m6A结合蛋白LRPPRC促进多发性骨髓瘤的肿瘤发生

The m6A-Binding Protein LRPPRC Promotes the Tumorigenesis of Multiple Myeloma

摘要: 目的：探讨N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)结合蛋白富含亮氨酸的五肽重复蛋白(leucine-rich pentatricopeptide repeat-containing, LRPPRC)在多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)中的临床意义及生物学功能。方法：采用生物信息学方法筛选MM中差异表达的m6A相关蛋白，qRT-PCR检测LRPPRC在MM患者骨髓样本中的表达水平，并通过qRT-PCR和western blot检测其在MM细胞系中的表达。通过体外实验CCK-8实验、细胞周期分析和凋亡实验评估LRPPRC对MM进展的影响。结果：多个数据库筛选出LRPPRC是MM中关键的差异表达m6A基因，其表达在MM患者中显著升高，并与MM分期及较差的预后密切相关。在U266、RPMI-8226和MM.1S三种MM细胞系及患者骨髓样本中证实LRPPRC高表达。此外，LRPPRC表达与ISS分期呈正相关。敲低LRPPRC可抑制MM细胞增殖，促进凋亡并诱导细胞周期阻滞。结论：本研究表明，LRPPRC可能成为MM潜在的预后标志物和治疗靶点。

Abstract: Objectives: To explore the clinical relevance and biological roles of the N6-methyladenosine (m6A) binding protein leucine-rich pentatricopeptide repeat-containing protein (LRPPRC) in multiple myeloma (MM), aiming to offer new insights into its potential as a prognostic marker and therapeutic target for MM. Methods: Bioinformatics methodologies were employed to identify m6A-associated proteins exhibiting differential expression in MM. The expression levels of LRPPRC in the bone marrow of MM patients were assessed using Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR). Additionally, the expression of LRPPRC in MM cell lines was evaluated through qRT-PCR and Western blot analysis. In vitro experiments, including CCK-8 assays, cell cycle analyses, and apoptosis assays, were conducted to assess the impact of LRPPRC on MM progression. Results: We identified LRPPRC as a critical m6A differentially expressed gene in MM, observing that its expression was significantly upregulated in MM. This upregulation was positively correlated with the staging of MM and associated with poorer prognoses in MM patients. Furthermore, we confirmed elevated LRPPRC expression in three MM cell lines U266, RPMI-8226, and MM.1S as well as in the bone marrow of MM patients. Additionally, LRPPRC expression demonstrated a positive correlation with the International Staging System (ISS) stages of MM. Furthermore, LRPPRC knockdown inhibited the proliferation of MM cells, enhanced apoptosis, and induced cell cycle arrest. Conclusion: The study suggests that LRPPRC may serve as a potential prognostic target for MM.

1. 引言

多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种由恶性浆细胞克隆性增殖引起的血液系统恶性肿瘤[1]。其疾病进展通常经历三个阶段：从无症状的癌前状态即意义未明的单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined significance, MGUS)，逐步发展为冒烟型多发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma, SMM)，最终进展为MM，部分患者会进一步恶化为浆细胞白血病(plasma cell leukemia, PCL) [2]。目前，MM的主要治疗手段包括化疗和自体干细胞移植，但由于频繁复发及耐药性，该病仍难以治愈[3]。MM的发病机制尚未完全阐明，这凸显了深入研究其分子机制及寻找新的预后标志物的重要性。

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)修饰是真核生物中最常见的mRNA修饰，这种修饰受三类元件动态调控：催化m6A添加的甲基转移酶、介导其去除的去甲基化酶，以及识别结合m6A修饰转录本的结合蛋白，这些元件通过影响基因表达、RNA稳定性和细胞信号传导发挥作用[4]。富含亮氨酸的五肽重复蛋白(leucine-rich pentatricopeptide repeat-containing, LRPPRC)作为m6A结合蛋白，属于含PPR基序的蛋白家族[5]。PPR蛋白通过与RNA结合，调节翻译、多聚腺苷酸化及转运等过程，同时维持RNA和基因组的稳定性[6] [7]。研究表明，LRPPRC在多种肿瘤中高表达，并与不良预后相关[8]-[11]。然而，LRPPRC在MM中的生物学功能及其作用机制尚未明确。本研究旨在探索LRPPRC在MM中的临床意义及其生物学功能，以期为MM预后标志物的筛选和新型治疗靶点的开发提供理论依据。

2. 材料与方法

2.1. 生物信息学分析

通过GTEx数据库检索了MMRF数据集，同时从GEO数据库访问了与MM相关的GSE6691, GSE6477和GSE13591数据集。使用“limma”R软件包在MMRF数据集中鉴定了761个新诊断的MM和337个健康对照(HC)之间的差异表达基因。通过GSEA工具对来自GTEx的基因表达数据进行了分析，对包括上调基因和下调基因在内的差异表达基因进行了相关性分析。利用“survminer”和“survival”R软件包进行Kaplan-Meier生存分析和Cox回归建模，研究LRPPRC表达与生存预后之间的关系。

2.2. 研究对象

将2021年11月至2023年4月在青岛大学附属医院收治的40名新确诊的无症状MM患者纳入研究组。纳入标准：① 根据国际骨髓瘤工作组指南确诊为MM；② 年龄在18岁或以上；③ 既往无化疗、放疗或干细胞移植史；④ 人类免疫缺陷病毒(HIV)血清阴性。我们排除了其他血液系统恶性肿瘤或实体瘤患者以及孕妇或哺乳期妇女。此外，我们在本院收集36名非血液系统疾病患者骨髓作为对照。本研究经青岛大学附属医院伦理委员会批准(审批号：QYFYWZLL29371)。

2.3. 细胞培养和转染

人MM细胞系U266和RPMI-8226购自丰晖生物技术(中国)，而MM.1S细胞系及人B淋巴细胞系GM12878购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。U266、MM.1S和GM12878在含15%胎牛血清和1%青霉素–链霉素的RPMI-1640培养基中培养，RPMI-8226在含15%胎牛血清和1%青霉素–链霉素的IMDM培养基中培养，在细胞80%的融合度时，按照制造商说明书使用慢病毒载体(吉凯基因，中国)进行转染。用2.5 µg/mL嘌呤霉素对感染细胞进行筛选。

2.4. 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)

使用TRIzol试剂提取细胞总RNA。使用TransScript All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (TransGen，中国)进行反转录。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme，中国)分析mRNA水平。GAPDH用于归一化。引物序列如下：

LRPPRC-forward: CTCACCAACTGATTTCCTGGC;

LRPPRC-reverse: AATACTGCCTCTGTAACTGGGA;

GAPDH-forward: GATTCCACCCATGGCAAATTC;

GAPDH-reverse: CTGGAAGATGGTGATGGGATT.

2.5. Western Blot

用RIPA裂解缓冲液从MM细胞中分离蛋白质，并用BCA蛋白测定试剂盒(Solarbio，中国)测定其浓度。提取的蛋白质经SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜上，并用无蛋白快速阻断液(Boster，中国)阻断。随后，用特异性抗体对薄膜进行检测。使用的抗体包括抗LRPPRC (1:10,000, Proteintech)、抗GAPDH (1:5000, Proteintech)和HRP抗兔IgG (1:5000 Abcam)。

2.6. CCK-8实验

将细胞按每孔3000个的密度培养在96孔板中。使用CCK-8试剂检测细胞在0、24、48、72和96小时的存活率。每孔加入10 μl CCK-8试剂，37℃避光培养2小时。随后使用酶标仪测量450 nm波长吸光度。

2.7. 细胞凋亡实验

转染的细胞用PBS冲洗随后重悬于100 μL结合缓冲液中。在缓冲液中加入Annexin V-PE (10 μL)和7-AAD (10 μL)，避光孵10分钟后使用流式细胞仪分析。

2.8. 细胞周期测定

收集1 × 10细胞，用70%乙醇固定，在4℃下保存过夜。随后在室温下用PI溶液避光中染色30分钟，使用流式细胞仪检测。

2.9. 统计分析

使用SPSS 26和GraphPad Prism 7统计分析。计数数据以计数(百分比)表示，连续数据以均数 ± 标准差(临床数据)表示，若为正态分布，则以均数 ± 标准误差(实验数据)表示。如果数据不呈正态分布，则以中位数和第25~75百分位数表示。采用t检验、方差分析、卡方检验或Wilcoxon秩和检验进行分析。P < 0.05具有统计学意义。

3. 结果

3.1. MM中m6A调控因子的差异表达分析

通过文献检索，我们共鉴定出31种m6A调控因子，其中METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、RBM15B、RBM15、ZC3H13、METTL16、CBLL1、ZNF217和ZCCHC4属于甲基转移酶；FTO和ALKBH5为去甲基酶；YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、HNRNPC、HNRNPA2B1、FMR1、LRPPRC、RBMX、ELAVL1、EIF3A、G3BP1、G3BP2和SND1则是m6A结合蛋白。通过GTEx数据库分析发现，这31种m6A调控因子在MM中的表达均与对照组有显著差异(图1(A)，图1(B))。这些结果提示，m6A调控因子可能在MM的生物学发展中发挥作用。随后，我们对这些m6A相关基因进行了相关性分析(图1(C))。

红色表示正相关，蓝色表示负相关，颜色较深且面积大的点代表较强的相关性。被划去的单元格表示两基因之间的共表达相关性不显著。

Figure 1. Differential expression analysis of the m6A regulators in MM

图1. MM中m6A调控因子的差异表达分析

3.2. 筛选MM的关键m6A差异表达基因

为了进一步筛选MM的关键m6A差异表达基因，我们联合分析了MMRF数据集与GSE6691，GSE6477，GSE13591数据集。维恩图显示，LRPPRC在这四个数据集中均上调，因此我们将LRPPRC作为m6A调控因子用于后续分析(图2(A)、图2(B))。此外，GEPIA和TCGA数据库的泛癌分析结果表明，LRPPRC在大部分癌症中表达显著上调(图2(C)、图2(D))。

Figure 2. Screening for key m6A differentially expressed genes in MM

图2. 筛选MM中的关键m6A差异表达基因

3.3. LRPPRC在MM中表达上调

为了检测LRPPRC在MM中的表达，我们分析GTEx数据库的结果，并用qRT-PCR检测了MM (n = 40)和对照骨髓标本(n = 36)中LRPPRC的表达，结果显示LRRPPRC在MM患者中的表达显著上调(图3(A)、图3(B))。与上述结果一致，qRT-PCR和western blot的检测结果显示，与对照细胞系(人B淋巴细胞GM12878)相比，LRPPRC在三种MM细胞系(RPMI-8226、U266和MM.1S)中的表达水平明显升高(图3(C)、图3(D))。

Figure 3. LRPPRC shows upregulation in MM

图3. LRPPRC在MM中表达上调

3.4. LRPPRC可作为MM的预后因子

我们分别分析了LRPPRC表达与MM疾病进展及临床分期的相关性。通过对GEO数据库的分析，我们发现LRPPRC的表达在患者中明显高于健康供体，并且在MGUS、SMM、MM和PCL中，LRPPRC的表达呈逐渐增加的趋势(图4(A)~4(C))。我们进一步在GTEx数据库中评估了不同阶段MM的LRPPRC表达，结果发现3期的LRPPRC表达较高(图4(D))。

随后我们对40名首次诊断为MM的患者的临床特征进行了统计分析(表1)。这些MM患者骨髓中LRPPRC的中位相对表达量为9.33 (2.11, 17.13)。所有患者根据LRPPRC相对表达量是否高于或低于MM患者的中位值，分为高表达组和低表达组。随后，我们分析了LRPPRC相对表达与MM患者临床特征的相关性(表2)。结果显示，LRPPRC的表达与β2-MG水平(P < 0.001)和ISS分期(P = 0.007)呈正相关(表2)，其中β2-MG是MM的一个不良预后指标。

为了进一步研究LRPPRC表达与预后的关系，我们进行了生存相关分析。多因素Cox回归分析表明，LRPPRC是MM的独立预后预测因子(图4(E))。Kaplan-Meier生存分析显示，LRPPRC表达与MM患者的总生存期(OS)呈显著负相关(图4(F))。这些结果表明，LRPPRC与MM的不良预后相关，可能作为MM的预后标志物。

Figure 4. Correlation between LRPPRC and clinical features of MM

图4. LRPPRC与MM临床特征之间的相关性

Table 1. Clinical characteristics of MM patients

表1. MM患者的临床特征

Variable	N = 40
Age (years)	66.50 (56.00, 72.25)
Hb (g/L)	93.63 ± 21.40
Calcium (mg/dL)	8.90 (8.55, 9.64)
Scr (μmol/L)	92.15 (72.04, 120.48)
LDH (U/L)	165.50 (128.55, 211.50)
ALB (g/L)	32.96 (29.08, 39.40)
β2-MG (mg/L)	4.66 (3.13, 8.76)
Gender (n/%)
Female	15 (37.50%)
Male	25 (62.50%)
Bone lesion (n/%)
No	5 (12.50%)
Yes	35 (87.50%)
Renal impairment (n/%)
No	30 (75.00%)
Yes	10 (25.00%)
Immunoglobulin subtype (n/%)
IgA	7 (17.50%)
IgG	27 (67.50%)
IgD	1 (2.50%)
Free light chains only 3	5 (12.50%)
DS stage (n/%)
Ⅰ	1 (2.50%)
Ⅱ	9 (22.50%)
Ⅲ	30 (75.00%)
ISS stage (n/%)
Ⅰ	5 (12.50%)
Ⅱ	8 (20.00%)
Ⅲ	27 (67.50%)

Table 2. Correlation between relative LRPPRC expression and patients’ clinical characteristics

表2. LRPPRC相对表达与患者临床特征的相关性

Variable	LRPPRC relative expression		P-value
	Low N = 20 (50%)	High N = 20 (50%)
Agey (n/%)	68.50 (60.00, 74.25)	65.00 (55.00, 72.00)	0.386
Hb (n/%)	100.20 ± 21.33	87.05 ± 19.85	0.051
Calcium (n/%)	8.82 (8.30, 9.43)	9.20 (8.60, 9.64)	0.285
Scr (n/%)	81.65 (65.75, 114.53)	100.35 (84.30, 144.75)	0.149
LDH (n/%)	166.50 (138.48, 211.50)	150.50 (125.83, 217.43)	0.433
ALB (n/%)	32.96 (29.18, 39.40)	32.80 (27.68, 39.18)	0.841
β2-MG (n/%)	3.54 (2.79, 4.56)	7.49 (5.74, 11.66)	<0.001
Gender (n/%)			0.514
Female	6 (30.00%)	9 (45.00%)
Male	14 (70.00%)	11 (55.00%)
Bone lesion (n/%)			>0.999
No	3 (15.00%)	2 (10.00%)
Yes	17 (85.00%)	18 (90.00%)
Renal impairment (n/%)			>0.999
No	15 (75.00%)	15 (75.00%)
Yes	5 (25.00%)	5 (25.00%)
Immunoglobulin subtype (n/%)			0.126
IgA	1 (5.00%)	6 (30.00%)
IgG	16 (80.00%)	11 (55.00%)
IgD	1 (5.00%)	0 (0.00%)
Free light chains only	2 (10.00%)	3 (15.00%)
DS stage (n/%)			0.072
Ⅰ	1 (5.00%)	0 (0.00%)
Ⅱ	7 (35.00%)	2 (10.00%)
Ⅲ	12 (60.00%)	18 (90.00%)
ISS stage (n/%)			0.007
Ⅰ	5 (25.00%)	0 (0.00%)
Ⅱ	6 (30.00%)	2 (10.00%)
Ⅲ	9 (45.00%)	18 (90.00%)

3.5. LRPPRC促进MM增殖，降低凋亡

为了探讨LRPPRC在MM中的生物学功能，我们通过体外实验研究了LRPPRC水平敲低后MM细胞的表型特征。我们构建两种稳定表达siRNA (siLRPPRC#1和siLRPPRC#2)的MM人类细胞系U266 (图5(A)、图5(B))和RPMI-8226 (图5(C)、图5(D))，随后验证LRPPRC敲低的效果。CCK-8实验结果显示，与对照组相比，siLRPPRC显著抑制了细胞增殖(图6(A)、图6(B))。LRPPRC的敲低还促进了MM细胞的凋亡(图6(C)、图6(D))。此外，细胞周期分析表明，LRPPRC抑制增加了G1期细胞的比例，同时减少了G2期细胞的比例(图6(E)、图6(F))。这些结果提示LRPPRC在体外促进了MM的进展。

Figure 5. Construction of LRPPRC knockdown MM cell lines

图5. 构建LRPPRC敲低的MM细胞系

Figure 6. LRPPRC promotes MM progression in vitro

图6. LRPPRC在体外促进MM的进展

4. 讨论

m6A修饰在生理和病理条件下都起着至关重要的作用，尤其是在各种人类癌症的发生和发展过程中[12]。这种修饰由三类酶进行动态可逆调节：m6A甲基转移酶、m6A去甲基化酶和m6A结合蛋白[13]。近年来，关于m6结合蛋白的研究逐渐增多。这些“阅读酶”通过识别和结合m6A修饰的转录本，从而通过多种途径调控基因表达，包括mRNA剪接、稳定性、输出、结构、翻译效率和miRNA的生物发生[14]-[16]。

LRPPRC作为m6A阅读器，是含PPR基序蛋白家族的成员，该家族包含多种PPR蛋白[7]。这些蛋白通过与RNA相互作用，参与调控涉及RNA的多种生物学过程，包括转录、加工、剪接、稳定性、编辑及翻译等[17]-[20]。近年来，m6A结合蛋白的功能逐渐成为研究热点，其中LRPPRC作为含PPR基序的RNA结合蛋白，因其在多种癌症中的促癌作用而备受关注[21]-[23]。在肺癌中，LRPPRC通过与CDK6形成反馈循环，影响癌细胞对CDK4/6抑制剂的反应，从而促进耐药性[24]。近期研究表明，LRPPRC参与非编码RNA诱导的肿瘤发生。Niinuma等发现，LINC02154通过与LRPPRC相互作用影响线粒体功能，促进口腔鳞状细胞癌的肿瘤发生[25]。此外，hsa_circ_0020093通过hsa_circ_0020093/LRPPRC和hsa_circ_0020093/miR-107/LATS2双轴通路抑制卵巢癌进展，为卵巢癌患者提供了潜在治疗靶点[10]。进一步研究发现，LRPPRC在Lys453位点的多聚泛素化参与USP44-STUB1相关的神经母细胞瘤化疗耐药，为神经母细胞瘤的治疗和预后评估提供了潜在靶标[26]。HAPSTR1通过抑制LRPPRC泛素化并招募PSMD14与其相互作用，调控卵巢癌的肿瘤进展[27]。此外，LRPPRC 对维持线粒体稳态至关重要，可防止线粒体自噬降解并影响肿瘤发生[28]。这些研究揭示了LRPPRC在肿瘤中的多功能性，但其在MM中的作用尚未明确。

在本研究中，我们对MM和健康对照中与m6A相关的基因表达水平进行了比较，结果发现MM中31个m6A调控因子的表达显著不同，随后对这31个基因进行了相关性分析。通过对GTEx和GEO数据库的联合分析，确定了LRPPRC是MM中的关键差异表达基因。通过GEPIA和TCGA数据库的泛癌分析，我们发现LRPPRC在大多数肿瘤中显著上调。随后，我们比较了MM患者和对照组骨髓中LRPPRC的表达，结果显示LRPPRC在MM患者中上调。qRT-PCR和western blot检测细胞系中LRPPRC的表达结果也表明，MM细胞中LRPPRC的水平较人B淋巴细胞显著升高。GEO数据库的分析显示LRPPRC与MM进展呈正相关且LRPPRC与MM分期呈正相关。接着，我们分析了40名MM患者的临床数据，评估了LRPPRC与临床特征的相关性，发现LRPPRC的高表达与MM患者β2-MG水平升高和ISS分期相关。β2-MG与MM的预后呈负相关，较高的β2-MG水平与高肿瘤负荷和肾功能下降相关[29] [30]。ISS分期主要用于患者预后的评估[31]，因此我们推测LRPPRC与患者预后相关。此外，多因素回归分析显示LRPPRC是MM的独立危险因素。我们进一步通过Kaplan-Meier生存曲线评估了LRPPRC在MM中的预后意义，分析结果显示LRPPRC的高表达与较差的总生存期(OS)相关。为了进一步探讨LRPPRC的作用，我们在MM细胞中进行了体外实验，结果表明LRPPRC敲低抑制了MM细胞增殖，增加了细胞凋亡并导致细胞周期停滞。在本研究中，我们探讨了m6A修饰在MM中的潜在作用，并重点分析了LRPPRC作为一个重要的m6A阅读器在该疾病中的表达情况。我们的研究结果表明LRPPRC作为一种致癌基因在MM进展中发挥着重要作用，并为进一步探索其在临床应用中的潜力奠定了基础。未来的研究应当集中于阐明LRPPRC与MM发生发展的详细机制，以推动其作为治疗靶点的临床转化。

5. 结论

我们的研究表明，m6A结合蛋白LRPPRC通过调控细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡在促进MM进展中发挥重要作用，提示LRPPRC可能成为MM潜在的预后靶点。

基金项目

山东省自然科学基金资助项目(ZR2020MH314)；山东省自然科学基金资助项目(ZR2021MH311)。

NOTES

^*通讯作者。