摘要: 目的：探究骨髓间充质干细胞外泌体对体外循环所致急性肺损伤的作用及机制。方法：大鼠分为假手术组(Sham组)，体外循环1小时建立急性肺损伤模型(ALI组)及骨髓间充质干细胞外泌体治疗组(BMMSC-Exo组)，HE染色评估肺组织病理改变；ELISA检测肺泡灌洗液中炎症因子TNF-
α、IL-6的表达情况。体外培养AM NR8383肺泡巨噬细胞系，按处理方式不同分为对照组(Control组)、LPS模拟肺损伤组(LPS组)以及外泌体治疗组(BMMSC-Exo组)，激动剂组，激动剂 + 外泌体治疗组，通过Western blot检测炎症小体蛋白、Cleaved caspase 1的表达情况，通过ELISA检测IL-1
β和IL-18的释放情况。结果：与Sham组相比，ALI组肺组织炎症浸润增加，肺组织损伤评分明显升高(
P < 0.05)，肺泡灌洗液中TNF-
α、IL-6的表达增加(
P < 0.05)；BMMSC-Exo组则可见肺部炎症缓解，肺组织损伤评分则较损伤组明显降低(
P < 0.05)，肺泡灌洗液中TNF-
α、IL-6的表达减少(
P < 0.05)。体外研究提示：LPS组肺泡巨噬细胞中炎症小体NLRP3和AIM2的蛋白表达均增加；而BMMSC-Exo组中NLRP3和AIM2的蛋白表达均明显降低；炎症小体激动剂组增加Cleaved caspase 1、IL-18及IL-1
β的表达，而给予外泌体处理后，上述蛋白的表达均被明显抑制(
P < 0.05)。结论：体外循环所致急性肺损伤中炎症小体NLRP3和AIM2的表达增加，骨髓间充质干细胞外泌体可通过阻断炎症小体的激活，从而减少其下游蛋白及炎症因子的释放，从而改善体外循环所致急性肺损伤炎症反应。
Abstract: Objective: To investigate the effect and mechanism of exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells on acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass (CPB). Methods: The rats were divided into Sham operation group, acute lung injury (ALI) model established by cardiopulmonary bypass (CPB) for 1 hour (ALI group) and bone marrow mesenchymal stem cell exosome treatment group (BMMSCS-Exo group). The pathological changes of lung tissue were evaluated by HE staining. ELISA was used to detect the expression of TNF-α and IL-6 in bronchoalveolar lavage fluid. AM NR8383 alveolar macrophage cell line was cultured in vitro. According to different treatment methods, the cells were divided into Control group (Control group), LPS simulated lung injury group (LPS group) and exosome treatment group (BMMSCS-Exo group), agonist group, agonist + exosome treatment group. Western blot was used to detect the expression of inflammasome proteins and Cleaved caspase 1, and ELISA was used to detect the release of IL-1β and IL-18. Results: Compared with the Sham group, the ALI group had significantly increased inflammatory infiltration in lung tissue, significantly increased lung injury score (P < 0.05), and significantly increased expression of TNF-α and IL-6 in alveolar lavage fluid (P < 0.05). Compared with the injury group, the BMSC-Exo group had significantly reduced lung inflammation, significantly reduced lung tissue injury scores (P < 0.05), and significantly reduced expression of TNF-α and IL-6 in alveolar lavage fluid (P < 0.05). In vitro study showed that the protein expression of NLRP3 and AIM2 in alveolar macrophages increased in the LPS group. However, the protein expression of NLRP3 and AIM2 in BMMSCS Exo group was significantly decreased. The inflammasome agonist group increased the expression of Cleaved caspase 1, IL18, and IL-1β, while exosome treatment significantly inhibited the expression of these proteins (P < 0.05). Conclusion: The expression of inflammasome NLRP3 and AIM2 is increased in cardiopulmonary bypass (CPB)-induced acute lung injury. Exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells can reduce the release of downstream proteins and inflammatory factors by blocking the activation of inflammasome, thereby improving the inflammatory response of CPB induced acute lung injury.
1. 前言
急性肺损伤是体外循环术后常见并发症，致死率高且严重影响患者预后[1] [2]。炎症反应在急性肺损伤中发挥极为重要的作用[3]。研究表明作为肺部主要的免疫细胞肺泡巨噬细胞的炎症小体被激活后释放大量炎症因子，触发炎症反应加重不同类型急性肺损伤进展[4]。当前体外循环所致急性肺损伤的治疗方法包括支持性护理、药物治疗、保护性肺通气和ECMO支持等[5]，但是治疗效果仍然不满意[6]。近来研究表明骨髓间充质干细胞来源的外泌体已成为取代干细胞的有效治疗手段，可改善急性肺损伤[7]，但其具体机制尚未阐明。因此本研究探究骨髓间充质干细胞的外泌体对体外循环急性肺损伤并进一步探究其对肺泡巨噬细胞炎症小体的影响。
2. 材料与方法
2.1. 材料
AM NR8383肺泡巨噬细胞系购自上海中科院细胞库；DMEM培养基、胎牛血清以及双抗购自美国Gibco公司；NIRP3、AIM、Cleaved caspase 1及β-actin抗体，ELISA检测试剂盒(IL-6, TNF-α, IL-18, IL-1β)购自武汉Abclonal公司；ATP、poly(dA:dT)购自美国InvivoGen公司。
2.2. 仪器
超速离心机(Optima XPN-100)购自美国Beckman Coulter公司；细胞恒温二氧化碳培养箱(型号：WJ-80G-Ⅲ)购自上海超泓仪器设备有限公司；高速冷冻离心机(型号：H3-18KR)购自湖南可成仪器设备有限公司；蛋白印迹配套设备(型号：伯乐bio-rad)购自美国Bio-rad公司。
2.3. 试验方法
2.3.1. 体外循环急性肺损伤
该方案参照既往研究设计了一种简易大鼠体外循环(Cardiopulmonary Bypass，体外循环)模型，整个实验过程中不需要心脏停跳，也不需要开胸，无需输血，基本无需正性肌力药物。大鼠术前禁食6 h、不禁水。进行麻醉诱导与维持；体外循环建立1小时用呼吸机辅助呼吸并监测大鼠体征，结束后待大鼠情况稳定，置于独立温箱；对照组大鼠仅麻醉、通气、插管，不进行体外循环。
2.3.2. 骨髓间充质干细胞的提取
6~8周龄成年SD大鼠脱颈处死后，在无菌状态下分离股骨，DMEM培养液冲出骨髓，800 r/min离心10 min后用完全培养液(低糖DMEM、20% FBS)重悬，并接种到培养瓶中，放置37℃、5% CO2饱和湿度的细胞孵箱中培养，待细胞融合超过培养瓶底80%时，0.25%胰蛋白酶消化并传代。为了保证BMMSC的纯度，采用第3代BMMSC进行后续实验。并通过流式细胞术对BMMSC的表型(CD34, CD44, CD45, CD90)进行检测。
2.3.3. 外泌体的提取
收集BMMSC细胞培养基，3000 g离心15 min去除细胞碎片，上清用6~7倍体积PBS稀释，13,000 g离心30 min后经0.22 μm滤膜过滤去除大颗粒。收集的上清使用P50A72-986转子，4℃ 100,000 g离心70 min获得外泌体pellet，pellet用PBS重悬后4℃ 100,000 g再次离心70 min，最后加100 µl PBS重悬pellet获得外泌体。
2.3.4. 细胞处理
长势良好的AM NR8383肺泡巨噬细胞系分别置于不同的细胞培养板中进行培养。Control组(不作处理，正常培养)；LPS组(500 μg/L, 24 h)；BMMSC-Exo组(100 µg, 24 h)；激动剂处理组(ATP, 30 min/poly(dA:dT), 8 h)。
2.3.5. Western Blot实验
细胞在裂解缓冲液中匀浆裂解，4℃，12,000 r/min离心15 min。收集裂解物，蛋白浓度用BCA法进行测定。取20 μg总蛋白在1 × SDS缓冲液中煮7 min，进行SDS-PAGE电泳并电转移至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜用含50 g/L脱脂奶粉的TBST室温封闭1.5 h，然后依次滴加1:1000的各种一抗，4℃过夜后TBST洗涤3次，每次10 min。然后用1:5000的IgG二抗孵育2 h，然后用TBST洗涤3次，每次10 min。最后用ECL发光液进行曝光显影，Bio-RAD照相系统(美国)进行照相并用其附带的软件分析蛋白的相对表达量。
2.3.6. 炎症因子的监测
根据ELISA试剂盒说明，检测TNF-α、IL-6、IL-18、IL-1β炎症因子的释放情况。
2.3.7. HE染色
处死大鼠取肺组织，经过包埋切片、脱蜡并水化、苏木精染色、脱水，透明，封片等步骤。显微镜下观察肺组织切片并拍照。并参照Szapiel及Lee等人的相关标准对在低倍及高倍镜视野下随机选取5个以上的区域对病理组织切片根据组织病理表现结果进行评分：0分：无肺泡炎，1分：轻度肺泡炎，肺隔因细胞浸润增宽，病变范围局限在全肺的20%以下；2分：中度肺泡炎，病变范围占全肺的20%~50%；3分，呈弥漫性分布，病变范围大于50%。
2.4. 统计学处理
SPSS22.0统计学软件对数据进行统计分析，两组间差异的比较采用t检验，结果以均数 ± 标准差(x ± s)表示，P < 0.05为具有统计学意义。
3. 结果
3.1. 骨髓间充质干细胞外泌体改善体外循环急性肺损伤
HE染色结果表明，假手术组肺组织中肺泡壁稍薄，肺泡间隔内未发现充血且肺泡间隔无增宽，无炎性细胞浸入；体外循环所致急性肺损伤组肺泡壁毛细血管扩张严重，肺泡壁充血，肺泡内可见大量炎性细胞浸润，肺泡间隔增厚，肺泡塌陷，间质水肿；外泌体治疗组则可见炎症缓解并参见图1(A)。此外，我们对病理组织切片根据组织病理表现结果进行评分(见图1(B))。评分结果显示，与假手术组相比，体外
Note: Compared with Sham group, *P < 0.05, compared with ALI group, #P < 0.05.
Figure 1. The HE staining and pathological scores results of each group
图1. 各组HE染色及病理评分结果
循环所致急性肺损伤组大鼠肺组织损伤评分明显升高(P < 0.05)，而外泌体治疗组肺组织损伤评分则较损伤组明显降低(P < 0.05)。以上结果表明骨髓间充质干细胞外泌体可改善体外循环所致的急性肺损伤。
3.2. 骨髓间充质干细胞外泌体减少体外循环急性肺损伤炎症反应
根据图2中ELISA结果显示，与假手术组相比，体外循环所致急性肺损伤组肺泡灌洗液中TNF-α及IL6的表达均上调(P < 0.05)；而外泌体治疗组中TNF-α及IL-6的表达均明显下调(P < 0.05)，这表明骨髓间充质干细胞减少体外循环所致急性肺损伤的炎症反应。
Note: Compared with Sham group, *P < 0.05, compared with ALI group, #P < 0.05.
Figure 2. The ELISA results of each group
图2. 各组ELISA结果
3.3. 骨髓间充质干细胞外泌体减少肺泡巨噬细胞炎症小体NLRP3和AIM2的表达
为了探究骨髓间充质干细胞外泌体改善体外循环急性肺损伤的具体机制，我们对AM NR8383肺泡巨噬细胞系LPS处理24小时来体外模拟体外循环急性肺损伤模型，并给予外泌体处理，进行Western blot实验。在图3中可见，与对照组相比，LPS处理组肺泡巨噬细胞中炎症小体NLRP3和AIM2的蛋白表达
Figure 3. The effects of BMMSC-Exo on inflammasomes NLRP3 and AIM2 in AM NR8383 cells
图3. 外泌体对AM NR8383肺泡巨噬细胞炎症小体NLRP3和AIM2的蛋白表达的影响
均增加；而外泌体治疗组中NLRP3和AIM2的蛋白表达均明显降低，这表明骨髓间充质干细胞减少LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症小体NLRP3和AIM2的表达。
3.4. 骨髓间充质干细胞外泌体阻断肺泡巨噬细胞炎症小体NLRP3和AIM2的激活
为了进一步明确骨髓间充质干细胞外泌体对炎症小体NLRP3和AIM2的激活情况，我们分别给予AM NR8383肺泡巨噬细胞系ATP (NLRP3的激活剂)处理30分钟，poly(dA:dT) (AIM2的激活剂)处理8小时来激活炎症小体，并给予外泌体处理，进行western blot实验炎症小体下游蛋白Cleaved caspase 1及炎症因子IL18及IL1β的释放情况。在图4(A)中可见，ATP及poly(dA:dT)均增加Cleaved caspase 1的蛋白表达，而给予外泌体处理后，Cleaved caspase 1的蛋白表达均下调。同时，从图4(B)中可见，ATP及poly(dA:dT)均增加IL18及IL1β的释放(P < 0.05)，而给予外泌体处理后，二者的释放均被明显抑制(P < 0.05)。这些均表明骨髓间充质干细胞外泌体可阻断炎症小体NLRP3和AIM2的激活，从而减少其下游蛋白炎症因子的释放，改善炎症反应。
Note: Compared with Sham group, *P < 0.05, compared with ALI group, #P < 0.05.
Figure 4. Effect of exosomes on the activation of inflammasome NLRP3 and AIM2 in AM NR8383 alveolar macrophages
图4. 外泌体对AM NR8383肺泡巨噬细胞炎症小体NLRP3和AIM2激活的影响
4. 讨论
急性肺损伤是体外循环术后常见并发症，严重影响患者预后[8]。尽管当前体外循环导致急性肺损伤的治疗方法很多，但是治疗效果仍然欠佳[9]。研究表明骨髓间充质干细胞来源的外泌体已成为取代其来源细胞的有效治疗手段，可显著改善不同类型急性肺损伤[7]，但其具体机制尚未阐明。
在本研究中，我们表明骨髓间充质干细胞外泌体可改善体外循环所致急性肺损伤病理改变；进一步发现外泌体可改善急性肺损伤造成的炎症反应。巨噬细胞炎症反应参与急性肺损伤的进程。急性刺激下，作为肺部驻足的主要的免疫细胞，肺泡巨噬细胞的炎症小体被激活后释放大量炎症因子，触发炎症反应从而加重急性肺损伤进展[10] [11]。炎症小体分为NLR家族(例如NLRP3)和非NLR家族(例如AIM2) [12]，在识别外源性和内源性刺激信号时组装的蛋白质复合物，并进一步激活经典半胱天冬酶-1 (Caspase 1)，分泌促炎因子白细胞介素-1β (IL-1β)和IL-18，从而参与免疫和炎症反应[13]。炎症小体激活与多种肺部疾病有关，包括急性肺损伤[14] [15]。在急性肺损伤时，肺实质和驻留免疫细胞中的炎症小体激活，分泌IL-1β和IL-18，进一步驱动肺部炎症反应。在动物模型中，阻断这种不良的炎症反应已被证明是有益的[16]，并且逐渐成为研究焦点。
在我们的研究中，我们通过对AM NR8383肺泡巨噬细胞系LPS处理来体外模拟体外循环急性肺损伤模型，给予外泌体处理后发现，LPS处理组肺泡巨噬细胞中炎症小体NLRP3和AIM2的蛋白表达均增加；而外泌体治疗组中NLRP3和AIM2的蛋白表达均明显降低，这提示骨髓间充质干细胞可能参与阻断肺泡巨噬细胞炎症小体NLRP3和AIM2的表达。进一步，我们通过分别给予NLRP3和AIM2的激活剂处理来激活炎症小体，并给予外泌体处理，发现外泌体显著下调炎症小体下游蛋白Cleaved caspase 1的表达，减少炎症因子IL18及IL1β的释放。这些均进一步证实骨髓间充质干细胞外泌体可阻断炎症小体NLRP3和AIM2的激活，从而减少其下游蛋白炎症因子的释放，改善炎症反应。
综上所述，骨髓间充质干细胞外泌体可通过阻断炎症小体的激活，从而减少其下游蛋白及炎症因子的释放，从而改善体外循环所致急性肺损伤炎症反应。
基金项目
山东省自然科学基金(ZR2021QH148)。
NOTES
*通讯作者。