1. 引言
复方五指柑胶囊(Compound wuzhigan capsules)主要成分为五指柑、功劳木、山芝麻、岗梅，为丽珠集团利民制药厂独家中药复方制剂，临床上可用于治疗急性胃肠炎[1]和风热感冒[2]。原质量标准为注册标准，仅有性状、鉴别(显微)、胶囊剂的常规检查等检查项目，而含量测定项仅对功劳木中的盐酸小檗碱进行测定。为了全面提高该产品的质量评估，本研究运用超高效液相色谱技术建立了复方五指柑胶囊的UPLC指纹图谱，为复方五指柑胶囊的质量控制提供了科学的方法依据。
中药指纹图谱技术是一种包含高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、质谱法(MS)等先进分析方法的现代分析技术，其构建的中药材化学指纹图谱不仅能够反映样品的整体化学成分，还能够展示各成分的含量和相对比例，为质量控制提供详细的化学指纹，实现对中药材的快速、精准检测[3]。高效液相色谱法(HPLC)现已被广泛应用于中药的指纹图谱检测分析，而近年来，超高效液相色谱(UPLC)在中药研究领域发展迅速[4]。UPLC与传统HPLC相比，表现出更高的分离度和灵敏度[5]，常用于中药材、复方制剂及饮片的质量控制：李璐[6]等人利用UPLC技术建立鹅不食草配方颗粒指纹图谱；骆艺珠[7]等人运用UPLC色谱法建立玉女煎基准样品指纹图谱分析方法；曾雪蔚[8]等人采用超高效液相色谱法，建立六味安消胶囊的指纹图谱及10种有效成分的含量测定方法。本研究在借鉴中药相关文献中含量测定、成分分析、指纹图谱[9]-[12]等方法的基础上，运用超高效液相色谱技术构建了复方五指柑胶囊的UPLC指纹图谱，并对图谱中的共有峰进行了归属分析以及成分鉴定，旨在为建立一个系统、完善且简便快捷的质量评价方法提供数据支持。
2. 材料
2.1. 试药
单味药材提取物与复方五指柑胶囊均为自制。复方五指柑胶囊共21批，批号分别为XS-220702~XS-220719、XS-240627、XS-240701、XS-240702。对照品与试剂信息见表1。
Table 1.Reagents used in the experiment and their manufacturers
表1. 实验使用试剂及其厂家
试剂 |
厂家 |
纯度 |
批号 |
功劳木对照提取物 |
中国食品药品检定研究院 |
含非洲防己碱(C20H21NO4) 2.5%，药根碱(C20H20NO4) 11.7%，巴马汀(C21H21NO4) 12.5%，小檗碱(C20H17NO4) 6.7% |
610011-201501 |
盐酸药根碱 |
中国食品药品检定研究院 |
90.3% |
110733-202110 |
盐酸小檗碱 |
中国食品药品检定研究院 |
85.9% |
110713-202316 |
盐酸巴马汀 |
中国食品药品检定研究院 |
85.7% |
110732-201913 |
异荭草苷 |
南京景竹生物科技有限公司 |
99.67% |
JZ22021709 |
甲醇 |
Honeywell公司 |
色谱纯 |
W3SG1H |
乙腈 |
Honeywell公司 |
色谱纯 |
Y4RA1H |
甲酸 |
默克公司 |
分析级 |
K43228664210 |
2.2. 仪器
超高效液相色谱仪(ACQUTIY UPLC H-Class PLUS, Waters)；电子天平(XS105DU, METTLER TOLEDO)；超纯水机(Milli-Q Reference A+, Merck KGaA)；超声波清洗器(CQ-6，上海沪超超声波仪器有限公司)。
3. 方法与结果
3.1. 色谱条件
色谱柱：Luna Omega C18 (2.1 mm × 100 mm, 1.6 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)，进行梯度洗脱(0~1.4 min, 10% → 19% A; 1.4~5 min, 12% → 19% A; 5~8.3 min, 19% → 23% A; 8.3~9.7 min，23% → 26% A; 9.7~12.5 min, 26% → 51% A)；流速为0.3 mL·min−1；检测波长为254 nm；柱温为25℃；进样量：0.8 μL。
3.2. 溶液制备
3.2.1. 对照品溶液制备
以甲醇为溶剂，分别配制0.1 mg·mL−1异荭草苷对照溶液、0.05 mg·mL−1的盐酸药根碱对照溶液、0.05 mg·mL−1的盐酸小檗碱对照溶液、0.4 mg·mL−1的功劳木对照提取物溶液、0.05 mg·mL−1的盐酸巴马汀对照溶液。
对照品溶液的配制见下图1。
Figure 1. Flow chart of preparations of reference solution
图1. 对照品溶液的配制流程图
3.2.2. 单味药材提取物溶液制备
称取单味药材提取物适量，置于50 mL量瓶中，加入甲醇适量，超声10 min，待冷却至室温，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，滤过，即得。
3.2.3. 供试品溶液制备
称取复方五指柑胶囊内容物适量，置于25 mL量瓶中，加入甲醇适量，超声10 min，待冷却至室温，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，滤过，即得。
3.3. 方法学考察
3.3.1. 标准图谱模拟
取15批样品(批号为：XS-220705~XS-220719)，依照“3.2.3”部分所述方法制备供试品溶液，并在“3.1”规定的色谱条件下进行测定。随后，将获得的图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”中，进行标准图谱的模拟。
3.3.2. 共有峰归属及成分分析试验
按“3.2.1”“3.2.2”方法制备对照品溶液单味药材提取物溶液各1份，在“3.1”色谱条件下，每份样品进样1次，记录色谱图。
3.3.3. 精密度试验
按“3.2.3”方法制备供试品溶液1份，在“3.1”色谱条件下，连续进样6次，记录色谱图。
3.3.4. 重复性试验
取6份同一批次样品，按“3.2.3”方法制备供试品溶液，在“3.1”色谱条件下，每份样品进样1次，记录色谱图。
3.3.5. 稳定性试验
按“3.2.3”方法制备供试品溶液1份，在“3.1”色谱条件下，并分别于0 h，2 h，3 h，4 h，7 h，12 h，24 h，48 h测定，记录色谱图。
3.3.6. 耐用性试验
取1份样品，按“3.2.3”制备供试品溶液，在“3.1”色谱条件下，分别采用不同流速(0.25 mL∙min−1和0.35 mL·min−1)进行测定，将图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”计算相似度。
3.3.7. 样品检测
取5批样品(批号为：XS-220701、XS-220702、XS-220703、XS-220704、XS-240627)，按“3.2.3”方法制备供试品溶液，在“3.1”色谱条件下进行测定，记录色谱图。
3.4. 结果
3.4.1. 标准图谱的模拟
将“3.3.1”试验中获得的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，以S1 (批号：XS-220705)的批次样品图谱作为参考图谱，剪切2 min~17 min色谱图，识别出10个共有峰，并设定时间窗口宽度为0.1。采用平均数法，经过多点校正和自动匹配后，生成对照图谱(图2)，15批样品叠加图谱(图3)。将15批样品图谱与对照图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行相似度计算，以盐酸巴马汀作为参照峰S，计算得出的相似度均超过0.99，详细结果参见表2。
3.4.2. 共有峰归属及成分分析
复方五指柑胶囊由五指柑、功劳木、岗梅、山芝麻等4味药材组成。将复方五指柑胶囊样品与单味药材色谱图进行比对(图4)，分析共有峰来源，见图4。通过对比可得，来源于五指柑药材的峰有1、2、4；来源功劳木药材的特征峰有3、6、7、9、10；来源于山芝麻药材的特征峰有5、8。同时通过与对照品色谱图比对(图5)，可知峰4为异荭草苷，峰7为盐酸药根碱，峰9为盐酸巴马汀，峰10为盐酸小檗碱。
3.4.3. 精密度试验结果分析
“3.3.3”精密度试验谱图与标准图谱相似度均在0.99以上，主要共有峰保留时间在0.09%~1.39%
Figure 2. Comparative chromatogram
图2. 对照图谱
Figure 3. UPLC chromatograms of 15 batches of samples
图3. 15批样品UPLC图谱
Table 2. Similarity of 15 batches of samples
表2. 15批样品相似度
批号 |
相似度 |
批号 |
相似度 |
批号 |
相似度 |
XS-220705 |
0.999 |
XS-220710 |
1.000 |
XS-220715 |
0.996 |
XS-220706 |
1.000 |
XS-220711 |
1.000 |
XS-220716 |
0.998 |
XS-220707 |
1.000 |
XS-220712 |
1.000 |
XS-220717 |
0.999 |
XS-220708 |
1.000 |
XS-220713 |
1.000 |
XS-220718 |
1.000 |
XS-220709 |
1.000 |
XS-220714 |
0.999 |
XS-220719 |
1.000 |
Figure 4. UPLC chromatograms of samples and single herbs
图4. 样品、单味药材UPLC色谱图
Figure 5. UPLC chromatograms of samples and comparisons
图5. 样品、对照品UPLC色谱图
之间，RSD < 10%，方法精密度良好。
3.4.4. 重复性试验结果分析
“3.3.4”重复性试验谱图与标准图谱相似度均在0.99以上，主要共有峰保留时间在0.44%~1.47%之间，RSD < 10%，方法重复性良好。
3.4.5. 稳定性试验结果分析
“3.3.5”稳定性试验谱图与标准图谱相似度均在0.99以上，主要共有峰保留时间在0.38%~6.60%之间，RSD < 10%，供试品溶液在48 h内稳定性良好。
3.4.6. 耐用性试验结果分析
“3.3.6”耐用性试验谱图与标准图谱相似度均在0.99以上，耐用性良好。
3.4.7. 样品相似度
将“3.3.7”所得图谱与对照图谱(见图1)导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”计算相似度(结果见表3)，5批样品相似度均在0.99以上。
Table 3. Similarity of 5 batches of samples
表3. 5批样品相似度
批号 |
相似度 |
批号 |
相似度 |
XS-220701 |
0.998 |
XS-220704 |
0.999 |
XS-220702 |
0.999 |
XS-240627 |
0.997 |
XS-220703 |
0.998 |
|
|
4. 讨论
4.1. 检测波长选择
本研究采用PDA检测器在200~400 nm波长范围内进行扫描，通过比较研究210 nm、254 nm、347 nm波长下的色谱峰个数、分离度、峰型，结果显示在254 nm波长下的色谱图各色谱峰分离效果及形状较好，共有峰个数更多，基线平稳，因此选择其作为检测波长。
4.2. 流动相的选择
在复方五指柑胶囊中，盐酸小檗碱的含量测定采用了乙腈作为有机分离溶剂。本研究进一步验证了乙腈同样适用于五指柑、岗梅、山芝麻和功劳木药材中主要成分的UPLC分离。至于水相溶剂，本研究对比了0.1%和0.5%甲酸溶液作为流动相的效果，发现0.1%甲酸溶液的分离效果更佳，因此优选0.1%甲酸溶液作为水相。通过优化流动相比例的研究，最终确定了“3.1”项下的梯度洗脱条件。
4.3. 色谱柱选择
本研究通过对ZORBAX Eclipse Plus (C18 2.1 * 100 mm, 1.8-Micron)、Luna Omega C18 (2.1 mm × 100 mm, 1.6 μm)色谱柱进行比较研究，结果见图6。采用Luna Omega C18 (2.1 mm × 100 mm, 1.6 μm)色谱柱，在保留时间8~12 min处，各样品峰分离度明显较高，优选用于复方五指柑胶囊的指纹图谱分析。
Figure 6. Results graph of column evaluation. ((a) ZORBAX Eclipse Plus (C18 2.1 * 100 mm, 1.8-Micron), (b) Luna Omega C18 (2.1 mm × 100 mm, 1.6 μm))
图6. 色谱柱考察结果图。((a)为ZORBAX Eclipse Plus(C18 2.1 * 100 mm, 1.8-Micron)色谱柱(b)为Luna Omega C18 (2.1 mm × 100 mm, 1.6 μm)色谱柱)
4.4. HPLC与UPLC指纹图谱对比研究
本研究对比考察了复方五指柑胶囊的HPLC指纹图谱与UPLC指纹图谱，通过UPLC技术建立的指纹图谱具有更高的分辨率、更快的分析时间和更好的灵敏度。分析时间从HPLC指纹图谱42 min缩短至17 min，且峰型及分离度更优，详见图7、图8。
5. 结论
本研究初步构建了复方五指柑胶囊的UPLC指纹图谱，并确定了10个共有峰，这些峰覆盖了处方中的功劳木、五指柑和山芝麻三味中药成分。同时，本研究还指认了异荭草苷、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、
Figure 7. HPLC fingerprints of Compound Wuzhigan Capsules
图7. 复方五指柑胶囊HPLC指纹图谱
Figure 8. UPLC fingerprints of Compound Wuzhigan Capsules
图8. 复方五指柑胶囊UPLC指纹图谱
盐酸小檗碱在指纹图谱中的共有峰。所建立的UPLC指纹图谱仅需17 min即可完成对复方五指柑胶囊中3味药材的4种成分的监测。
6. 展望
药品必须具备三个基本属性：安全性、有效性和质量可控性，其中质量可控性是确保有效性的基础。与传统的高效液相色谱(HLPC)指纹图谱相比，超高效液相色谱(UPLC)展现了更为卓越的性能。对于制药企业来说，高效且迅速的质量评估方法是至关重要的。通过将传统的HLPC指纹图谱升级为UPLC指纹图谱，分析样品所需的时间显著减少。展望未来，随着数据的不断积累，我们有望将指纹图谱的定性鉴别进一步优化为定量分析方法，实现更为高效地检测和快速评价。这将有助于进一步缩短样品检测周期，加速药品上市流程，为公众健康提供更高效、及时的保障。
此外，UPLC指纹图谱的建立不仅提升了分析的精度，还增强了数据的可靠性。通过优化色谱条件与数据处理方法，我们能够更全面地揭示药品中的化学成分特征，为药品的质量控制提供更加科学依据。未来，随着技术的不断进步，UPLC指纹图谱的应用范围将进一步拓展，不仅局限于复方五指柑胶囊，还将广泛适用于其他多种中药及复方制剂的质量控制，为中药现代化和国际化进程贡献力量。同时，我们也期待通过跨学科合作，将人工智能、大数据分析等先进技术融入指纹图谱研究中，进一步提升药品质量评估的智能化水平，为保障公众用药安全做出更大贡献。