基于网络药理学和分子对接探讨茵太养肝方治疗药物性肝损伤的作用机制

Exploring the Therapeutic Mechanism of Yintai Yanggan Formula in Treating Drug-Induced Liver Injury Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

摘要: 目的：基于网络药理学分析茵太养肝方治疗药物性肝损伤(DILI)的潜在作用靶点和信号通路，并通过分子对接技术进一步阐明其治疗DILI的具体机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)和uniport数据库以及GeneCards和OMIM数据库，获取茵太养肝方活性成分和作用靶点以及DILI靶点。利用Veeny 2.1在线工具、Cytoscape软件和STRING数据库分别进行韦恩图绘制、化合物–靶点网络和蛋白–蛋白互作(PPI)网络。利用R软件和Metascape进行GO和KEGG信号通路富集分析。采用AutoDock和PyMol3.1软件进行分子对接验证。结果：获取到茵太养肝方潜在有效活性成分75个和215个作用靶点，197个复方–疾病交集靶点，核心靶点21个；KEGG主要富集在脂质与动脉粥样硬化和PI3K/Akt等相关的信号通路上。分子对接结果显示，关键靶点AKT1、TNF和TP53等与主要活性成分槲皮素、汉黄芩素、β-谷甾醇均对接稳定。其中，AKT1与β-谷甾醇、槲皮素结合性最好。结论：茵太养肝方中的槲皮素、β-谷甾醇等活性成分，可能作用于AKT1和TNF等靶点，通过调控脂质与动脉粥样硬化、PI3K/Akt等信号通路，发挥抗炎、抗氧化和抗细胞凋亡的作用以及参与肝细胞活化、增殖和分化过程从而起到治疗药物性肝损伤的作用。

Abstract: Objective: Based on network pharmacology analysis, the potential targets and signaling pathways of Yintai Yanggan Formula in treating drug-induced liver injury (DILI) were identified, and the specific mechanism of its treatment for DILI was further elucidated through molecular docking technology. Method: The active ingredients and targets of Yintai Yanggan Formula, as well as disease targets related to DILI, were obtained through the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP), uniport database, GeneCards and OMIM database. Use Veeny 2.1 online tool, Cytoscape software, and STRING database to draw Venn diagrams, drug target interaction network diagrams, and protein-protein interaction (PPI) networks, respectively. Perform GO and KEGG signaling pathway enrichment analysis using R software and Metascape platform. Molecular docking validation was performed using AutoDock and PyMol3.1 software. Result: 75 potential active ingredients and 215 action targets, 197 compound disease intersection targets, and 21 core targets were obtained from Yintai Yanggan Formula; KEGG is mainly enriched in the signaling pathways related to lipid and atherosclerosis and PI3K/Akt. The molecular docking results showed that the key targets AKT1, TNF, and TP53 were stably docked with the main active ingredients quercetin, baicalein, and beta-sitosterol. Among them, AKT1 has the best binding affinity with beta-sitosterol and quercetin. Conclusion: The active ingredients such as quercetin and beta-sitosterol in Yintai Yanggan Formula may act on targets such as AKT1 and TNF, and play the role of anti-inflammation, anti-oxidation and anti-apoptosis, and participate in the process of liver cell activation, proliferation and differentiation to treat drug-induced liver injury by regulating lipid and atherosclerosis, PI3K/Akt and other signal pathways.

1. 引言

药物性肝损伤(drug-induced liver injury, DILI)是人体暴露于特定药物后由药物本身或其代谢产物对肝脏产生直接或间接影响而引起的肝损伤[1]。一项在中国开展的多中心回顾性研究揭示，DILI在普通人群中的年发病率高达23.80/10万[2]。相比之下，中国的DILI发病率远高于西方国家[3]-[6]。DILI的发病率呈现出逐年上升的趋势，且主要影响中老年人群，现已攀升至全球死亡原因的第五位[7] [8]。目前，DILI的治疗主要侧重于对症治疗，而抗炎保肝药物的使用可能会进一步加重肝脏的负担，对于免疫机制介导的DILI采用激素治疗时需充分权衡利弊[9]。中医在亚洲已有数千年的发展历史，因其低毒性[10]在日常保健中占据着重要作用，至今仍被广大民众所接纳和使用[11] [12]。中医认为，DILI是由于药毒侵袭人体，直犯经络，蕴结其中，遂致肝之常功失序。肝脾共踞中焦之地，肝气若有所郁结，遂致脾气失于健运，痰湿因而内蓄，其象则显为肝盛脾衰，虚实相杂之候。DILI的临床表现与中医的“黄疸”“胁痛”“虚劳”“痞满”“积聚”“药物毒”等病症相吻合。大量的临床研究资料表明，中药在保护肝脏、改善肝功能方面成效颇为显著，其作用机理广泛涵盖多个靶点和途径[13]。茵太养肝方是针对虚实挟杂证而设计的方剂，治疗上祛邪扶正并用，以清热利湿为主线，辅以疏肝健脾之法。该方选用茵陈、黄芩为君药，其中茵陈乃疗湿热病证之专擅，其利湿退黄之效，颇为卓著。黄芩则可清热燥湿，泻火解毒。两药合用，可减轻肝胆湿热。垂盆草、鸡骨草和醋制柴胡作为臣药，辅助君药清热利湿，同时兼有疏肝、解郁、止痛之功效。麸炒白术、茯苓、太子参、当归共为佐药，有益气健脾、祛湿、生津、柔肝止痛以及调和阴阳之功效。尽管如此，关于茵太养肝方在治疗DILI方面的具体作用机制，目前尚存在诸多不明之处，且尚未经过系统的实验验证加以明晰。有鉴于此，本研究致力于运用网络药理学及分子对接技术，对茵太养肝方在治疗DILI过程中的潜在作用靶点及其所涉及的信号通路进行深入预测与探究，以期揭示其作用机制，从而为该方的临床应用提供更为坚实的理论依据与参考。

2. 资料与方法

2.1. 网络药理学研究

2.1.1. 茵太养肝方和药物性肝损伤(DILI)靶点获取

利用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP, https://tcmsp-e.com)数据库，以口服利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%且类药性(drug likeness, DL) ≥ 0.18%为要求，筛选各药符合条件的活性成分。采用uniport (https://www.uniport.org)数据库，根据“Reviewed”和“Human”为条件，进行注释校正，去除重复项，从而得到茵太养肝方的有效成分和对应作用靶点。在GeneCards (https://www.genecards.org)、OMIM数据库(https://www.omim.org)中用“Drug Induced Liver Injury”进行检索，GeneCards数据库筛选评分大于中位数的靶点，汇总并去重后得到DILI全部靶点。

2.1.2. 药物–活性成分–靶点–疾病网络构建

利用Veeny 2.1在线工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)获取复方与DILI的交集靶点，并绘制韦恩图。通过Cytoscape3.7.2软件构建“药物–活性成分–靶点–疾病”网络图，对主要活性成分进行筛选。

2.1.3. 蛋白互作PPI网络的构建

将茵太养肝方的靶点基因与DILI相关靶点的交集靶点数据导入STRING 12.0数据库(https://string-db.org)构建PPI (protein-protein interaction)网络，物种选择人类(homo sapiens)，置信度选项中选取0.7 (高置信度)，将游离靶点隐藏，其余参数设置不做更改，导出PPI网络图。再将结果导入Cytoscape3.7.2软件，通过CytoNCA插件，对介数值(Betweenness Counts, BC)、亲密值(Closeness Counts, CC)、度值(Ddgree Counts, DC)的中位值评分进行两次筛选后，从而得到核心靶点。

2.1.4. GO功能富集和KEGG通路富集

利用R软件的clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2函数包及clusterProfiler函数包的enrichKEGG函数和Metascape数据库，以P < 0.05为条件，对茵太养肝方治疗DILI的潜在靶点进行GO的生物过程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)和细胞组分(cell component, CC)富集分析和KEGG信号通路富集分析，并对以上结果进行可视化。

2.2. 分子对接

从pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载活性成分小分子的2D结构信息，通过ChemBio3D Ultra 14.0对小分子进行结构优化，转化为3D结构并保存。借助Unitport数据库检索蛋白的ID信息，通过RCSB-PDB数据库下载对应的蛋白结构信息，并利用PyMol3.1去除蛋白中的水和小分子。然后，利用AutoDock Tools 1.5.7软件对小分子和蛋白进行加氢处理，并寻找蛋白的对接口袋信息。最后，通过AutoDock Vina 1.5.6和PyMol3.1软件对蛋白和小分子进行分子对接和可视化处理。

3. 结果

3.1. 网络药理学分析

3.1.1. 茵太养肝方和药物性肝损伤(DILI)靶点获取

通过TCMSP共获取到茵太养肝方活性成分75个，其中茵陈12个、黄芩36个、柴胡17个、鸡骨草4个、垂盆草5个、太子参8个、白术7个、茯苓21个、当归2个。经过严谨的数据整合和去重，UniProt数据库最终确定了215个与之对应的靶点基因。通过GeneCards、OMIM数据库，共获取到药物性肝损伤靶点基因6179个。

3.1.2. 药物–活性成分–靶点–疾病网络构建

通过Veeny2.1在线工具，将复方的215个靶点与6179个疾病靶点取交集，并绘制韦恩图，得到茵太养肝方治疗药物性肝损伤的作用靶点197个，见图1(a)。通过Cytoscape3.7.2软件绘制“药物–活性成分–靶点–疾病”网络关系图，共获得275个节点和942条边，见图1(b)。Degree值排名前五的主要活性化合物，依次为MOL000098 [槲皮素(quercetin)]、MOL000006 [木犀草素(luteolin)]、MOL000422 [山柰酚(kaempferol)]、MOL000173 [汉黄芩素(wogonin)]、MOL000358 [β-谷甾醇(beta-sitosterol)]。上述高连接度的活性化合物可能在DILI的治疗中发挥关键的药理效应。

3.1.3. PPI网络分析及核心靶点筛选

基于获取到的197个交集靶点，借助STRING数据库进行PPI网络的构建，该网络包含196个节点和1485条边，见图1(c)。将PPI网络导入Cytoscape3.7.2软件，通过对BC、CC、DC进行筛选后，最终得到21个核心靶点，见图1(d)。其中，Degree值表示网络中节点之间的连接数，排名前5的靶点分别是TP53、AKT1、IL6、TNF、IL1B，见表1。上述靶点处于网络核心位置，可能为茵太养肝方治疗DILI的主要作用靶点。

3.1.4. GO功能富集和KEGG富集分析

通过R软件和Metascape数据库，以P < 0.05为筛选条件，对197个交集靶点进行生物富集分析。得到2797条GO分析条目，其中BP 2446条、MF 226条、CC 125条及181条KEGG通路。选取排名前10的功能和排名前25的通路，采用R软件对结果进行可视化，分别绘制GO条形图和KEGG气泡图，见图2(a)、图2(b)。其中，KEGG富集到的各通路上的关键靶点分布路径各异，在脂质与动脉粥样硬化信号通路上的分布路径图如图3所示。

3.2. 分子对接结果

将degree值排名前5的核心靶点与前5的活性成分进行分子对接，对接的亲和能值结果见图4，亲和能值越低，结合越稳定。由图4可知，各活性成分与AKT1结合最好，亲合能值最低。其中，AKT1与β-谷甾醇结合最为优异，故选取其作图，见图5。结果表明，各核心靶点均可被茵太养肝方活性成分所调控。

(a)

(b)

(c)

(d)

注：(a) 绿色为茵太养肝方靶点，蓝色为DILI靶点；(b) 红色为药物，粉色为交集靶点，绿色为活性成分，黄色为共有成分；(c) 颜色越深则度值越大，连线越多则相关性越强；(d) 核心靶点的筛选。

Figure 1. (a) Venn diagram of the targets of Yintai Yanggan Formula and DILI; (b) Network diagram of “drug-active ingredient-target disease”; (c) PPI network diagram of potential targets in the treatment of DILI with Yintai Yanggan Formula; (d) Core target PPI network diagram

图1. (a) 茵太养肝方靶点与DILI靶点韦恩图；(b) “药物–活性成分–靶点–疾病”网络图；(c) 茵太养肝方治疗DILI潜在靶点PPI网络图；(d) 核心靶点PPI网络图

Table 1. PPI degree values of common genes in the treatment of DILI with Yintai Yanggan Formula

表1. 茵太养肝方治疗DILI共同基因的PPI度值

No.	Gene	Degree	No.	Gene	Degree	No.	Gene	Degree
1	TP53	76	8	HSP90AA1	51	14	CCND1	41
2	AKT1	65	9	BCL2	49	16	FOS	39
3	IL6	64	10	MYC	49	17	RELA	39
4	TNF	58	11	ESR1	43	18	CXCL8	37
5	IL1B	58	12	PTGS2	42	19	MAPK1	36
6	EGFR	57	13	MMP9	42	20	EGF	33
7	CASP3	55	14	H1F1A	42	21	MAKP8	33

(a)

(b)

Figure 2. (a) GO bar chart; (b) KEGG bubble plot

图2. (a) GO条形图；(b) KEGG气泡图

注：红色的蛋白为富集到Lipid and Atherosclerosis信号通路上的关键分子。

Figure 3. Distribution path diagram of key targets on lipid and atherosclerosis signal pathway in the treatment of DILI with Yintai Yanggan Formula

图3. 茵太养肝方治疗DILI在脂质与动脉粥样硬化信号通路上的关键靶点分布路径图

Figure 4. Heat map of affinity value matrix between target genes and active ingredients

图4. 靶点基因与活性成分亲和值矩阵热图

Figure 5. Docking diagram of AKT1 and β-sitosterol

图5. AKT1与β-谷甾醇对接图

4. 讨论

通过网络药理学分析与分子对接技术，我们预测茵太养肝方在治疗药物性肝损伤(DILI)过程中，其主要作用机制与脂质与动脉粥样硬化、乙型肝炎、AGE-RAGE信号通路和PI3K/Akt等信号通路相关联。此外，该方剂的主要活性组分涵盖槲皮素与β-谷甾醇等有效物质。通过PPI，获取到5个关键蛋白，其中将TP53、AKT1、IL6、TNF、IL1B作为核心靶点可与槲皮素、木犀草素、山柰酚、汉黄芩素、β-谷甾醇形成稳定的对接关系。

相关研究表明，DILI机制可能与氧化应激和炎症反应有关[14]。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是一种癌基因，由于其在调节细胞生长、代谢、转录、增殖、蛋白质合成和存活方面的重要作用[15]。PI3K/AKT通路是一种复杂而关键的信号通路，可动态调节炎症、代谢、细胞凋亡、细胞存活和细胞周期等各种过程[16]-[18]。一种新型PI3K抑制剂HS-173，可减弱HSCs和CCl4处理的肝纤维化小鼠中肝星状细胞的活化，从而缓解肝损伤，其机制与通过降低Akt表达来抑制PI3K/Akt信号通路，从而改变细胞活化、增殖和分化过程有关[19]。同时，PI3K/AKT1信号通路可调控脂代谢基因，影响肝脏脂质的合成、转运、降解等[20]，该通路可能与Lipid and atherosclerosis通路发挥协同作用，从而影响DILI的发生发展；其次，PI3K/Akt信号通路能被多种类型的细胞刺激或毒性刺激所激活，激活后Akt可通过磷酸化介导生长因子促增殖、抗凋亡发挥抗肝损伤作用[21]-[24]。

β-谷甾醇及其衍生物具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血脂等多种药理作用[25]，其可明显降低TNF-α等炎症因子的水平，通过抑制LPS/Gal N诱导的Toll样受体4 (TLR4)和核因子-κB (NF-κB)的过表达，从而抑制氧化和炎症反应，对脂多糖/D-氨基半乳糖诱导的小鼠急性肝损伤展现出治疗有效性[26]。TNF在肝脏中可诱导肝细胞凋亡和坏死性凋亡等许多生物反应[27]。同时，β-谷甾醇可对二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine, DMN)诱导的肝脏损伤有一定缓解作用[28]。

槲皮素属类黄酮化合物中的黄酮醇，具有较强的抗氧化、清除自由基、降血糖、降血脂及降低血压作用[29]-[31]，其抗衰老、抗突变、抗动脉粥样硬化的生物学活性都与抗氧化有关[32]。研究发现，槲皮素可通过降低氧化应激的能力和抗炎特性，改善雷公藤诱导的急性肝损伤；通过PI3K/Akt通路的抗氧化、抗炎和抗细胞凋亡作用来预防酒精性肝损伤；并通过抑制该通路减轻高果糖喂养诱导的动脉粥样硬化[33]-[35]。

综上所诉，茵太养肝方用于治疗DILI具有多成分、多靶点及多通路的特点，其机制可能与方中的槲皮素、β-谷甾醇等活性成分，作用于AKT1和TNF等靶点，通过调控脂质与动脉粥样硬化、PI3K/Akt等信号通路，发挥抗炎、抗氧化和抗细胞凋亡的作用以及参与肝细胞活化、增殖和分化过程从而起到治疗DILI的作用。本研究通过网络药理学来揭示茵太养肝方治疗DILI的机制，有助于推动中药在DILI中的应用，这为药物性肝损伤的治疗提供了新思路，但目前尚缺乏实验来验证这一结论。

基金项目

昆明理工大学“双一流”科技专项，编号：202302AG0003。

NOTES

^*通讯作者。