基于荧光硅纳米粒子的pH响应型复合纳米药物载体的制备及其在肿瘤细胞中的应用

Preparation of pH-Responsive Composite Nanodrug Carriers Based on Fluorescent Silicon Nanoparticles and Their Application in Tumor Cells

摘要: 一锅水热法制备的硅纳米粒子(Si NPs)作为荧光载体，介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)为药物载体，制备出了pH响应型复合荧光纳米药物载体(Si NPs-MSNs)，并针对肿瘤细胞进行荧光成像和治疗。利用一系列表征手段，对纳米粒子进行光学性能分析和结构表征。以盐酸阿霉素(DOX)为药物模型，对制备的复合荧光纳米药物载体进行药物吸附性和释放性的考察；通过MTT和细胞成像实验考察纳米载体的生物安全性和成像效果。药物吸附性测试表明，该复合纳米载体的载药率为23.08%，包封率为76.94%。体外药物释放实验表明，该复合纳米载体对pH具有敏感响应。MTT的结果表明制备的复合纳米载体具有较小的细胞毒性，适用于生物应用，同时也证明了负载了DOX的复合纳米药物载体具有杀死肿瘤细胞的作用。肿瘤细胞成像实验表明复合纳米载体在肿瘤细胞中达到良好的荧光成像效果，可用于体外生物成像领域。本研究成功制备了基于荧光Si NPs的pH响应型复合纳米药物载体，以抗肿瘤药物DOX为药物模型，该复合纳米药物载体具有良好的药物装载率和包封率，并且可以实现对肿瘤细胞荧光实时成像和治疗作用。

Abstract: Silicon nanoparticles (Si NPs) prepared by a one-pot hydrothermal method were used as fluorescent carriers, while mesoporous silica nanoparticles (MSNs) were used as drug carriers, pH responsive composite fluorescent nanocarriers (Si NPs-MSNs) were prepared and used for fluorescence imaging and treatment of tumor cells. Using a series of characterization methods to analyze the optical properties and structural characterization of nanomaterials. Using doxorubicin hydrochloride (DOX) as a drug model, the drug adsorption and release properties of the prepared composite fluorescent nano drug carrier were investigated; Investigating the biosafety and imaging effectiveness of nanocarriers through MTT and cell imaging experiments. The drug adsorption test showed that the drug loading rate of the composite nanocarrier was 23.08%, and the encapsulation efficiency was 76.94%. In vitro drug release experiments showed that the composite nanocarrier has a sensitive response to pH. The MTT results indicate that the prepared composite nanocarrier has low cytotoxicity and is suitable for biological applications. It also proves that the composite nanocarrier loaded with DOX has the ability to kill tumor cells. Tumor cell imaging experiments have shown that composite nanocarriers can exhibit good fluorescence imaging effects in tumor cells and can be used in the field of in vitro biological imaging. This study successfully prepared a pH responsive composite nano drug carrier based on fluorescent Si NPs, using the anti-tumor drug DOX as the drug model. The composite nano drug carrier has good drug loading and encapsulation efficiency, and can achieve real-time fluorescence imaging and therapeutic effects on tumor cells.

1. 引言

近年来，硅纳米粒子(Silicon nanoparticles, Si NPs)作为一种新型的环境友好型荧光成像探针得到了广泛的关注[1] [2]。与传统的镉元素系列及铅元素系列的荧光量子点相比，Si NPs具有生物相容性好等优势，凭借其低毒性和优异的光学性质，如荧光发射波长可调、光稳定性好、发光强度高，在传感领域取得了显著的成效，并在生物成像领域展现出了一定的应用潜力[3]-[6]。众所周知，荧光探针的发射波长越长，荧光量子产率越高，探针的组织穿透能力越强，越有利于生物荧光成像[7]-[9]。到目前为止，水热法制备的Si NPs大多发射蓝绿色荧光。最近，Ye [10]等人利用微波辅助合成法在180℃下合成了荧光量子产率为28.8%，发射蓝色荧光的Si NPs，并成功应用于细胞成像；Min [11]的小组利用反应釜提高反应温度，在150℃条件下反应5 h制备了发射黄绿色荧光的Si NPs，并应用于活细胞pH值的可视化；Ma [12]课题组在氮气保护，200℃条件下反应15 min合成了发光强度较高的蓝绿色荧光Si NPs，缩短了反应时间，同时提高了发光强度。但这些合成的Si NPs常在高温高压条件下制得，且对发射波长较短。因此在更加温和的条件下合成荧光发射波长更长且强度相对较高的荧光Si NPs是具有挑战性的工作。

介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)具有比表面积高、孔容积大、易于表面改性和良好生物安全性等优点，常被用做载体对药物进行装载[13]-[16]。其作为载体可通过静电吸附作用或者化学键的作用将药物接枝到孔道的表面和内部，从而实现载药的目的[17]-[19]。因此MSNs是一种良好的药物载体，能够实现药物的装载与释放，使难以被人体直接吸收的药物在人体内缓释从而提高生物利用度[20]。Chang [21]等人利用MSNs对阿霉素进行装载，用于对乳腺癌的治疗；Feng [22]课题组通过对MSNs表面羧基改性提高对抗肿瘤药物的负载率，进一步提高抗肿瘤效果；Rui [23]等人利用MSNs装载抗癌药物甲氨蝶呤合成了一种简单的pH响应性药物控制释放系统。然而，这些研究都只是将MSNs用于肿瘤的治疗，很少有人将MSNs和荧光成像探针结合，尤其是鲜有与Si NPs进行结合，从而实现对肿瘤的成像和治疗双重作用。

本课题是设计利用水热法制备发射黄色荧光的Si NPs，克服Si NPs发射波长短的缺点；同时用溶胶–凝胶法合成MSNs，通过对表面进行功能化改性，再利用偶联剂将Si NPs和MSNs有机结合；以DOX为药物模型制备基于荧光Si NPs的pH响应型复合纳米药物载体；对制备的复合荧光纳米药物载体进行药物装载和释放试验，并验证其生物安全性，同时进行肿瘤细胞荧光成像和治疗，为Si NPs和MSNs在生物领域的进一步应用提供了理论基础和研究思路。

2. 实验部分

2.1. 仪器与试剂

电子天平(BS-224S，赛多利斯科学仪器有限公司)、数控超声波清洗器(JP-040S，深圳市洁盟清洗设备有限公司)；荧光分光光度计(F-4500，日本日立公司)；紫外分光光度计(Lambda 35，PerkinElmer仪器有限公司)；激光粒度测定仪(ZEN-3690，英国马尔文有限公司)；透射电子显微镜(JEM-2800F，日本电子株式会社)；场发射扫描电子显微镜(Scios，FEI捷克有限公司)；X-射线衍射仪(D8 Advance，Bruker公司)；傅立叶红外光谱仪(Spectrum Two，PerkinElmer仪器有限公司)。

3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)、邻氨基苯酚、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和盐酸阿霉素(DOX)购自上海阿拉丁生化科技有限公司。正硅酸四乙酯(TEOS)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购自上海国药集团试剂有限公司，无水乙醇购自天津市津东天正精密化学试剂厂。氢氧化钠(NaOH)、氯化钠(NaCl)和氨水购自天津永大化学试剂有限公司。戊二酸酐(GA)、无水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄₎和无水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)购自上海麦克林生化科技有限公司。实验室制备去离子水并用于所有实验。所有试剂均为分析级，无需纯化可直接使用。

2.2. 荧光Si NPs的制备

将10 mL的去离子水加入25 mL烧瓶中，再加入精确称取的10 mg邻氨基苯酚。室温下搅拌(1200 r/min) 20 min，得到混合均匀的溶液。将2 mL的N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)缓慢滴加到该溶液中，然后将反应温度升高至110℃反应(油浴)反应20 min后，待烧瓶中液体温度降至室温后取出，得到橙黄色Si NPs溶液。将Si NPs溶液装入分子截留量为1000的透析袋中透析12 h后(每4 h换一次水)，得到纯化后的Si NPs溶液。将其储存在4℃冰箱中备用。此外，将一部分纯化的Si NPs溶液冷冻干燥得固体，用于后续表征。

2.3. 功能化介孔二氧化硅纳米粒子的制备

2.3.1. 介孔二氧化硅纳米粒子的制备

首先量取188 mL的去离子水和52 mL的无水乙醇加入到500 mL的烧瓶中，精密称量0.5 g的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，将其充分分散在烧瓶中，在40℃下搅拌(300 r/min)直至CTAB完全溶解；然后加入1.75 mL的2 mol/L的NaOH溶液；最后缓慢的滴加2.5 mL的正硅酸四乙酯(TEOS)。将该混合溶液在40℃下搅拌2 h后取出离心，用去离子水冲洗3次，放入电鼓风干燥箱中100℃下干燥12 h。将干燥后的白色粉末放在马弗炉里550℃下煅烧5 h以除去模板剂CTAB，得到介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)。

2.3.2. 氨基化介孔二氧化硅纳米粒子的制备

精密称取0.5 g MSNs加入到150 mL无水乙醇中，超声使其充分分散后，加入1 mL的3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)在40℃下连续搅拌24 h。离心后用无水乙醇洗3次除去未反应的APTES，放入真空干燥箱中40℃下干燥12 h，得到氨基化介孔二氧化硅纳米粒子(NH₂-MSNs)。

2.3.3. 羧基化介孔二氧化硅纳米粒子的制备

精密称取0.4 g的NH₂-MSNs加入到200 mL乙醇溶液中，超声使其充分分散后，加入1.2 g GA在37℃下连续搅拌3 h。离心后用0.1 mol/L的NaCl溶液(0.1 mol/L)洗涤除去未反应的GA，冷冻干燥得到羧基化介孔二氧化硅纳米粒子(COOH-MSNs)。

2.4. 基于荧光Si NPs的复合纳米载体的制备

首先量取45 mL的去离子水(pH = 5.0)于100 mL的单口烧瓶中，加入0.1 g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.15 g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)搅拌5 min，然后加入0.15 g的COOH-MSNs继续搅拌30 min活化MSNs表面的羧基，最后将20 mL纯化后的Si NPs溶液加入到该体系中，室温(25℃)下避光搅拌24 h。冷冻干燥得到复合荧光纳米药物载体(Si NPs-MSNs)。

2.5. 复合荧光纳米药物载体(Si NPs-MSNs)的药物吸附性能测试

DOX的装载采用浸渍法。取药物和载体比例分别为1/10、3/10、5/10、7/10和10/10，用PBS配制对应浓度的DOX溶液。按比例精密称取Si NPs-MSNs加入到对应的DOX溶液中，室温条件下避光缓慢搅拌24 h后，离心取上清液5 mL定容于25 mL的容量瓶中，通过紫外可见分光光度法在480 nm下对溶液进行检测，测定溶液中DOX的剩余质量浓度，根据标准曲线对载药率和包封率进行计算。

$LC\left(\%\right)=\frac{m_0-m_1}{m_2}\times 100$ (1)

$EE\left(\%\right)=\frac{m_0-m_1}{m_0}\times 100$ (2)

式中：

LC——载药率；

EE——包封率；

m₀——溶液中DOX的初始量，g；

m₁——平衡时溶液中DOX的量，g；

m₂——纳米载体的量，g。

2.6. 体外药物释放实验

用无水磷酸二氢钠和无水磷酸氢二钠配制pH值分别为7.4、6.5和5.0的PBS缓冲液。首先精确称取三份0.01 g冻干后的DOX@Si NPs-MSNs放于分子截留量为14000的透析袋中，然后各加入不同PBS缓冲液3 mL，分别置于30 mL的pH = 7.4、pH = 6.5、pH = 5.0的PBS缓冲液中进行体外药物释放，于37℃持续搅拌，每隔一段时间(1.0, 2.0, 3.5, 5.0, 6.5, 8.0, 12.0, 24.0, 48.0, 72.0, 96.0 h)取出4 mL液体，同时补加4 mL的原pH值的PBS缓冲液，以保持溶液的总体积不变。用紫外可见分光光度计在DOX的最大吸收波长480 nm处对取出的液体进行吸光度值的测定，绘制DOX累计释放率与时间的曲线，以观察其释药特性。

$C_r\left(\%\right)=\frac{V_i{\displaystyle {\sum }_1^{n-1}{C}_i+V_0{C}_n}}{m_0}\times 100$ (3)

式中：

C_r——药物累积释药率；

V_i——补加液PBS的体积，mL；

n——取样的次数；

C_i——之前所取释放液中DOX的浓度，mg/L；

V₀——整个释放体系的体积，mL；

C_n——所取释放溶液中DOX的浓度，mg/L；

m₀——载体中药物的质量，mg。

2.7. 复合纳米载体的体外溶血性实验

2.7.1. 2%红细胞混悬液的配制

首先收集新鲜的SD雄性大鼠的血液5 mL到抗凝管中，加入适量的生理盐水后转移到离心管中，在4℃条件下低速离心，弃去上清液后向离心管中再加入适量生理盐水混合均匀后离心，经多次洗涤至上清液变得无色透明。最后吸取0.5 mL的红细胞加入24.5 mL生理盐水中配置成2%的红细胞悬液。

2.7.2. 溶血实验

称取复合荧光纳米药物载体粉末，用0.9%的生理盐水配制成浓度分别为0.05、0.25、0.5、0.75和1 mg/mL的混悬液，取2 mL的混悬液分别与2 mL的2%的红细胞悬液(实验组)、生理盐水(阴性对照组)和去离子水(阳性对照组)充分混合均匀，在37℃条件下震荡1 h后，在4℃下低速离心，取上清液在541 nm下测样品、阴性对照组和阳性对照组的吸光度，根据公式(4)计算溶血率(HR)：

$HR\left(\text{\%}\right)=\frac{A_{\text{sample}}-A_{\text{negative}}}{A_{\text{positive}}-A_{\text{negative}}}\times 100\%$ (4)

式中：

A_sample——实验组上清液的吸光度；

A_negative——阴性对照组上清液的吸光度；

A_positive——阳性对照组上清液的吸光度。

2.8. 体外细胞毒性测定

取对数期生长的细胞将其稀释，并以每孔100 μL且含有5 × 10³个细胞的量接种到96孔板中，没有用到的孔加入等量无菌PBS，放入培养箱中培养24 h,再加入100 μL不同浓度(4、8、16、32、64、128、200 μg/mL)用空白培养基稀释的纳米药物载体混悬液，并设有空白组和对照组，每个浓度设置5个复孔。继续放入培养箱中培养24 h后，用新鲜的PBS溶液冲洗，每孔加入100 μL空白培养基和20 μL 5mg/mL MTT溶液，继续培养4 h，移除培养液后在每孔中加入150 μL的DMSO，振荡4 min，用酶标仪在490 nm测定样品的OD值。按照公式(5)计算细胞存活率(CVR)：

$细胞存活率\left(\text{\%}\right)=\frac{O{D}_n-O{D}_0}{O{D}_a-O{D}_0}\times 100$ (5)

式中：

OD_n——实验组的吸光度值；

OD_a——对照组的吸光度值；

OD₀——空白组的吸光度值。

2.9. 体外细胞成像实验

取对数期生长的HepG2细胞将其稀释，并以每孔500 μL且含有4 × 10⁴个细胞的量接种到24孔板中(24孔板加入了提前消毒好的玻片)，没有用到的孔加入等量无菌PBS，放入培养箱中培养24 h后，再加入300 μL不同浓度(50、100、150、200 μg/mL)用空白培养基稀释的纳米药物载体混悬液，并设置空白组，继续放入培养箱培养12 h；固定纳米药物载体混悬液的浓度为200 μg/mL，培养时间分别为3、6、9、12 h，同样设置空白组，进行培养。培养结束后对细胞进行DAPI染色，在荧光倒置显微镜下观察荧光成像情况。

3. 结果与讨论

3.1. Si NPs的合成与表征

3.1.1. Si NPs的合成

图1是通过水热法制备黄色荧光Si NPs的示意图。

Figure 1. Schematic diagram of Si NPs prepared by hydrothermal method

图1. 水热法制备Si NPs的示意图

3.1.2. Si NPs合成条件优化

利用单一变量法，通过改变反应物剂量、反应时间和温度对 Si NPs的合成条件进行优化。由图2可以得到最佳的反应条件。由图2(a)可以看出，固定硅源DAMO的用量为2 mL，还原剂邻氨基苯酚的用量从5 mg增大到50 mg的过程中，当邻氨基苯酚的用量为10 mg时，合成的Si NPs的荧光强度较强，且荧光发射波长较长；由图2(b)可以看出，当反应时间从10 min逐渐增大到35 min的过程中，当反应时间为20 min时，合成的Si NPs的荧光强度最大；由图2(c)可以看出，当反应温度从90℃增大到140℃的过程中，当反应温度为110℃时，合成的Si NPs的荧光强度最大。因此Si NPs的最佳合成条件为固定硅源DAMO的用量为2 mL，还原剂邻氨基苯酚的用量为10 mg，反应时间和反应温度分别为20 min和110℃。

Figure 2. Optimization of conditions for synthesizing Si NPs

图2. 合成Si NPs的条件优化

3.1.3. Si NPs的光学性质

图3中的曲线a是Si NPs的激发光谱，曲线b是其荧光发射光谱，从谱图可见，合成的Si NPs的最佳激发波长为450 nm，最佳发射波长为580 nm。由图3中的插图可以看到，将合成的Si NPs溶液放在紫外灯下照射，合成的Si NPs溶液发射黄色荧光，与其发射波长是一致的。

Figure 3. The optimal excitation spectrum (curve a) and emission spectrum (curve b) of Si NPs. Illustration: Luminescence of Si NPs solution under UV light irradiation

图3. Si NPs的最佳激发光谱图(曲线a)与最佳发射光谱图(曲线b)。插图：Si NPs溶液在紫外灯照射下的发光图

3.1.4. Si NPs的结构表征

对合成的Si NPs进行了粒径表征。图4(a)为Si NPs的透射电镜图(TEM)。通过TEM可以看出，合成的Si NPs呈球形，且分散性良好。为了进一步分析Si NPs的粒径，我们对合成的Si NPs进行了动态光散射分析，由图4(b)可知，Si NPs的平均粒径为2.3 nm。图4(c)是Si NPs的红外光谱图，图中1096 cm⁻¹和1013 cm⁻¹对应Si-O-Si的伸缩振动；3279 cm⁻¹处的峰对应N-H键的伸缩振动峰；在2932 cm⁻¹和1459 cm⁻¹分别与不饱和C-H伸缩振动和弯曲振动相关；1590 cm⁻1和761 cm⁻¹分别对应N-H弯曲和摇摆振动；在1348 cm⁻¹弱吸收带是C-N的伸缩振动[24] [25]。以上结果表明，合成的Si NPs富含氨基。

Figure 4. Structural characterization of Si NPs. (a) TEM image, (b) particle size analysis, (c) FT-IR spectrum

图4. Si NPs的结构表征。(a) TEM图，(b) 粒径分析，(c) FT-IR谱图

3.2. MSNs的结构表征

图5(a)，图5(b)分别为MSNs的TEM和SEM图。由TEM图可以看出MSNs具有蠕虫状的孔道结构，说明MSNs的成功合成，其粒径为200 nm。由SEM图可以看出MSNs在大尺度上是均匀分散且大小均一的球形纳米颗粒。图5(c)为MSNs的小角XRD衍射谱图。可以观察到MSNs在2θ为2.5˚左右时，具有明显的衍射峰，此衍射峰证明样品内存在高度均匀的介孔结构[26] [27]。图5(d)中的黑色、红色和蓝色曲线分别是MSNs、NH₂-MSNs和COOH-MSNs的红外光谱图，黑色曲线中1045 cm⁻¹和440 cm⁻¹处对应Si-O-Si的不对称伸缩和弯曲振动峰，3748 cm ⁻¹处对应Si-OH的特征峰[28] [29]；由红色曲线可以看到3748 cm⁻¹处Si-OH的特征峰消失了，在1635 cm⁻¹处出现N-H的伸缩振动峰，在2980 cm⁻¹处出现C-H的对称伸缩振动峰[30]-[32]，说明氨基成功接枝到介孔二氧化硅纳米粒子表面上；由蓝色曲线可以看到出现的1714 cm⁻¹是C=O伸缩振动、1635 cm ⁻¹羧基C-O变形振动和1408 cm⁻¹处O-H面内变形振动[33]，说明MSNs的羧基改性成功。

Figure 5. Structural characterization of MSNs. (a) Small angle XRD spectra, (b) TEM and SEM images, (c) FT-IR image of the nanocarriers

图5. MSNs的结构表征。(a) 小角XRD谱图，(b) TEM和SEM图，(c) 纳米载体的FT-IR图

3.3. Si NPs-MSNs的制备和结构表征

3.3.1. Si NPs-MSNs的制备和DOX的装载

图6是Si NPs和COOH-MSNs在偶联剂的作用下发生偶联反应及DOX的装载示意图。

Figure 6. Schematic diagram of the preparation of Si NPs MSNs and DOX loading

图6. Si NPs-MSNs的制备和DOX的装载示意图

3.3.2. Si NPs-MSNs的结构表征

图7(a)为MSNs和Si NPs-MSNs的小角XRD衍射图谱。黑色曲线是MSNs的XRD衍射，红色曲线是Si NPs-MSNs的XRD衍射，仍能观察到2θ为2.5˚左右具有明显的衍射峰，说明复合后的纳米药物载体内依旧存在高度均匀的介孔结构。图7(b)中黑色、红色和蓝色曲线分别是COOH-MSNs、Si NPs和Si NPs-MSNs的红外光谱图。蓝色曲线中1635 cm⁻¹和3382 cm⁻¹处出现N-H的伸缩振动峰；1548 cm⁻¹ C-O变形振动，Si NPs与COOH-MSNs反应后，在复合纳米药物载体中形成了O=C-N键，且合成的复合纳米药物载体表面有大量氨基[34]，证明Si NPs成功偶联到了MSNs上面，制备得到了复合纳米药物载体Si NPs-MSNs。

Figure 7. (a) Small angle XRD spectra of MSNs and Si NPs MSNs, (b) FT-IR plots of Si NPs-MSNs

图7. (a) MSNs和Si NPs-MSNs的小角XRD图谱，(b) Si NPs-MSNs的FT-IR图

3.4. Si NPs-MSNs的药物装载

由图8(a)的全波长(200~800 nm)扫描可知DOX的最大吸收波长为480 nm，在480 nm下测得DOX浓度与吸光度的对应关系，对所得数据进行拟合得到DOX的标准曲线，结果如图8(b)所示，其中A为吸光度；C为DOX的质量浓度；R²为相关系数。结果表明，在浓度15~40 mg/L范围内，DOX的浓度与吸光度呈现良好的线性关系。

Figure 8. (a) UV Wavelength Scan of DOX, (b) Standard curve plot for DOX

图8. (a) DOX的紫外波长扫描图 DOX的标准曲线绘制，(b) DOX的标准曲线图

通过紫外可见分光光度法在480 nm下对溶液进行检测，测定溶液中DOX的剩余质量浓度。由表1可知，DOX通过浸渍24 h后，最佳的药物/载体质量比为3/10，由式(1)、式(2)计算得出纳米药物载体的载药率和包封率分别为23.08%和76.94%。

Table 1. Effect of different drug/carrier mass ratios on drug loading and encapsulation rates

表1. 不同的药物/载体质量比对载药率和包封率的影响

不同药物/载体质量比	载药率	包封率
1/10	14.93%	48.16%
3/10	23.08%	76.94%
5/10	28.58%	57.16%
7/10	20.78%	66.59%
10/10	21.17%	60.71%

3.5. 体外药物释放实验

由于肿瘤细胞部位的值比正常组织细胞的pH值低，细胞内涵体和溶酶体的pH值在5.0~6.5之间，因此本研究考察了不同pH值下Si NPs-MSNs的体外药物释放性能。由图9可知在pH为7.4的PBS缓冲溶液中，Si NPs-MSNs的药物释放速度较慢，累计释放率为44.92%；当在pH为6.5的PBS缓冲溶液中，药物累计释放率可达50.54%；随着pH的降低药物累计释放率有所提升，当在pH为5.0的PBS缓冲溶液中，药物累计释放率可达73.46%。由此可见，随着pH的降低，促进了药物的释放。这是由于在酸性介质中，静电吸引力被破坏[35] [36]，导致DOX从Si NPs-MSNs的孔隙中释放出来。因此制备的Si NPs-MSNs具有pH响应性，这种特性能更好的使滞留在组织细胞的药物快速释放发挥肿瘤抑制作用。

Figure 9. Release profiles of Si NPs-MSNs at different pH. (a) pH = 7.4; (b) pH = 6.5; (c) pH = 5.0

图9. 不同pH下Si NPs-MSNs的释药曲线图。(a) pH = 7.4；(b) pH = 6.5；(c) pH = 5.0

3.6. 体外溶血和细胞毒性实验

为了评估复合纳米药物载体的生物安全性，进行了体外溶血实验。根据规定，所制备的材料的溶血率低于2%时，材料为可视为无毒；溶血率在2%~5%之间时，材料的毒性较低；当溶血百分比大于5%时，毒性较高，不适合进行生物应用。图10(a)是复合纳米药物载体溶血率，可以看出当复合纳米药物载体浓度在0.05~1 mg/mL范围内，溶血率均低于5%，说明该复合纳米药物载体具有较好的生物相容性。MTT法检测纳米药物载体(MSNs)、复合纳米药物载体(Si NPs-MSNs)和装载了DOX的复合纳米药物载体(DOX@Si NPs-MSNs)对HepG2细胞的细胞毒性。如图10(b)所示，细胞存活率在每个时间点均显示出剂量依赖性。MSNs组和Si NPs-MSNs组与对照组相比，在浓度达到200 μg/mL时，细胞的存活率均在90%以上，说明在0~200 μg/mL浓度范围内MSNs和Si NPs-MSNs的细胞毒性较小，生物安全性良好。与血液相容性实验结果一致，证明纳米药物载体有较好的生物相容性。

Figure 10. (a) Haemolysis rate analysis of composite nanodrug carriers; (b) Relative survival of nanocarriers after 24 h of co-culture with cells

图10. (a) 复合纳米药物载体的溶血率分析图；(b)纳米载体与细胞共同培养的24 h后的相对存活率

通过图10(b)，可以看到DOX@Si NPs-MSNs组与MSNs组和Si NPs-MSNs组相比细胞存活率明显下降，证明DOX@Si NPs-MSNs对HepG2细胞有杀伤作用。这也证明了我们制备的装载了DOX的复合纳米药物载体对HepG2细胞有治疗作用。为了进一步证明DOX @Si NPs-MSNs对HepG2细胞治疗效果，我们进行了对比实验。如图11所示，在保证所含DOX浓度相同的情况下，用不同浓度梯度的游离

Figure 11. Relative survival of DOX and DOX-loaded composite nanocarriers after 24 h of co-culture with cells

图11. DOX和载DOX的复合纳米载体与细胞共同培养的24 h后的相对存活率

DOX和DOX@Si NPs-MSNs分别去培养细胞，发现随着DOX浓度增大，细胞存活率逐渐下降，并且两者的存活率下降程度基本一致。进一步证明了DOX @Si NPs-MSNs对HepG2细胞有杀伤作用，具有对肿瘤细胞进行治疗的潜力。

3.7. 体外细胞成像实验

为了验证Si NPs-MSNs的荧光成像效果，我们用Si NPs-MSNs对HepG2细胞进行孵育12 h后观察细胞形态。在用不同浓度的Si NPs-MSNs孵育12 h后，如图12所示并没有发现细胞形状的明显变化，说明了Si NPs-MSNs具有较小的细胞毒性。在HepG2细胞成像中，如图12(a)~(e)，在Si NPs-MSNs实验组中的细胞在480 nm激发光照射下显示出黄色荧光，并且随着剂量的增加荧光信号呈依赖性模式增强。Si NPs-MSNs荧光成像图和DAPI染色后的细胞核荧光成像图合并后，如图12(a’’)~(e’’)所示，可以看出Si NPs-MSNs成功进入HepG2细胞中，并主要集中位于细胞核周围的细胞质中。

Figure 12. Fluorescence photographs of HepG2 cells after incubation in DMEM medium containing 0, 50, 100, 150 and 200 μg/mL of Si NPs-MSNs for 12 h. Yellow fluorescence photographs of Si NPs-MSNs in HepG2 cells (a)~(e), blue fluorescence photographs of nuclei stained with DAPI (a’)~(e’) and merged images (a”)~(e”). Scale bar: 100 μm

图12. HepG2细胞在含0、50、100、150和200 μg/mL的Si NPs-MSNs的DMEM培养基中孵育12 h后的荧光照片。HepG2细胞中Si NPs-MSNs的黄色荧光照片(a)~(e)、用DAPI染色的细胞核的蓝色荧光照片(a’)~(e’)和合并的图像(a”)~(e”)。比例尺：100 μm

我们又继续用浓度为200 μg/mL的Si NPs-MSNs混悬液对HepG2细胞进行不同时间的孵育。从图13可以看出在不同孵育时间(3、6、9和12 h)下，随着孵育时间的增加，进入细胞质中的Si NPs-MSNs逐渐增多，荧光亮度逐渐增强。这些结果不仅说明了Si NPs-MSNs的低毒性，而且还证明了Si NPs-MSNs可以通过内吞作用逐渐进入细胞中。结合细胞存活率实验的结果，可以看到Si NPs-MSNs在HepG2细胞中可以呈现出良好的荧光成像效果，证明我们制备的Si NPs-MSNs可用于体外生物成像。

Figure 13. Fluorescence photographs of 200 μg /mL Si NPs-MSNs suspension after co-incubation with HepG2 cells at different time points (3, 6, 9, and 12 h). yellow fluorescence photographs of Si NPs-MSNs (a)~(e), blue fluorescence photographs of nuclei stained with DAPI (a’)~(e’), and their merged images (a”)~(e”). Scale bar: 100 μm

图13. 200 μg /mL Si NPs-MSNs混悬液与HepG2细胞共孵育后不同时间点(3、6、9和12 h)的荧光照片。Si NPs-MSNs的黄色荧光照片(a)~(e)，用DAPI染色的核的蓝色荧光照片(a’)~(e’)，以及它们的合并图像(a”)~(e”)。比例尺：100 μm

4. 结论

采用水热法制备出能够发射黄色荧光的Si NPs，采用溶胶－凝胶法合成介孔二氧化硅纳米粒子；将Si NPs和功能化MSNs连接，制备出基于Si NPs的pH响应型复合纳米药物载体Si NPs-MSNs。选用盐酸阿霉素(DOX)作为药物模型研究了Si NPs-MSNs的载药和释药行为。结果表明，该pH响应型复合纳米药物载体的载药率和包封率较高，并且在模拟肿瘤组织环境下的释药速率明显快于在正常组织环境下的释药速率，对肿瘤的荧光成像和治疗有着潜在的应用价值。MTT和体外HepG2细胞成像实验，不仅说明了Si NPs-MSNs的低毒性，以及装载药物后对肿瘤细胞的杀伤作用，而且还证明了Si NPs-MSNs可以进入细胞呈现出良好的荧光成像效果，因此我们制备的Si NPs-MSNs具有对肿瘤细胞进行诊断和治疗的潜力。该研究为制备长波长荧光发射Si NPs提供了理论方法，并且为Si NPs在活体内进行荧光成像提供了可能性，同时为MSNs在生物领域的进一步应用提供了理论基础和研究思路。

致 谢

感谢河北省自然科学基金青年基金项目(nos B2024209021)和河北省教育厅科学研究项目——河北省省属高校基本科研业务费研究项目(JQN2021036)对本研究提供的资助。

基金项目

河北省自然科学基金青年基金项目(nos B2024209021)，河北省教育厅科技项目–河北省省属高校基本科研业务费研究项目(JQN2021036)。

NOTES

^*共同第一作者。

^#通讯作者。