1. 引言
子宫内膜癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤，也是发达国家影响女性人群的第四大恶性肿瘤[1] [2]。子宫内膜腺癌是最常见的子宫内膜癌，占所有病例的80%，由子宫内膜样组织肿瘤组成。Shermann等[3]提出子宫内膜癌是在富含雌激素的状态中从增生的腺上皮发展而来。宫腔镜诊断子宫内膜增生或腺癌的敏感性为86.4%左右，最终需要组织病理学证实[4]。因此，确定新的潜在的生物标志物至关重要。
PIWI相互作用RNA (piRNA)是睾丸生殖细胞中特异性结合PIWI家族蛋白的小非编码RNA [5]，长度约为30个nt左右。piRNA在正常体细胞和癌细胞中均有效表达[6]。piRNA可以通过调控基因转录和转录后水平，影响癌细胞的凋亡、增殖、迁移和侵袭等多种过程[7]-[9]。本文通过piRNA表达谱测序得到子宫内膜癌中低表达水平的piR-34377，进一步分析piR-34377在69例子宫内膜癌组织中的表达以及与临床病理特征和生存预后的关系。
2. 资料与方法
2.1. 一般资料
本研究选取了2018年1月至2020年3月期间，在扬州大学附属医院接受手术治疗的69例子宫内膜腺癌患者作为研究对象。收集子宫内膜癌组织及癌旁正常组织和临床病理资料。纳入标准：① 临床资料完整，病理诊断为子宫内膜腺癌；② 术前未接受化疗、放疗和免疫治疗；③ 患者同意并能进行随访。排除标准：① 合并其他恶性肿瘤患者；② 血液类系统疾病以及免疫类系统疾病患者。本研究已获得扬州大学医学伦理委员会的批准(YXYLL2021-158)。本研究获得患者及其家属知情并同意。
2.2. 人piRNA表达谱测序
提取3例胃腺癌组织和癌旁正常组织的总RNA，将提取的RNA提交给上海康成生物工程技术有限公司(中国上海)进行Arraystar piRNA微阵列筛选和表达谱分析。人类Arraystar piRNA阵列(Arraystar, Rockville, MD)用于本研究，该阵列设计用于分析23,000个人类piRNA。数据分析和图像采集由上海康成生物科技有限公司提供。
2.3. 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)实验
首先使用Trizol法萃取子宫内膜癌组织的总RNA，测定RNA浓度并记录保存。使用cDNA合成试剂盒将上述提取的总RNA反转录为cDNA。反应管内容物：试剂盒混合液Mix 2 μL + 总RNA 0.5 μg，然后用ddH2O加满置10 μL，反应条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，得到cDNA。使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR反应(Vazyme生物公司，南京)。每个反应管内容物：2 × ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL + Primer 1 (10 µM) 0.4 μL + Primer 2 (10 µM) 0.4 μL +50 × ROX Reference Dye 1 0.4 μL + Template DNA/cDNA 1 μL + ddH2O 7.8 μL共计20 μL。同样重复的反应管3个。qRT-PCR实验条件：预变性95℃，30秒；然后95℃ 5秒→60℃ 30秒，共计40个PCR扩增循环，内参为U6。所得实验数据均与内参对比后再进行统计分析。
2.4. 随访
对69例患者以门诊或者电话等方式进行随访。随访时间从患者住院接受手术之日起，至死亡或2024年12月末次终止。随访的病例无失访，其中61例存活、8例死亡。
2.5. 统计学处理
统计数据分析使用的是SPSS 22.0和Graph Pad 8.0软件。分类资料采用[例(%)]表示，两组间比较采用Pearson’s法χ2检验。生存分析则通过Kaplan-Meier生存曲线统计。*，P < 0.05为差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. piRNA表达谱测序结果
Figure 1. piRNA expression profile sequencing results
图1. piRNA表达谱测序结果
利用Arraystar nrStarTM piRNA PCR Arrays芯片检测3例子宫内膜癌组织及其癌旁正常组织中piRNAs的差异性表达。候选piRNAs的选择标准包括：I) 在癌症组织中piRNAs表达强度 > 1500；II) 其在癌症组织中的表达倍数高于邻近正常组织2.4倍以上；III) P < 0.05。在该选择之后，由此得到八个差异性表达的piRNAs，其中高表达水平包括piR-36717，piR-60668，piR-31612，piR-33043，piR-31638和piR-35550，低表达水平包括piR-34377和piR-34653 (图1)。本文选择2个低表达水平的piRNA进行验证。
6个piRNAs表达水平升高、2个piRNAs表达水平下降。
3.2. 69例子宫内膜癌组织中piR-34377的表达水平
对于piRNA表达谱测序结果中2个低表达的piRNA，我们在69例子宫内膜腺癌组织中进行了qRT-PCR验证，实验结果如图2所示，piR-34377 (1.962 ± 0.1152)表达水平明显低于癌旁正常组织(4.337 ± 0.2228)，t = 8.976，P < 0.0001。piR-34653 (3.034 ± 0.2210)表达水平与癌旁正常组织(3.597 ± 0.2318)相比无统计学差异，t = 1.575，P > 0.05。该实验提示piR-34377在子宫内膜腺癌中发挥肿瘤抑制基因的作用。
Figure 2. piR-34377 expression levels in 69 cases of endometrial carcinoma
图2. 69例子宫内膜癌组织中piR-34377的表达水平
在69例胃腺癌中piR-34377表达水平明显低于癌旁正常组织；piR-34377表达水平与癌旁正常组织无统计学差异。* P < 0.05，NS P > 0.05。
3.3. piR-34377表达与患者临床病理特征的关联
根据piR-34377在69例子宫内膜腺癌组织中RNA表达水平，将病例分为低表达组(表达水平低于对照组) 50例和正常表达或高表达组(表达水平等于或高于对照组) 19例，四格交叉表统计结果(表1)表明piR-34377表达与淋巴结转移、临床病理分期相关(均P < 0.05)，与年龄、肌层浸润深度、分化程度等无关(P > 0.05)。
Table 1. Correlation analysis between piR-34377 and clinicopathological data of patients with endometrial cancer
表1. piR-34377与子宫内膜癌患者临床病理资料相关性分析
病理参数 |
piR-34377低表达(n = 50) |
piR-34377正常表达或高表达(n = 19) |
χ2值 |
P值 |
年龄(岁) |
<50 |
12 |
7 |
1.138 |
0.286 |
≥50 |
38 |
12 |
肌层浸润深度 |
≤50% |
22 |
8 |
0.020 |
0.887 |
>50% |
28 |
12 |
分化 |
高 |
23 |
12 |
1.622 |
0.203 |
中–低 |
17 |
7 |
淋巴结转移 |
有 |
33 |
6 |
6.638 |
0.010* |
无 |
17 |
13 |
TNM分期 |
Ⅰ + Ⅱ |
16 |
13 |
7.496 |
0.006* |
Ⅲ + IV |
34 |
6 |
注：*P < 0.05。
3.4. piR-34377表达与患者生存预后关系
69例患者中，随访时间10~84个月，piR-34377低表达患者中，生存16例，失访1例，死亡33例，5年生存率为47.06%；piR-34377正常或高表达患者中5年内生存13例，死亡6例，5年生存率为68.42%，piR-34377低表达患者5年生存率显著低于piR-34377正常或高表达患者(P < 0.05) (图3)。
Figure 3. Curve of piR-34377 expression and postoperative survival
图3. piR-34377表达与患者术后生存曲线图
3.5. Cox回归分析影响子宫内膜癌患者预后的危险因素
单因素分析结果显示，淋巴结转移、临床病理分期、piR-34377表达水平可能影响到患者预后(均P < 0.05)；将单因素中具有统计学意义的纳入多因素Cox回归分析，结果显示，淋巴结转移和piR-34377表达水平可能是影响子宫内膜腺癌预后的独立危险因素(P < 0.05) (表2)。
Table 2. Univariate and multivariate analysis of prognostic factors in patients with endometrial cancer
表2. 单因素和多因素分析子宫内膜癌患者预后影响因素
变量 |
单因素分析 |
多因素分析 |
|
SE |
HR |
95% CI |
P |
SE |
HR |
95% CI |
P |
年龄 |
0.661 |
0.942 |
0.258~3.433 |
0.927 |
|
|
|
|
肌层浸润深度 |
0.563 |
0.329 |
0.112~0.985 |
0.059 |
|
|
|
|
淋巴结转移 |
0.599 |
0.275 |
0.089~0.881 |
0.030 |
0.601 |
0.398 |
0.110~1.412 |
0.041 |
分化程度 |
0.656 |
0.618 |
0.169~2.298 |
0.473 |
|
|
|
|
临床病例分期 |
0.592 |
0.316 |
0.097~0.992 |
0.038 |
|
|
|
|
piR-34377 |
0.814 |
0.188 |
0.036~0.952 |
0.041 |
0.799 |
0.178 |
0.031~0.941 |
0.021 |
4. 讨论
piRNA是长度为24~32个核苷酸的非编码调控RNA。piRNA在胚胎发育过程中至关重要，可以保持生殖细胞系DNA的完整性，沉默可转座元件的转录，诱导异染色质，生育力和性别决定[10] [11]。最近研究发现piRNA水平的改变与多种恶性肿瘤的发生发展有关，如乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌和膀胱癌等。piRNA既可以作为肿瘤抑制因子，也可以作为肿瘤促进因子[12]-[15]。piRNA作为癌症诊断工具、治疗靶点和预后标志物的临床意义也有报道[16] [17]，这些发现表明piRNA通路可能参与了癌症发展的机制。子宫内膜癌是一种常见的女性生殖系统恶性肿瘤[1]。当前，该癌症的主要治疗方法包括手术、化疗和放疗等[18]。然而术后复发和转移是患者的死亡原因[19]。因此，探索新的生物标志物以改善子宫内膜癌的诊断和预后评估显得尤为重要。
本研究通过piRNA表达谱基因芯片得到子宫内膜腺癌中表达水平下调的piR-34377并在69例子宫内膜腺癌中得到了证实，表明piR-34377在子宫内膜腺癌中发挥肿瘤抑制基因的作用。分析piR-34377表达与临床病理资料的相关性分析发现子宫内膜癌中piR-34377表达水平越高，肿瘤不容易出现淋巴结转移，且临床分期较好，且患者的生存预后时间较长；多因素Cox回归分析显示淋巴结转移和piR-34377表达水平可能是影响子宫内膜腺癌预后的独立危险因素。以上研究表明piR-34377可能是淋巴结转移和预后判断的分子指标，也可以认为是治疗子宫内膜癌临床治疗提供潜在分子靶点。
综上所述，在组织中piR-34377表达水平下调，发挥抑癌基因的作用，piR-34377表达与淋巴结转移和分期和不良预后密切相关。本研究为临床提供了子宫内膜腺癌潜在的预后评估指标，为制定个体化治疗提供了策略。
NOTES
*通讯作者。