摘要: 目的：通过网络药理学和分子对接研究身痛逐瘀汤治疗骨转移癌痛的作用机制。方法：通过TCMSP和BATMAN-TCM获取身痛逐瘀汤活性成分及对应靶点，在GeneCards、Open Targets Platform数据库搜索骨转移癌痛相关靶点，对药物靶点和疾病靶点整合，获取交集靶点。通过Cytoscape 3.8.2构建“药物–成分–靶点–疾病”网络。借助STRING数据库构建疾病靶点蛋白质互作网络图(PPI)。将STRING输出的PPI文件导入Cytoscape 3.8.2软件，并利用MCODE插件进行分析2次分析，得到核心靶点。利用R语言工具包org.Hs.eg.db和ClusterProfiler对数据进行GO和KEGG富集分析。最后运行AutoDock Vina进行分子对接。结果：通过筛选得到身痛逐瘀汤活性成分267个，靶点1367个；骨转移癌痛相关靶点1070个；药物与疾病的交集靶点280个。其中IL10、IL6、TNF、IFNG、IL8是身痛逐瘀汤治疗骨转移癌痛的关键靶点，主要涉及PI3K-Akt、HIF-1、IL-17、细胞凋亡、TNF等信号通路。分子对接结果显示身痛逐瘀汤活性化合物姜黄素、薯蓣皂苷与IL10、IFNG等关键靶点具有较高结合能力。结论：身痛逐瘀汤可通过多成分、多靶点、多通路的协同作用来治疗骨转移癌痛。
Abstract: Objective: Using network pharmacology and molecular docking techniques, this study aims to explore the therapeutic mechanism of Body Pain and Blood Stasis Relieving Tang in alleviating bone metastatic cancer pain. Methods: We obtained the active ingredients and corresponding targets of Body Pain and Blood Stasis Relieving Tang through TCMSP and BATMAN-TCM, and searched the GeneCards and Open Targets Platform databases for targets related to bone metastatic cancer pain, and then integrated this study utilized Cytoscape 3.8.2 to establish a “drug - component - target - disease” network. Additionally, it employed the STRING database to create a protein-protein interaction (PPI) network for disease-related targets. The PPI file output from STRING was imported into Cytoscape 3.8.2 and analyzed twice with the MCODE plug-in to obtain the core targets. The data were analyzed for GO and KEGG enrichment using the R language toolkit org.Hs.eg.db and ClusterProfiler. Finally, AutoDock Vina was run for molecular docking. Results: 267 active ingredients and 1,367 targets of Body Pain and Blood Stasis Expelling Tang were obtained through screening; 1,070 targets related to bone metastasis cancer pain; and 280 targets of drug-disease intersection. Among them, IL10, IL6, TNF, IFNG, and IL8 are the key targets for the treatment of bone metastatic cancer pain, mainly involving the signaling pathways of PI3K-Akt, HIF-1, IL-17, apoptosis, and TNF. The molecular docking results showed that curcumin and diosgenin, the active compounds of Body Pain and Blood Stasis Relieving Tang, had high binding ability to IL10 and IFNG. Conclusion: Body Pain and Blood Stasis Relieving Tang can treat bone metastasis cancer pain through the synergistic effect of multi-components, multi-targets and multi-pathways.
1. 引言
骨骼是许多癌症中常见的转移部位，超过30%的肺癌、80%的晚期乳腺癌和前列腺癌患者会发生骨转移[1]。肿瘤在骨骼中生长会导致局部疼痛，并引起高钙血症、病理性骨折、脊髓或其他神经结构压迫症状[2]，骨转移癌痛(Bone-metastatic cancer pain, BMCP)是恶性肿瘤骨转移患者常见的不良表现，其特征是钝痛或者间接性痛，并且随着时间的推移，疼痛逐渐加重，还会出现间歇性、短暂剧烈发作的“爆发痛”，对患者的生活质量产生巨大负面影响[3]。
身痛逐瘀汤源于《医林改错》，学术界目前普遍认为该方剂是在《丹溪心法》中趁痛散的基础上加减而成。方剂包含当归、牛膝、桃仁、红花、川芎、没药、香附、五灵脂、地龙、羌活、秦艽和甘草。该方剂遵循整体调节的原则，采用气血双调，同步补益肝肾，祛邪实的同时扶正气，终达通络化瘀、疏滞定痛之效。当前针对身痛逐瘀汤改善骨转移癌痛的药理机制研究基础薄弱，本研究通过网络药理学与分子对接技术揭示其核心效应成分及作用通路，为经典方剂治疗骨转移癌痛的临床应用提供科学依据。
2. 方法
2.1. 身痛逐瘀汤靶点的收集与筛选
运用中药系统药理数据库与分析平台(TCMSP，网站地址：https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)，按照口服生物利用度 ≥ 30%且药物相似度 ≥ 0.18的准则，对化合物的主要活性成分展开筛选工作。这些成分所对应的靶点借助UniProt数据库完成了标准化处理。还采用中药分子机理生物信息学分析工具(BATMAN-TCM)检索该复方药材的活性成分，置信度分数和可药物化分数保持默认选项，选取对应的已被证明的靶蛋白。
2.2. 疾病基因的获取
在GeneCards (https://www.genecards.org/)数据库中，以“Bone metastasis cancer pain”为关键词进行检索，将相关性评分大于等于1作为标准对疾病靶点进行筛选，同时在Open Targets Platform (https://platform.opentargets.org/)数据库中检索，将上述靶点整合，获取“Bone metastasis cancer pain”关靶点。利用R语言软件的“Venn”包，获取上述两步得到的两组基因的交集，即确定为治疗潜在靶点。
2.3. PPI网络构建
将获得的交集靶点利用STRING平台(https://cn.string-db.org/)，并将物种限定为人类。相互作用阈值设置为高置信度(大于0.9)，同时隐藏网络中孤立的节点，其他参数保持默认，构建疾病靶点蛋白质互作网络图(PPI)。将STRING输出的PPI文件导入Cytoscape 3.8.2软件，并利用MCODE插件进行分析2次分析，得到核心靶点。
2.4. 构建“药物–成分–靶点–疾病”网络
使用CytoScape 3.8.2软件绘制“活性成分–疾病靶点”网络图，并利用该软件中的CytoNCA插件进行拓扑分析，以确定主要活性成分。
2.5. 进行GO和KEGG集分析
利用R语言工具包org.Hs.eg.db和ClusterProfiler对数据进行GO和KEGG富集分析，GO分析覆盖了细胞成分(CC)、生物过程(BP)、分子功能(MF)三个主要方面，并以P < 0.05作为筛选标准，设定最小基因集为10，最大基因集为500，筛选出P值小于0.05。对KEGG富集分析得到的P值最小的20个条目进行可视化。
2.6. 药物主要活性成分核心靶点分子对接验证
利用PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取活性成分的二维结构。随后，借助ChemOffice软件对该结构进行能量优化处理，使其转化为三维的“mol2”格式文件。从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载核心靶蛋白受体的晶体结构，接着使用Pymol软件和AutoDock Tools软件进行预处理，包括去除水分子、添加氢原子等。运行AutoDock Vina进行对接。基于R语言软件，运用ggplot2等程序包绘制构建配体与受体结合能的热图。最后，分子对接结果通过pymol软件进行可视化分析。
3. 结果
3.1. 身痛逐瘀汤活性成分及靶点筛选
经检索，共搜集到267种有效成分，具体为没药73个、地龙20个、桃仁19个、红花17个、香附16个、羌活13个、五灵脂8个、川芎6个、当归2个、秦艽2个、怀牛膝3个、甘草88个。借助UniProt数据库，将靶基因名称进行转换后对重复基因予以剔除，最终确定出1367个药物靶基因。
3.2. 骨转移癌痛靶点整合
以“Bone metastasis cancer pain”为检索词进行检索，收集疾病相关靶点，将2个疾病数据库结果进行归纳，删除重复基因，得到1070个疾病基因。将疾病靶点与活性成分靶点取交集，得到交集靶点280个，见图1。
Figure 1. Venn diagram of drug-disease intersection targets
图1. 药物–疾病交集靶点Venn图
3.3. “中药–活性成分–靶点”网络的绘制
应用Cytoscape3.8.2软件进行调控网络可视化，得到609个节点，2439条边的网络图，如图2所示。利用CytoNCA对网络进行拓扑分析，得到关键有效成分：槲皮素(Quercetin)、熊果酸(Ursolic Acid)、木犀草素(luteolin )、姜黄素(Curcumin)、薯蓣皂苷(Dioscin)。
Figure 2. “TCM-active ingredient-target” network
图2. “中药–活性成分–靶点”网络
3.4. PPI网络构建
将交集得到的靶点输入STRING平台，通过分析得到网络有228个节点和1024条关系边，平均度值11.636，见图3。构建的PPI网络导入Cytoscape3.8.2软件，并利用MCODE插件进行2次分析，得到核心靶点：CXCL10、CXCL8、CCL5、IFNG、CSF3、IL10、CXCL1、TNF、CCL2、IL6、CSF2、CCL3，见图4。
Figure 3. PPI interaction network map of 228 target genes
图3. 228个靶基因的PPI互作网络图
Figure 4. Key genes in the PPI network of target genes
图4. 靶基因的PPI网络中的关键基因
3.5. GO富集分析
由GO富集分析结果可知(P < 0.05)，身痛逐瘀汤干预BMCP的作用靶点涉及的生物过程有2992条，主要为肌肉细胞增殖、髓性白细胞分化、细胞对化学应激的反应、酒精反应、对细菌性分子的反应、对脂多糖的反应等；涉及的细胞组分有53条，主要为Bcl-2家族蛋白复合体、内膜腔、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合体、细胞膜窖、质膜筏、血小板α颗粒腔等；涉及的分子功能有203条，主要为芳香化酶活性、氧化还原酶活性、核受体活性、配体激活的转录因子活性、细胞因子活性、生长因子活性等，见图5。
3.6. KEGG通路富集分析
为了明确身痛逐瘀汤干预BMCP主要涉及的信号通路对治疗靶点进行KEGG通路富集，以P < 0.05作为筛选标准，设定最小基因集为10，最大基因集为500，筛选出P值小于0.05的167条信号通路。对KEGG富集分析得到的P值最小的20个条目进行可视化分析，如图6，主要包括血脂与动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路、前列腺癌、人巨细胞病毒感染、癌症中的蛋白聚糖、乙型肝炎、内分泌抵抗、HIF-1信号通路、丙型肝炎、胰腺癌、IL-17信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、细胞凋亡、TNF信号通路、麻疹、流体剪切应力与动脉粥样硬化、膀胱癌、细胞因子–细胞因子受体相互作用、肝细胞癌、黑色素瘤等。
Figure 5. GO enrichment analysis
图5. GO富集分析
Figure 6. KEGG enrichment analysis
图6. KEGG富集分析
3.7. 分子对接验证
将PPI网络中排名前5位的核心靶点与关键活性成分进行分子对接验证，对接结果见图7。对结合能较强的结果进行可视化，结果见图8。
4. 讨论
传统中医里无“骨转移癌痛”的病名，但根据其临床证候，可将其归属“骨痹”、“骨蚀”等范畴。其核心病机可归属为“不荣则痛和不通则痛”。身痛逐瘀汤以川芎、当归、桃仁、红花为活血化瘀之主药，配伍牛膝、地龙以疏通经络、滑利关节，秦艽、羌活则专攻风湿痹阻之邪，辅以没药、五灵脂、香附行气活血以解滞止痛，甘草调和药性、统摄全方。全方以“化瘀通络”为纲，兼具祛风除湿、行气导滞之效。在临床中，口服身痛逐瘀汤联合常规西医治疗有减毒增效的作用，可有效缓解骨转移癌痛患者的疼痛并且降低西医不良反应发生率[4]。
Figure 7. Molecular docking graph
图7. 分子对接图
姜黄素与IL10
薯蓣皂苷与IL10
姜黄素与IFNG
薯蓣皂苷与IFNG
Figure 8. Molecular docking visualization
图8. 分子对接可视化图
然而，身痛逐瘀汤主要针对骨转移癌痛中的瘀血痹阻经络证。在临床治疗中，也可根据患者具体症状、体征及舌脉等表现，灵活加减身痛逐瘀汤中的药物。伴有肾虚表现者，可加入补肾壮骨的药物，如杜仲、续断等；对于气血不足者，可加黄芪、党参、熟地黄等；寒湿痹阻者，可加干姜、独活、桂枝、制附子等；如患者疼痛剧烈者，可加重活血化瘀药物的剂量，或加入延胡索等加强止痛效果。在制定个体化治疗方案方面，应充分考虑患者的个体差异。例如，对于老年患者，其脏腑功能衰退，气血运行不畅，在使用身痛逐瘀汤时，可适当调整药物剂量，避免峻猛之品，以防伤及正气；而对于年轻患者，其脏腑功能相对旺盛，可适当加大药物剂量，以增强活血化瘀之力。
通过网络药理学分析，我们发现槲皮素、熊果酸、木犀草素、姜黄素、薯蓣皂苷可能是身痛逐瘀汤治疗骨转移癌痛的关键活性成分。槲皮素作为一种类黄酮类物质[5]，展现出抗癌、抗炎、抗氧化、抗病毒以及免疫调节等多方面的药理效能。其抗癌作用或许是由对细胞氧化还原状态的调节以及对自由基的清除所引发的[6]。熊果酸是天然存在的熊烷型五环三萜类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌和抗病毒等多种药理活性[7]，并且以多种途径发挥抗肿瘤功效[8]。木酚素是具有类黄酮结构的天然化合物，同样具备抗肿瘤、抗病毒、抗炎和抗菌等作用。一项研究结果表明，RAW264.7细胞向破骨细胞的分化进程被木酚素激活Wnt/β-catenin通路这一行为所抑制[9]。姜黄素是一种黄酮类化合物，有抗肿瘤、抗炎、预防血管粥样硬化等作用[10]，有研究发现姜黄素可通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进成骨分化，防治骨质疏松的发生发展[11]。薯蓣皂苷属于天然甾体皂苷类化合物[12]，具有抑制肿瘤细胞增殖及诱导凋亡、提高机体免疫能力、改善心血管功能等多种功效[13]，近年研究发现，薯蓣皂苷可通过调控AMPK/mTOR-TFEB通路抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭[14]。
分析PPI网络可知，PPI网络中排名前5位的核心靶点IL10、IL6、TNF、IFNG、IL8是身痛逐瘀汤治疗骨转移癌痛的关键靶点。IL10是一种免疫抑制细胞因子，有调节炎症和免疫环境、减轻神经炎症等作用[15]。IL6是一种介导炎症反应的细胞因子，在肿瘤、免疫、炎症、造血等方面具有重要作用[16]。TNF-α是炎症性细胞因子，有杀伤肿瘤的细胞毒性作用，也参与构成肿瘤发生发展等过程[17]。IFNG是一种促炎细胞因子，具有激活免疫系统中各种细胞的能力[18]。IL-8是具有趋化功能的细胞因子，参与机体感染、炎症反应的发生过程，且与癌症的发病机制密切联系[19]。
KEGG富集分析结果显示，身痛逐瘀汤可利用多通路来减轻骨转移癌疼痛，像PI3K-Akt通路、HIF-1通路、IL-17通路、与细胞凋亡相关的途径以及TNF通路等，这些途径和骨转移癌疼痛的关联极为密切。将核心靶点与关键活性成分进行分子对接，提示身痛逐瘀汤的关键活性成分与骨转移癌痛的关键靶点有着较好的结合活性。对接最稳定的有姜黄素与IL10的结合(−9.3 kcal·mol−1)，薯蓣皂苷与IL10的结合(−9.6 kcal·mol−1)，姜黄素与IFNG的结合(−9.0 kcal·mol−1)，薯蓣皂苷与IFNG的结合(−9.2 kcal·mol−1)。说明身痛逐瘀汤可能起到治疗骨转移癌痛的作用。
综上可知，身痛逐瘀汤是通过多成分、多靶点、多通路的协同作用来治疗骨转移癌痛，为后续研究提供了一定价值的参考依据。不过，本研究同样存在一些不足之处，例如参数设置的主观性可能导致对药物与靶点结合能力的评估不够精准，假阳性结果的可能性也会影响对潜在作用靶点的判断；检索的数据库不够全面，可能存在部分相关数据未被纳入的情况，这在一定程度上影响了对身痛逐瘀汤作用机制的全面剖析；同时，缺乏细胞实验和动物实验验证也是本研究的不足之处，目前尚无法从细胞和动物层面进一步确证身痛逐瘀汤对骨转移癌痛的治疗效果及其具体的作用机制。
NOTES
*通讯作者。