基于网络药理学、分子对接与分子动力学模拟探讨华蟾酥毒基对翼状胬肉成纤维细胞的影响作用

Exploring the Effects of Cinobufagin on Human Pterygium Fibroblasts Using Network Pharmacology, Molecular Docking, and Molecular Dynamics Simulations

摘要: 目的：运用网络药理学、分子对接、分子动力学模拟和细胞实验预测华蟾酥毒基(Cinobufagin)对人翼状胬肉成纤维(Human Pterygium Fibroblasts, HPF)细胞影响作用及其可能作用靶点。方法：运用Swiss Target Prediction、GeneCards和OMIM等数据库筛选翼状胬肉(Pterygium)与华蟾酥毒基的相关靶点，绘制交集靶点韦恩图，STRING数据库构建蛋白相互作用网络图，运用GO与KEGG富集分析药物－疾病关键靶点的功能与通路，分子对接验证华蟾酥毒基与关键靶点相互结合能力，分子动力学模拟再次分析华蟾酥毒基与关键靶点的结构稳定性和相互作用；通过细胞培养，运用CCK-8法、RT-qPCR实验研究华蟾酥毒基对HPF细胞增殖、凋亡因子作用及关键靶点的影响。结果：检索获取华蟾酥毒基与翼状胬肉共同靶点36个；核心靶点涉及mTOR和MDM2；富集分析显示华蟾酥毒基主要作用在PI3K/AKT通路；分子对接发现其与mTOR、MDM2结合强烈；分子动力学模拟进一步确认其结构稳定性及相互作用。CCK8实验表明华蟾酥毒基抑制HPF细胞活力，RT-qPCR实验结果显示，华蟾酥毒基可干预相关靶点的mRNA表达。结论：通过网络药理学、分子对接、分子动力学模拟和RT-qPCR共同验证了华蟾酥毒基可抑制HPF细胞增殖及凋亡相关因子的表达；其作用机制可能与mTOR、MDM2等靶点有关。

Abstract: Objective: This study aims to predict the effects of cinobufagin on human pterygium fibroblasts (HPF) and identify its potential targets using network pharmacology, molecular docking, molecular dynamics simulations, and cellular experiments. Methods: We utilized databases such as Swiss Target Prediction, GeneCards, and OMIM to screen for targets associated with pterygium and cinobufagin. A Venn diagram was created to illustrate the intersecting targets, and the STRING database was employed to construct a protein-protein interaction network. Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analyses were conducted to explore the functions and pathways of key drug-disease targets. Molecular docking was performed to assess the binding affinity of cinobufagin to these key targets, while molecular dynamics simulations were used to further analyze the structural stability and interactions of cinobufagin with the identified targets. Additionally, cell culture and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) experiments were carried out to investigate the effects of cinobufagin on HPF cell proliferation, apoptotic factors, and key targets. Results: A total of 36 common targets for cinobufagin and pterygium were identified, with core targets including mTOR and MDM2. Enrichment analysis indicated that cinobufagin primarily acts on the PI3K/AKT signaling pathway. Molecular docking studies demonstrated strong binding affinity of cinobufagin to mTOR and MDM2. Molecular dynamics simulations further confirmed the structural stability and interactions of cinobufagin with these targets. Results from the RT-qPCR experiments suggested that cinobufagin could modulate the mRNA expression of related targets. Conclusion: The combined approaches of network pharmacology, molecular docking, molecular dynamics simulations, and RT-qPCR provide evidence that cinobufagin can inhibit HPF cell proliferation and the expression of apoptosis-related factors. Its mechanism of action may be associated with targets such as mTOR and MDM2.

1. 引言

翼状胬肉(Pterygium)是一种以结膜纤维血管组织侵入角膜为特征的增殖性疾病，严重时可覆盖瞳孔区，影响患者视力[1]。该病的总患病率为10.2%，且男性患病率高于女性(14.5%:13.6%) [2]。尽管手术治疗广泛应用，但复发率较高。丝裂霉素-C (MMC)、糖皮质激素类药物、抗VEGF药物和免疫抑制剂等药物在治疗中显示出一定疗效，但个体差异明显[3]-[6]。近年来，中医药在眼科疾病中的应用逐渐增多，其显著的抗增殖作用和较小的不良反应使其在治疗中展现出良好的效果[7] [8]。

蟾酥是由蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑框蟾蜍的耳后腺和皮肤腺体分泌物干燥而成，其中的华蟾酥毒基(Cinobufagin)是蟾酥的主要抗肿瘤抗增殖的活性成分，能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和自噬，减少血管生成 ；现有研究表明，华蟾素注射液在治疗眼病方面已有报道，且取得了良好的临床疗效[2] [9] [10]。翼状胬肉作为一种增殖性疾病，其病理机制复杂，关于华蟾酥毒基治疗翼状胬肉的机制尚不明确。因此，探讨华蟾酥毒基在翼状胬肉病理进程中的潜在作用，不仅有助于揭示其分子机制，还可能为该疾病的治疗提供新的药物靶点。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 药物与试剂

华蟾酥毒基(批号HY-N0421，美国MCE)，培养基DMEM/f12 (批号C11330500BT，GIBCO)，胎牛血清(批号c04001，上海达特希尔生物科技有限公司)，青链霉素(批号240004003)和胰蛋白酶(批号240006010)购于北京索莱宝科技有限公司；CCK8试剂盒(批号13505202，米鼠)；RNA逆转录试剂盒(RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit) (批号2964046，赛默飞)；SYBR GREEN PCR MIX (批号CW0957)购自北京康为公司。

2.1.2. 细胞

收集石河子大学第一附属医院眼科在2024-03-01/2024-04-30手术切除的翼状胬肉组织10例。所有患者均签署了知情同意书并自愿参加研究。本研究方案已经通过石河子大学第一附属医院科技伦理委员会(KJ2024-179-02)批准，遵守《赫尔辛基宣言》。

2.1.3. 仪器

台式离心机(型号TGL-16c，上海安亭科学仪器厂)，冷冻离心机(型号HSC-2015L，新芝)，酶标仪(型号Cmax plus，Molecular公司)、实时荧光定量PCR仪(型号Light Cycler 480，美国罗氏公司)。

2.2. 方法

2.2.1. 网络药理学、分子对接与分子动力学模拟

1. 华蟾酥毒基靶点与翼状胬肉疾病相关靶点预测

联合使用Swiss Target Prediction、SEA、HERB、STITCH、SuperPred、Pharmmapper中药成分靶点预测平台预测华蟾酥毒基的相关靶点。通过Genecards人类基因数据库、OMIM数据库和HERB数据库获取翼状胬肉疾病靶点进行进一步网络分析。使用Origin 2023学术版软件对华蟾酥毒基与翼状胬肉相关靶点取交集。

2. 蛋白互作网络与“药物–靶点–疾病–信号通路”网络构建

使用STRING数据库对交集靶点进行蛋白质互作网络分析。使用Cytoscape3.9.0软件绘制PPI蛋白互作网络图和“华蟾酥毒基–靶点–翼状胬肉–信号通路”网络图，显示出华蟾酥毒基与靶点、翼状胬肉以及信号通路之间的复杂关系。根据PPI蛋白互作网络中的Degree值排序获取核心靶点。

3. GO与KEGG富集分析

R4.2.2软件以及微生信在线绘图平台被广泛应用于对中药与疾病交集靶点的基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析中。通过这些分析，获取GO功能注释与KEGG信号通路，以富集基因数为标准绘制GO和KEGG柱状分类图和气泡图。

4. 关键靶点的分子对接验证

从PubChem数据库下载筛选出的核心化合物的SDF格式结构文件；通过蛋白质结构数据库PDB获取药物–疾病交集靶点的三维结构。将靶点蛋白及药物活性成分导入AutoDock Tools 1.5.7，利用Auto Dock Vina 1.2.0软件进行分子的半柔性对接，获得有效活性成分与核心靶点对接结合自由能以及对接结果。

5. 分子动力学模拟

使用Gromacs2022.4软件对MDM2和MTOR蛋白与华蟾酥毒基各自的复合物进行分子动力学模拟(MD)。选择Amber14sb为蛋白力场，选择Gaff2为配体力场，选用TIP4P水模型对蛋白质配体体系添加溶剂并建立周期性边界为1.2 nm的水盒子，粒子网格(PME)方法被用于计算长程静电相互作用，使用蒙特卡罗离子放置法引入适当数量钠离子和氯离子以中和整个系统的电荷。在系统能量最小化和平衡后，在没有任何约束的情况下以步长为2 fs的时间进行100 ns的分子动力学模拟，同时每10 ps对结构坐标进行一次保存，利用MM/GBSA方法计算蛋白质与配体之间的平均结合自由能。

2.2.2. 细胞实验

1. 细胞培养

首先将手术切除的翼状胬肉组织在无菌条件下用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)冲洗，将翼状胬肉组织切成小块，在含有10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基中，培养皿转移至设定条件为37℃、含5% CO₂的细胞培养箱中进行培养。在培养过程中，需每2~3天更换一次新鲜的培养基。当细胞繁殖至合适密度时，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞进行传代，后续的实验操作采用第3~5代的HPF细胞。

2. 细胞鉴定

将HPF细胞接种于12孔板中，HPF细胞密度达到80%左右时，弃培养基且PBS浸洗后用4%多聚甲醛室温固定细胞、0.5%曲拉通X-100室温通透、封闭1 h后加入5% BSA稀释的山羊抗兔抗体(1:200)、5% BSA稀释的山羊抗兔抗体(1:200)，4℃培养过夜。第二天加入用5% BSA稀释的Alexa Fluor 488标记山羊抗鼠IgG二抗(1:200)，避光孵育1 h。再加入DAPI (DAPI Staining Solution)避光孵育10 min。最后PBS浸洗，调试荧光显微镜发射波长为488 nm时，观察蛋白的表达情况。

3. CCK8法检测HPF细胞增殖情况

以5 × 10³个/孔的密度将HPF细胞接种于96孔板，设置3个复孔。贴壁过夜，向96孔中加入不同华蟾酥毒基浓度(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol∙L⁻¹)培养基。华蟾酥毒基处理HPF细胞0 h、24 h、48 h和72 h后吸除培养基，向培养孔中加入含10% CCK8反应液的培养基，孵育1.5 h后使用酶标仪在450 nm处测量吸光度。使用GraphPad 7.0软件计算细胞活力并筛选细胞活力为50%的药物浓度(半数抑制浓度)。依据半数抑制率计算高、中、低浓度组，同时设对照组(不含华蟾酥毒基)。

4. 实时荧光定量PCR检测各组HPF细胞PCNA、m-TOR、MDM2、bax以及bcl-2 mRNA表达

各组HPF细胞经相应浓度华蟾酥毒基处理48 h后按照RNA提取试剂盒DNase反转录试剂盒说明书提取细胞总RNA、反转录为cDNA；按照荧光定量试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR反应。使用2-∆∆CT法计算目标基因的相对表达量。引物序列见表1。

Table 1. Primer sequences

表1. 引物序列

目的基因名称	上下游引物序列
β-actin
For: 5′-3′ AACCGCGAGAAGATGACCCAG	Rev: 5′-3′ GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA
PCNA
For: 5′-3′ CGAGCACTGCCCAACAACAC	Rev: 5′-3′ TGGCGGGAGGTAGACTGACC
mTOR
For: 5′-3′ ATGCTTGGAACCGGACCTG	Rev: 5′-3′ TCTTGACTCATCTCTCGGAGTT
MDM2
For: 5′-3′ GGCAGGGGAGAGTGATACAGA	Rev: 5′-3′ CAGCGGTAGGTGTCGAAGC
Bax
For: 5′-3′ CGAACTGGACAGTAACATGGAGG	Rev: 5′-3′ CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA
Bcl-2
For: 5′-3′ GACTTCGCCGAGATGTCCAG	Rev: 5′-3′ GAACTCAAAGAAGGCCACAATCG

5. 统计学方法 采用GraphPad Prism 9.0.0统计软件进行分析，计量资料以平均数 ± 标准差($\overline{x}\pm s$ )表示，组间比较采用单因素方差分析，方差不齐采用非参数检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 中药成分相关靶点、疾病相关靶点与中药疾病交集靶点获取

使用Swiss Target Prediction、SEA、HERB、STITCH、SuperPred、Pharmmapper数据库共获得华蟾酥毒基中潜在活性成分相关靶点278个。使用Genecards数据库OMIM数据库和HERB数据库共得到翼状胬肉相关靶点616个。经过交集分析，最终确定了36个与华蟾酥毒基和疾病翼状胬肉共有的靶点，如图1所示。

Figure 1. Intersection targets between cinobufagin and pterygium

图1. 华蟾酥毒基与翼状胬肉交集靶点

3.2. 蛋白互作网络构建与分析

使用String蛋白互作分析平台构建PPI蛋白互作网络，把Organism设置为Homo sapiens，且minimum required interaction score设置为0.400大小，由此可以得到PPI蛋白互作网络文件如下图2。最终得到华蟾酥毒基治疗翼状胬肉可能涉及的5个核心靶点，分别为AKT1、MTOR、BCL2、PIK3CA和MDM2。各靶点的degree值、Closeness centrality值以及Betweenness centrality值详见表2。

Figure 2. Key targets of cinobufagin in the treatment of pterygium

图2. 华蟾酥毒基治疗翼状胬肉的关键靶点

Table 2. Information related to the involved targets

表2. 涉及靶点相关信息

靶点	Degree	Closeness centrality	Betweenness centrality
AKT1	29	0.853659	0.109187
MTOR	28	0.813953	0.051011
BCL2	28	0.833333	0.084158
PIK3CA	28	0.813953	0.092162
MDM2	26	0.777778	0.024157
STAT3	24	0.744681	0.017257
MYC	23	0.714286	0.009657
IGF1R	23	0.729167	0.026688
MAPK1	22	0.714286	0.033546
KDR	22	0.714286	0.011483

在Cytoscape软件中，将筛选出的靶点作为网络节点，并根据它们之间的相互作用关系绘制连接线，最终形成了如图3所示的“华蟾酥毒基–靶点–翼状胬肉–信号通路”网络图。

Figure 3. “Cinobufagin-Target-Pterygium-Signaling Pathway” network

图3. “华蟾酥毒基–靶点–翼状胬肉–信号通路”网络

3.3. 药物–疾病关键靶点的功能与通路的分析

按照-logP (value)大小与富集基因数多少的顺序从GO分析共富集到与交集靶点相关Biological process (BP)、Cellular component (CC)和Molecular function中选择前十个条目绘制GO气泡图，如图4。发现BP与上皮细胞增殖(epithelial cell proliferation)相关性最高；CC与膜的外源成分(extrinsic component of membrane)相关性最高；MF与蛋白酪氨酸激酶活性(protein tyrosine kinase activity)和蛋白丝氨酸激酶活性(protein serine kinase activity)高度相关。

Figure 4. GO bubble chart

图4. GO气泡图

KEGG分析共富集到与交集靶点取前30个相关信号通路绘制KEGG柱状分类图，如下图5。结果显示，华蟾酥毒基治疗翼状胬肉所涉及的最核心的信号通路为PI3K/AKT signaling pathway信号通路。

Figure 5. KEGG bar classification chart

图5. KEGG柱状分类图

3.4. 分子对接

将华蟾酥毒基与翼状胬肉核心靶点蛋白：AKT1、BCL2、EGFR、IGF1R、KDR、MAPK1、MDM2、MTOR、MYC、PIK3CA和STAT3依次分别进行分子对接，结果见表3。

Table 3. Molecular docking results of cinobufagin with key targets

表3. 华蟾酥毒基与关键靶点对接结果

靶点	MTOR	IGF1R	MAPK1	BCL2	MDM2	STAT3	KDR	PIK3CA	AKT1	MYC
结合能/(kcal mol^−^1)	−9.5	−9.1	−9.0	−8.7	−8.3	−8.3	−7.8	−7.6	−6.8	−6.6

Figure 6. Binding mode of cinobufagin with the core target protein

图6. 华蟾酥毒基与核心靶点蛋白的结合模式

本次对接结合能均小于−5 kcal∙mol⁻¹，说明AKT1、BCL2、EGFR、IGF1R、KDR、MAPK1、MDM2、MTOR、MYC、PIK3CA和STAT3蛋白与华蟾酥毒基之间均具有较好结合。其中MDM2与mTOR的结合能低于−8.3 kcal∙mol⁻¹，说明MDM2与mTOR与华蟾酥毒基之间均具有很强的结合作用，华蟾酥毒基是很有可能对mTOR和MDM2的结构功能与生物活性产生影响。使用PyMOL2.3.0软件对这两组分子对接结果进行可视化，详细对接情况如图6所示。

3.5. 分子动力学模拟

华蟾酥毒基及其靶点进行了MD模拟验证。RMSD曲线显示，MDM2和MTOR组在10 ns和40 ns后分别达到稳定状态，波动小于1 nm，表明与华蟾酥毒基形成的复合物稳定性良好。RMSF曲线进一步确认，华蟾酥毒基对MDM2和MTOR蛋白氨基酸残基稳定性影响甚微。回转半径Rg结果显示，MDM2和MTOR与华蟾酥毒基复合物的Rg值分别稳定在1.3 nm和2.7 nm左右，全程稳定。氢键分析显示，MDM2与华蟾酥毒基间氢键数量少，而MTOR与华蟾酥毒基间氢键数量稳定在1~2个，形成更稳定结合。SASA曲线表明，两者与华蟾酥毒基复合物的SASA值分别稳定在60 nm²~70 nm²和280 nm²~300 nm²，全程波动小。再次验证了复合物的稳定性，见图7。

Figure 7. Interaction of cinobufagin with mTOR and MDM2 complexes

图7. 华蟾酥毒基与mTOR和MDM2复合体的相互作用

自由能分布图(FEL)显示，MDM2和MTOR蛋白与华蟾酥毒基复合物均形成单一最小能量团簇，表明复合物稳定性好，见图8(A)。平均结合自由能分别为−30.29和−26.81 kcal∙mol⁻¹，验证了强烈结合，见图8(B)。MDM2中ILE-99、TYR-67、ILE-61与华蟾酥毒基结合紧密，MTOR中GLN-2200亦贡献显著，见图8(C)。氨基酸残基能量贡献与分子对接结果一致，结合位置稳定。分子动力学模拟五个时刻构象对比显示，华蟾酥毒基与MDM2和MTOR蛋白结合位置无大变化，复合物稳定性高，见图8(D)。

注：MDM2 (左)和MTOR (右)。

Figure 8. A: Free energy distribution plot of the protein-cinobufagin complex. B: Average binding free energy of the protein with cinobufagin. The terms VDWAALS, EEL, EGB, ESURF, GGAS, GSOLV, and TOTAL represent van der Waals forces, electrostatic energy, polar solvation energy, non-polar solvation energy, molecular mechanics energy, solvation energy, and average binding free energy, respectively. C: Energy contributions of amino acid residues in the protein that are involved in cinobufagin binding. D: Comparison of molecular dynamics simulation results with the structure of cinobufagin at five time points. The molecular structures depicted in red, green, blue, yellow, and orange correspond to the cinobufagin small molecule structures at 0, 25, 50, 75, and 100 ns, respectively

图8. A：蛋白与华蟾酥毒基的复合物的自由能分布图。B：蛋白与华蟾酥毒基的平均结合自由能。VDWAALS、EEL、EGB、ESURF、GGAS、GSOLV、TOTAL分别代表范德华力、静电能、极性溶剂化能、非极性溶剂化能、分子力学项、溶剂化能项和平均结合自由能。C：蛋白中参与华蟾酥毒基结合的氨基酸残基能量贡献。D：分子动力学模拟结果与华蟾酥毒基五个时刻的结构对比图中红绿蓝黄橙分子结构分别对应0, 25, 50, 75, 100 ns五个时刻的华蟾酥毒基小分子结构

3.6. HPF细胞的培养、鉴定

在组织碎块培养的第3至第5天，长梭形细胞开始从组织块的边缘迁出。到第3代时，细胞呈现出形态一致的长梭形。通过免疫荧光染色分析，细胞显示出波形蛋白的阳性表达(见图9(A))，而广谱细胞角蛋白则为阴性表达(见图9(B))。结合组织来源、细胞形态观察结果以及免疫荧光染色结果，确认本研究中培养的细胞为HPF细胞。

Figure 9. Identification results of human pterygium fibroblast cells

图9. HPF细胞的鉴定结果

3.7. 华蟾酥毒基对HPF细胞增殖的影响

与对照组相比，华蟾酥毒基在浓度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol∙L⁻¹时，作用48 h和72 h均能显著抑制HPF细胞的增殖(P < 0.05)。然而，在作用24 h时，除0.05 μmol∙L⁻¹浓度外，其他浓度均表现出统计学显著性差异(见图10)。在后续实验中，将浓度分为低、中、高三个水平(分别为0.1 μmol∙L⁻¹、0.2 μmol∙L⁻¹、0.4 μmol∙L⁻¹)，作用时间设定为48 h，并设立不含华蟾酥毒基的对照组。

注：与空白组比较ns无差异，^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001，****P < 0.0001 (图11同)

Figure 10. Effects of Cinobufagin on the Viability of Human Pterygium Fibroblast Cells ($\overline{x}\pm s$ , n = 3)

图10. 华蟾酥毒基对HPF细胞活力的影响($\overline{x}\pm s$ , n = 3)

3.8. 华蟾酥毒基对PCNA、mTOR和MDM2 mRNA表达的抑制作用及其对HPF细胞增殖的影响

与对照组相比，0.1 μmol∙L⁻¹华蟾酥毒基处理组的mTOR mRNA表达差异无统计学意义(P > 0.05)。然而，在0.4 μmol∙L⁻¹华蟾酥毒基处理组中，PCNA、mTOR、MDM2和BCl-2 mRNA的表达显著下调，同时Bax mRNA的表达显著上调(P < 0.05)。因此我们推测，华蟾酥毒基对细胞增殖的抑制作用可能与其对mTOR和MDM2 mRNA表达的下调有关(见图11)。

Figure 11. Cinobufagin downregulates the expression levels of PCNA, mTOR, MDM2, and Bcl-2 while upregulating the expression of Bax ($\overline{x}\pm s$ , n = 3)

图11. 华蟾酥毒基下调PCNA、mTOR、MDM2、Bcl-2并上调Bax的表达水平($\overline{x}\pm s$ , n = 3)

4. 讨论

翼状胬肉是一种常见的眼表疾病，通常发生在眼球的鼻侧。普遍认为，紫外线辐射、炎症反应以及上皮–间质细胞转化等因素可能是其发病的主要原因[11] [12]。目前，翼状胬肉的治疗通常采用翼状胬肉切除术结合结膜瓣移植术。然而，该方法的复发率较高，并可能引发多种并发症。因此，开发新的、有效的翼状胬肉治疗方法至关重要。在中医药领域治疗增殖性疾病方面具有独特的优势，常被单独或联合应用于此类疾病的治疗。华蟾酥毒基是一种从蟾酥中提取的高活性单体成分，近年来的研究表明其在多种增殖性疾病中具有显著的抗增殖作用。例如，在肝癌细胞中，华蟾酥毒基通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路来抑制细胞增殖[13]，或通过抑制AURKA-mTOR-eIF4E轴发挥抗肿瘤作用[14]。在结直肠癌细胞中，它不仅有效抑制细胞增殖[15]，还抑制新生血管的形成[16]。此外，华蟾酥毒基在鼻咽癌中显著降低了癌细胞的迁移、侵袭和转移能力[17]，并在改善脂多糖诱导的急性肺损伤方面表现出潜力[18]。在眼科的病例报道中，华蟾酥毒基能够抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的活性并诱导其凋亡[19]。翼状胬肉作为一种具有肿瘤样特征的增殖性疾病，其病理变化与肿瘤相似[20] [21]。然而，目前尚无关于华蟾酥毒基在翼状胬肉中的研究报道，其作用的关键成分和作用机制仍有待进一步阐明。

本研究通过实验首次验证了华蟾酥毒基对HPF细胞的生物学效应。首先，利用CCK-8细胞活性测定，确认了华蟾酥毒基对HPF细胞活力的显著抑制作用。通过RT-qPCR分析，作者观察到随着药物浓度的增加，PCNA的mRNA含量呈下降趋势，Bcl-2的mRNA含量表达呈下降趋势，而Bax的mRNA含量则显著上升。这些数据表明，华蟾酥毒基能够有效抑制PCNA和Bcl-2的表达。PCNA作为细胞增殖的标志物，其表达的剂量依赖性下调可能暗示细胞生长途径受到抑制；Bcl-2的持续降低则表明凋亡过程被促进，细胞存活信号受到抑制；而促凋亡基因Bax的显著上调进一步表明凋亡途径被强烈激活，增强了Bax的促凋亡作用。以上细胞实验结果表明，华蟾酥毒基能够有效抑制HPF细胞的增殖，且使凋亡基因表达升高，抗凋亡基因表达下降。这一发现为华蟾酥毒基在翼状胬肉治疗中的潜在应用提供了新的视角。

结合网络药理学，明确华蟾酥毒基抑制翼状胬肉中的核心靶点，本研究利用TCMSP数据库进行了潜在作用靶点的PPI网络分析，最终确定了五个关键靶点：AKT1、mTOR、BCL2、PIK3CA和MDM2，这些核心靶点可能是华蟾酥毒基治疗翼状胬肉的重要治疗靶点。这些核心靶点与翼状胬肉的增殖、凋亡和迁移等过程密切相关。其中，mTOR作为华蟾酥毒基抗翼状胬肉的最重要靶点之一，它与翼状胬肉的发生和发展密切相关，并能够调控HPF细胞的增殖和纤维化[12]。MDM2作为一种E3连接酶，其在翼状胬肉中的水平显著高于正常结膜[20]。MDM2能够泛素化p53蛋白，导致其被蛋白酶体降解，从而维持p53蛋白在较低水平[21]。MDM2和mTOR都是细胞增殖的重要调节因子，值得注意的是，它们在肿瘤及其他增殖性疾病中也被广泛研究。通过KEGG富集分析，确定了PI3K/Akt信号通路及其下游潜在靶点的相关性最为显著。分子对接结果显示，华蟾酥毒基与mTOR、MDM2、Bcl-2、AKT和PI3K的结合能较高。通过分子动力学模拟，进一步确认华蟾酥毒基能够与mTOR和MDM2紧密结合。RT-qPCR结果分析，华蟾酥毒基干预HPF细胞后，mTOR和MDM2的mRNA含量表达则显著上升。这与分子对接和分子动力学模拟结果相符。表明显示出该方法在药物靶向预测方面的巨大潜力。然而，本研究在深入机制探索方面存在一定的局限性。我们计划在未来的研究中，通过更精细的实验设计和更深入的机制分析，来弥补当前的不足，以期在翼状胬肉药物研发领域取得更具突破性的进展。

综上所述，本研究首次通过体外实验验证了华蟾酥毒基对HPF细胞的生物学效应及其相关靶点。研究结果表明，华蟾酥毒基能够抑制HPF细胞的增殖，上调Bax基因表达，并下调Bcl-2、mTOR和MDM2的基因表达，从而抑制翼状胬肉的生长。通过网络药理学筛选，进一步确认了其相关靶点，并利用分子动力学模拟验证了华蟾酥毒基与mTOR和MDM2复合物之间的高结合亲和性和结构稳定性。这些研究发现为翼状胬肉的药物治疗提供了重要的参考和借鉴。

基金项目

国家自然科学基金(82060171)；2024年石河子大学第一附属医院院级课题(LC2023020)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。