检测。封片后，在奥林巴斯BX53正置明场显微镜下进行检测和观察。

2.7. 免疫印迹法检测相关蛋白表达

将肾组织制成匀浆后提取蛋白，并进行定量蛋白制样，采用8%、10%、12.5% SDS-PAGE进行凝胶电泳。每个样品的蛋白上样量为40 μg，在80 V恒压下进行电泳，待分离胶中的蛋白Marker分开后，上调电压至125 V，继续电泳至样品达到适当位置后关闭电源。330 mA恒流湿转法将蛋白转至硝酸纤维素膜(Nitrocellulose filter membrane，NC膜)上，快速封闭液封闭20 min，清洗NC膜后分别加入TGF-β1、p-p38 MAPK、p38 MAPK、Cleaved Caspase 3和β-actin抗体在4℃下过夜孵育。NC膜充分清洗后，在室温下进行荧光二抗孵育2 h。再次清洗NC膜，将膜置于Odyssey CLx双色红外荧光扫描仪中进行成像，并记录相应条带的灰度值，计算目的蛋白与内参蛋白灰度值的平均比值，或磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白灰度值的平均比值，以进行半定量统计分析。

2.8. 统计学分析

使用IBM SPSS 25.0进行数据分析，并使用GraphPad Prism 9.0进行图表绘制。计量资料均符合正态分布，以$\overline{x}\pm s$ 表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. SZ-A对db/db小鼠的体重、空腹血糖及肾功能指标的影响

与db/m组相比，db/db组小鼠的体重和空腹血糖水平均显著升高(P < 0.01)。经SZ-A灌胃治疗后，SZ-A组小鼠在第8、12周时间点的体重和空腹血糖水平略低于db/db组，但差异无统计学意义(P > 0.05)，见图1(A)和图1(B)。此外，与db/m组相比，db/db组小鼠ALP、BUN和CREA水平显著升高(P < 0.01)。SZ-A组小鼠的血清ALP、BUN和CREA水平较db/db组显著降低(P < 0.05)，见图1(C)~(E)。

3.2. SZ-A减轻db/db小鼠肾组织病理结构损伤

HE染色显示，db/m组小鼠肾组织病理结构正常，而db/db组呈小鼠肾小球体积增大，伴有肾小管上皮细胞空泡变性及管腔扩张，间质可见大量淋巴细胞浸润。SZ-A组较db/db组小鼠肾组织病理损伤显著改善(P < 0.01)，见图2(A)和图2(B)。PAS染色结果进一步发现，db/db组较db/m组小鼠肾小球基底膜明显增厚，系膜基质面积占比升高，并伴有显著糖原沉积。SZ-A组较db/db组小鼠肾小球基底膜增厚程度降低，糖原沉积面积减少，系膜基质扩张指数GMI显著降低(P < 0.01)，见图2(C)和图2(D)。

Figure 1. Comparison of body weight and fasting blood glucose levels among different groups of mice (^*P < 0.05, ^**P < 0.01, compared with the db/m group; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01)

图1. 各组小鼠的体重和空腹血糖水平的比较(^*P < 0.05, ^**P < 0.01, compared with the db/m group; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01)

Figure 2. Observation of the pathological morphology of renal tissues in each group of mice using HE staining (A) and PAS staining (B) (×400; ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, compared with the db/m group; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01)

图2. HE染色(A)和PAS染色(B)观察各组小鼠肾组织的病理形态(×400; ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, compared with the db/m group; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01)

3.3. SZ-A改善db/db小鼠肾组织氧化应激和炎症因子水平

与db/m组相比，db/db组小鼠肾组织中SOD酶活性降低，而MDA和LDH水平升高(P < 0.01)。SZ-A组较db/db组小鼠肾组织中SOD酶活性明显升高，MDA和LDH水平降低(P < 0.01)，见图3(A)~(C)。与db/m组相比，db/db组小鼠肾组织中TNF-α、IL-6和IL-1β炎症因子水平升高(P < 0.01)。SZ-A组较db/db组小鼠肾组织中TNF-α、IL-6和IL-1β炎症因子水平降低(P < 0.05)，见图3(D)~(F)。

Figure 3. Comparison of oxidative stress and inflammation factor levels in renal tissues of different groups of mice (^*P < 0.05, ^**P < 0.01, compared with the db/m group; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01)

图3. 各组小鼠肾组织氧化应激和炎症因子水平的比较(^*P < 0.05, ^**P < 0.01, compared with the db/m group; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01)

3.4. SZ-A抑制db/db小鼠肾组织纤维化进程

免疫组化检测显示，与db/m组相比，db/db组小鼠组织中纤维化相关蛋白TGF-β1、Collagen IV和α-SMA的阳性表达面积百分比升高(P < 0.01)。SZ-A组较db/db组小鼠上述纤维化标志物的表达水平降低(P < 0.01)，见图4。

3.5. SZ-A调控db/db小鼠肾组织TGF-β1/p38 MAPK信号通路激活和凋亡相关蛋白表达

免疫印迹结果显示，与db/m组相比，db/db组小鼠肾组织TGF-β1蛋白表达水平升高P < 0.01)，p38 MAPK磷酸化水平升高(P < 0.01)。SZ-A组较db/db组小鼠肾组织TGF-β1表达和p38 MAPK磷酸化水平降低(P < 0.05)，见图5(A)~(C)。此外，db/db组较db/m组小鼠肾组织Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高(P < 0.01)，促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的比值升高(P < 0.01)。SZ-A组较db/m组小鼠肾组织Cleaved Caspase-3表达量下降，Bax/Bcl-2比值显著降低(P < 0.01)，见图5(D)~(F)。

Figure 4. Comparison of the expression levels of fibrosis-related proteins in renal tissues of different groups of mice (×400; ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, compared with the db/m group; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01)

图4. 各组小鼠肾组织纤维化相关蛋白表达水平比较(×400; ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, compared with the db/m group; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01)

Figure 5. Comparison of TGF-β1/p38 MAPK signaling pathway and apoptosis-related protein expression levels in kidney tissue of each group of mice (×400; ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, compared with the db/m group; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01)

图5. 各组小鼠肾组织TGF-β1/p38 MAPK通路及凋亡相关蛋白表达水平比较(×400; ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, compared with the db/m group; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01)

4. 讨论

近年来，糖尿病的发病率显著提高并呈年轻化趋势，随之而来的DKD患者数量也快速攀升[6]。作为糖尿病最常见的微血管并发症之一，DKD是导致终末期肾病的主要原因，其病理特征包括肾小球硬化、基底膜增厚以及肾小管间质纤维化等，而肾纤维化更是糖尿病肾病不断进展的关键环节[7]。研究显示，TGF-β1/p38 MAPK信号通路在肾纤维化发生与发展过程中起到关键作用[8]。本研究以2型糖尿db/db小鼠为模型，实验结果表明，SZ-A处理后不仅显著改善了肾功能指标和病理学损伤，还有效抑制了肾组织中氧化应激、炎症因子及纤维化相关标志物的异常表达，其作用机制可能与TGF-β1/p38 MAPK信号通路的抑制密切相关。

SZ-A作为天然来源降糖药物，其在抗炎、调节脂质代谢、平衡肠道菌群、促进创面愈合与心血管保护等多方面均展现出显著的药理学活性[9]-[13]。Song等人研究发现，SZ-A可通过上调脂肪酸氧化、恢复线粒体稳态，从而改善非糖尿病慢性肾脏病大鼠的肾损伤。本研究发现，SZ-A能够显著改善肾功能和病理损伤，包括降低尿蛋白、血清肌酐和尿素氮，减轻基底膜增厚、肾小管间质纤维化及胶原沉积，并下调肾组织中α-SMA和Col-Ⅰ的表达。这表明SZ-A在DKD小鼠的治疗中表现出显著的抗纤维化和肾保护作用。

在糖尿病状态下，持续性的高血糖会通过诱导氧化应激反应导致活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的过量生成，并引发脂质过氧化，从而加速DKD的病理进展[14]。在氧化应激条件下，肾组织中的抗氧化防御系统，如SOD酶活性显著降低，而脂质过氧化产物MDA水平显著升高，表明肾组织的氧化损伤加重。此外，LDH水平升高往往提示肾组织细胞损伤程度加重[15]。Zhou等人研究还发现，氧化应激还可刺激肾组织TNF-α、IL-6以及IL-1β等促炎因子释放，进一步损害肾小球和肾小管结构，加速间质纤维化的进展[15]。本研究发现，桑枝总生物碱干预能够显著改善db/db小鼠肾皮质的氧化应激状态和炎症水平，其抗氧化及抑炎作用对肾功能起到进一步的保护作用。

TGF-β1/p38 MAPK信号通路在DKD的发病机制中具有重要作用。在DKD的病理过程中，持续高血糖可诱导肾组织中TGF-β1的异常高表达，进而激活下游p38 MAPK信号通路，加速成纤维细胞活化和细胞外基质的沉积，最终导致肾纤维化[8] [16]。本研究发现，SZ-A下调了TGF-β1的表达并抑制p38 MAPK的过度激活，进而阻断了该信号通路的级联效应。研究表明p38 MAPK通路在细胞凋亡调控中同样起到重要作用，抑制其磷酸化可有效降低凋亡水平并减轻肾脏损伤[17]。本研究进一步发现，SZ-A干预后的促凋亡指标Cleaved Caspase-3和Bax明显下调，Bcl-2表达则显著上调，说明其抗凋亡效应不仅直接保护肾脏细胞，也间接减缓肾纤维化进程。

尽管本研究取得了一系列积极成果，但仍存在一定局限性。本研究采用2型糖尿病db/db小鼠模型，该模型虽能较好地模拟DKD的部分病理特征，但在肾纤维化的进程和复杂性上仍与人类DKD有所差异，因此在临床转化过程中需要进一步验证。此外，本研究主要聚焦于TGF-β1/p38 MAPK信号通路及相关分子指标，尚未系统评估其他可能参与DKD发病机制的信号路径，如NF-κB、ERK等，其交互作用及综合调控效应有待进一步探讨。

综上所述，本研究首次系统性验证了SZ-A在DKD肾损伤中改善作用，并初步揭示了其机制可能与抑制TGF-β1/p38 MAPK纤维化信号通路、减轻氧化应激和炎症反应，以及调控细胞凋亡密切相关。这些结果不仅为进一步开发天然药物治疗DKD提供了科学依据，也为揭示糖尿病肾病的复杂病理过程提供了新的视角。

基金项目

江苏省大学生创新创业训练计划项目(202313980023Y)。

NOTES

^*通讯作者。