1. 引言
糖尿病(diabetic mellitus, DM)是一种由于胰岛素相对或绝对不足引起血糖增高为特征的慢性代谢性疾病。据估计，全球目前约有3.87亿糖尿病患者，预计到2035年将增至5.92亿人[1]。我国大约有9200万患者和1.5亿临床前期个体，DM及其相关并发症的治疗给国家和社会带来了巨大的财政负担[2]。无论是1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM)还是2型糖尿病(T2DM)，持续的高血糖状态最终可导致全身多器官受损。其中，糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常见且致残的微血管并发症之一，严重威胁患者视力，对患者的生活质量造成重大影响。已有研究表明，糖尿病发病10年后，约有50%的T2DM和70%的T1DM患者将发展为DR [3]。
DR的发病原因复杂，作为DR的始动因素，高血糖对视网膜毒性的机制包括：低氧的局部微环境、非酶糖基化致糖基化终末产物形成(advanced glycation end products, AGEs)、增强的过氧化反应及过氧化产物生成、内质网应激以及多元醇通路、甘油二酯/蛋白激酶C通路(protein kinase C, PKC)、血管紧张素系统(reninangiotensin system, RAS)和血管激肽系统的激活等[4]。但单一的机制并不能完全解释DR的发病机理，因此仍需更进一步的研究。
长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一种超过200个核苷酸的非蛋白编码转录产物，近年来的研究发现，lncRNA参与了许多疾病的进程，包括肿瘤、心脏疾病及眼部疾病[5] [6]。LncRNA H19是一种定位于人类11号染色体的印记基因，其在胚胎形成时大量表达，并随着年龄的增长而表达急剧下降[6]。有研究发现DM患者外周血中的H19含量显著升高，表明其与DM的疾病发展有关[7]，同时，也有研究表明，在DM患者骨骼肌中的H19含量却是下降的，并通过影响脂质代谢的通路而导致胰岛素抵抗[8]。而在DR中，H19是否对眼部病变存在调控作用仍未知，需进一步研究[9]。
目前DR的治疗主要是针对导致危及视功能的视网膜并发症，治疗手段包括玻璃体内注射抗血管内皮生长因子A (vascular endothelial growth factor A, VEGFA)和或类固醇激素等药物、以及全视网膜光凝、玻璃体切除手术等。尽管这些治疗能有效地延缓DR的进展，但仍然不能完全消除视力丧失的风险。而且抗VEGFA治疗还存在一些缺点，如药物抵抗、加重高危人群的心脑血管缺血事件等全身毒副作用、以及对非VEGFA依赖的血管增殖机制无效等[3]。同时，上述治疗对轻度和中度的非增殖期DR (nonproliferative DR, NPDR)并不适合，因为其风险显著大于患者获益，目前可用于NPDR的药物主要有递法明及羟苯磺酸钙，均可对视网膜血管发挥保护作用，其中羟苯磺酸钙可通过减少视网膜自由基、抑制醛糖还原酶、减少白细胞聚集等途径治疗DR，但也存在许多副作用，如发热、胃肠道反应、皮疹、关节疼痛甚至罕见的粒细胞缺乏症等[10]，因此，积极寻找能够延缓乃至阻止NPDR进展、针对增殖期DR (proliferative DR, PDR)的多靶点药物(尤其是副作用小的药物)而阻止DR的进展显得尤为迫切。
有研究表明在增生性玻璃视网膜病变中，H19、miR-29b及VEGFA之间存在相互调控关系[11]，但其在DR中的作用机制仍未完全阐明。因此，本研究将进一步探讨其相互作用机制，并使用胡椒碱干预，以期为DR的临床治疗及新型药物的开发提供理论依据与实验基础。
2. 材料与方法
2.1. 细胞培养
D407细胞系购自雅吉生物公司(上海，中国)，并使用免疫荧光法对细胞进行了鉴定(图1(A))。细胞培养于含10%胎牛血清及1%双抗(vol./vol.; Gibco)的DMEM (含5 mM D-葡萄糖，Gibco, CA, USA)培养液中，温度37℃，置于5% CO2的恒温培养箱中。细胞在10 cm培养皿中培养并每2天换液，然后被接种于不同的培养皿中进行后续实验。以含25 mM D-葡萄糖的DMEM培养液+ 5% O2的培养箱中培养24小时建立糖尿病视网膜病变细胞模型，以含5 mM D-葡萄糖的DMEM培养液为正常糖对照，以含5 mM D-葡萄糖及20 mM甘露醇的DMEM培养液为高渗对照。由此，将细胞实验分为8组，正常糖对照组(normal glucose control, NG)，正常糖 + 低氧对照组(NG-low oxygen, NG-LO2)、高渗 + 低氧对照组(hyperosmosis-LO2, HO-LO2)、高糖 + 低氧对照组(high glucose-LO2, HG-LO2)、乙醇溶剂对照组(HG-LO2-alcoh)、1 μM胡椒碱组(piperine, PIP1)、10 μM胡椒碱组(PIP10)和100 μM胡椒碱组(PIP100)。其他平衡液体化合物购自中国医药集团责任有限公司(上海，中国)。
2.2. 细胞活性分析
依据制造商提供的实验步骤，应用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8, CCK8；七海生物，上海，中国)研究胡椒碱(MedChemExpress, NJ, USA)、低氧环境及高糖环境下的细胞活性。简要流程如下：依据不同的实验要求，将5 × 103 cells/孔接种于96孔板，然后加入不同浓度的胡椒碱或低氧 + 高糖分别培养24或48小时。培养后，每孔加入10 μL CCK8试剂并继续培养1小时。设置一列无细胞培养基作为背景对照，使用酶标仪在450 nm波长下读取各孔的光密度(Optical density, OD)值。细胞活性按以下公式计算：[(ODdurg − ODbackground)/(ODsolvent − ODbackground)] × 100%。
2.3. 实时定量PCR检测
按生产商的操作流程，D407细胞的总RNA使用TRIzol (Thermo Fisher Scientific, CA, USA)提取；miRNA使用PureLink miRNA分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific, CA, USA)提取。使用普通逆转录试剂盒(诺唯赞生物，南京，中国)或茎环法MicroRNA逆转录试剂盒(锐博生物，广州，中国)将等量的RNA逆转录为cDNA。使用StepOne Plus Real-Time PCR系统(Thermo Fisher Scientific, CA, USA)及荧光PCR试剂盒(诺唯赞生物，南京，中国)，在20 μL体系及特定的引物下对cDNA进行扩增。使用引物如表1所示。2步法的热循环条件为：DNA聚合物95℃活化20 s，分别于95℃ 3 s及65℃ 30 s退火及延伸，共40个循环。扩增特异性由溶解曲线分析确认。β-actin或U6作为目标RNA或miRNA的内参，并使用相对Ct值(2−ΔΔCt)法计算特定基因的转录水平。
Table 1. Primers used in quantitative real-time PCR amplification
表1. 实时定量PCR使用引物序列
Gene symbol |
Forward 5′-3′ |
Reverse 5′-3′ |
VEGFA |
CGAAACCATGAACTTTCTGC |
CCTCAGTGGGCACACACTCC |
H19 |
AAATGGTGCTACCCAGCTCA |
TCCAGAGCCGATTCCTGAGT |
β-actin |
GGCATGGGTCAGAAGGATT |
TGGTGCCAGATTTTCTCCA |
hsa-miR-29b-3p |
CGGCTAGCACCATTTGAAATC |
ACTGCAGGGTCCGAGGTATT |
U6 |
CTCGCTTCGGCAGCACA |
AACGCTTCACGAATTTGCGT |
hsa-miR-29b-3p-RT |
GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGACAACACT |
2.4. 细胞免疫荧光
将D407细胞接种于含细胞爬片的24孔板中，按照特定的实验目的处理细胞后，使用多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)固定细胞15分钟。去除固定液，磷酸盐冲液(phosphate buffer saline, PBS)洗涤后，再用0.2%的Triton X-100室温通透5分钟，然后用10%小牛血清封闭60分钟，使用视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞抗体RPE65 (ab231782, Abcam, Cambridge, England)或VEGFA (ab51745, Abcam, Cambridge, England) 4℃过夜孵育。去除一抗并洗涤后，加入荧光二抗(#11005, Thermo, MA, USA)室温避光孵育90分钟后洗涤，再加入DAPI避光孵育5分钟后PBS洗涤，滴抗荧光猝灭封片液并封片，使用荧光显微镜(Zeiss, Jena, Germany)观察细胞。使用ImageJ软件(National Institute of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/)计算细胞质内的平均光密度值(average optical density, AOD)。
2.5. 蛋白质免疫印迹(Western Blot, WB)实验
使用标准化的WB法进行分析。简要步骤为：细胞由含蛋白酶及磷酸酶抑制剂(Thermo, MA, USA)的RIPA (碧云天生物，上海，中国)进行裂解。裂解后的蛋白离心后取上清并使用双吡啶甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白定量试剂盒(联科生物，杭州，中国)进行定量。然后35 μg~40 μg的总蛋白在4%~12%的FuturePAGE蛋白预制胶(伯仪生物，苏州，中国)中电泳分离并电转膜至NC膜(Merck Millipore, MA, USA)上。5%脱脂牛奶室温封闭1小时后，使用以下抗体4℃孵育过夜：AKT (#4691, CST, USA)，phospho-AKT (Ser473) (#9271, CST, USA)，ERK1/2 (#4695, CST, USA)，phospho-p44/42 ERK1/2 (#4370, CST, USA)，GAPDH (#5174, CST, USA)。0.1% PBST洗涤后，室温下以HRP包被羊抗兔二抗(A-11012, ThermoFisher Invitrogen, MA, USA)孵育1小时。洗涤后，使用WB显影液(Millipore, MA, USA)进行孵育显影。条带密度在Gel Doc 1000显影系统(Bio-Rad, CA, USA)检测并使用ImageJ软件进行分析。计算每个条带的积分光密度值(integrated optical density, IOD)并使用GAPDH的值进行标准化(相对IOD值，relative IOD, RIOD)。
2.6. 细胞迁移实验
细胞迁移能力通过划痕实验进行评估。简要流程如下：将D407细胞接种于6孔板中培养至单层细胞铺满后，使用200 μL吸头垂直划出一道伤口。PBS清洗三次以去除浮游细胞后，更换为无血清培养基，并根据实验分组进行相应干预。干预24小时后拍照，使用ImageJ软件测量划痕宽度并进行定量分析。
2.7. 统计分析
采用SPSS 25.0软件(IBM, USA)包进行统计分析，计量资料采用均数 ± 标准差(mean ± SD)表示，每个实验重复3次。K-S检验符合正态分布的计量资料，多组之间比较均数采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)后再以最小显著性差异(Least Significant Difference, LSD)法比较各组的差异，方差不齐时使用One-Way ANOVA不等方差假设下的Tamane’s T2检验。不符合正态分布的资料采用秩和检验。P < 0.05时差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. 高糖及低氧对D407细胞的影响
首先使用免疫荧光染色对D407细胞进行鉴定，结果显示其表达RPE特异性标志物RPE65，证实其为视网膜色素上皮(RPE)细胞(图1(A))。接着使用CCK8法研究细胞活性，发现1 μM的胡椒碱在低氧 + 高糖24小时可提高细胞活性，促进细胞增殖；100 μM的胡椒碱在低氧 + 高糖48小时下，可显著抑制细胞活性；高渗及高糖对低氧24小时细胞活性无显著影响，高渗及高糖可显著增加低氧48小时下的细胞活性(图1(B))。我们选择以高糖(25mM D-葡萄糖) + 5% O2培养24小时建立糖尿病细胞模型[12] [13]。发现高糖 + 低氧可使细胞H19及VEGFA mRNA的转录增加，miR-29b的转录减少(图2(A))；使p-AKT蛋白表达增加，使ERK1/2及AKT蛋白的表达减少(图2(B)、图2(C))，同时使VEGFA蛋白的表达增加(图3)，但对p-ERK1/2蛋白的表达无影响(图2(B)、图2(C))。进一步的划痕实验表明，高糖 + 低氧显著抑制细胞的迁移(图4)。
Figure 1. Immunofluorescence identification and activity detection of retinal pigment epithelium cells. A. Immunofluorescence staining of RPE cells. RPE, retinal pigment epithelium cells; CY3, Cyanine 3; DAPI, 4’,6-diamidino-2-phenylindole; scale bar, 50 μm. B. Cell viability assay. *P < 0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001 compared to the values of HG control, respectively. LO2, low oxygen; NG, normal glucose; HO, hyperosmosis; HG, high glucose; PIP, piperine, the congiguous number is concentration (μmol/L). Data are mean ± SD
图1. RPE细胞免疫荧光鉴定及活性检测。A. RPE细胞免疫荧光染色。RPE，视网膜色素上皮；标尺，50 μm。B. CCK8法检测细胞活力。与HG对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。LO2, 低氧；NG，正常糖；HO，高渗；HG，高糖；PIP，胡椒碱，接着的数字表示浓度(μmol/L)。数据以均数 ± 标准差表示(mean ± SD)表示
Figure 2. Effects of piperine on the transcription and expression of related genes in D407 cells. A. Effect of piperine on mRNA expression levels of H19, miR-29b, and VEGFA. B and C. WB images and statistical results of the influence of piperine on AKT/p-AKT, ERK1/2/p-ERK1/2 protein expression. *P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001 compared to the values of NG control, respectively. #P < 0.05, ##P < 0.01, and ###P < 0.001 compared to the values of HG-LO2 control, respectively. LO2, low oxygen; NG, normal glucose; HO, hyperosmosis; HG, high glucose; alcoh, alcohol; PIP, piperine, the congiguous number is concentration (μmol/L). Data are mean ± SD
图2. 胡椒碱对D407细胞的相关基因转录及表达的影响。A. 胡椒碱对H19、miR-29b及VEGFA mRNA表达水平的影响。B、C. 胡椒碱对AKT/p-AKT及ERK1/2/p-ERK1/2蛋白表达的影响，包括代表性的WB图像及定量分析结果。与NG对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01及***P < 0.001；与HG-LO2组相比，#P < 0.05，##P < 0.01及###P < 0.001。LO2，低氧；NG，正常糖；HO，高渗；HG，高糖；alcoh，乙醇；PIP，胡椒碱，接着的数字表示浓度(μmol/L)。数据以均数 ± 标准差表示(mean ± SD)表示
Figure 3. Immunofluorescence staining of VEGFA in D407 cells. The effect of piperine on the expression of VEGFA in D407 cells was represented in pictures (A) and statistics (B). CY3, Cyanine 3; DAPI, 4’,6-diamidino-2-phenylindole; LO2, low oxygen; NG, normal glucose; HG, high glucose; PIP, piperine, the congiguous number is concentration (μmol/L). *P < 0.05 and **P < 0.01. Data are mean ± SD; scale bar, 20 μm
图3. 胡椒碱对D407细胞VEGFA表达的影响。图示为VEGFA表达的代表性图像(A)及分析结果(B)。LO2，低氧；NG，正常糖；HG，高糖；PIP，胡椒碱，接着的数字表示浓度(μmol/L)。*P < 0.05及**P < 0.01。数据以均数 ± 标准差(mean ± SD)表示。标尺，20 μm
Figure 4. Effect of piperine on the migratory ability of D407 cells. Representative images of the cell migration in (A), with corresponding quantitative analysis in (B). ***P < 0.001 compared to the values of NG control. ###P < 0.001 compared to the values of HG-LO2 control. LO2, low oxygen; NG, normal glucose; HO, hyperosmosis; HG, high glucose; alcoh, alcohol; PIP, piperine, the congiguous number is concentration (μmol/L). Data are mean ± SD; scale bar, 200 μm
图4. 胡椒碱对D407细胞迁移能力的影响。图示为细胞迁移实验的代表性图片(A)及统计结果(B)。与NG对照组相比，***P < 0.001；与HG-LO2组相比，###P < 0.001。LO2，低氧；NG，正常糖；HO，高渗；HG，高糖；alcoh，乙醇；PIP，胡椒碱，接着的数字表示浓度(μmol/L)。数据以均数 ± 标准差(mean ± SD)表示。标尺，200 μm
3.2. 胡椒碱对D407细胞的保护作用
在高糖 + 低氧条件下，与HG-LO2组相比，10 μM及100 μM的胡椒碱可显著抑制H19 mRNA的转录；1 μM及10 μM的胡椒碱可显著抑制VEGFA mRNA的转录；但胡椒碱对miR-29b的转录无影响(图2(A))。WB实验表明，1 μM、10 μM的胡椒碱可显著增加AKT、ERK1/2及p-AKT蛋白的表达，但胡椒碱对p-ERK1/2蛋白的表达无影响(图2(B)、图2(C))；免疫荧光实验也证明，10 μM的胡椒碱可显著减少D407细胞质中VEGFA蛋白含量(图3)。进一步的划痕实验表明，1 μM、10 μM及100 μM的胡椒碱均可显著促进D407细胞的迁移(图4)。
4. 讨论
本研究中，使用高糖及低氧条件诱导RPE细胞模拟糖尿病视网膜病变细胞模型，发现胡椒碱通过抑制H19的转录，使VEGFA的转录及表达下降，并通过增加AKT、ERK1/2及p-AKT的蛋白水平的表达促进RPE细胞的迁移。
DR的发病原因复杂，作为DR的始动因素，高血糖对视网膜毒性的机制包括：AGEs形成、增强的过氧化反应及过氧化产物生成、内质网应激以及多元醇通路、PKC通路、RAS、血管激肽系统的激活及低氧诱导因子-1/VEGFA通路的激活等[4] [14]。RPE作为视网膜的外屏障，可以转运许多营养物质以及分泌一些蛋白，从而维持神经视网膜的稳态[15] [16]，因此，本研究研究RPE细胞并以高糖及低氧在体外模拟DR的环境并研究其发病机制。
作为酪氨酸激酶家族的一员，VEGFA在眼内可由RPE细胞、视网膜血管内皮细胞(retinal vascular endothelial cells, RVECs)等合成及分泌[17]，并与2种受体结合：血管内皮生长因子受体1 (vascular endothelial growth factor receptor 1, VEGFR1)和VEGFR2结合，且VEGFA主要与VEGFR2结合促进新生血管生成。早期VEGFA的反应性升高可通过扩张视网膜血管、增加血流而增加氧含量，发挥代偿功能。但是长期升高的VEGFA，可通过破坏内皮细胞的紧密连接而促进视网膜血管渗漏[4]。与其他研究类似，本研究发现，高糖及低氧会使VEGFA的表达显著增加，临床上大量抗VEGFA药物在PDR治疗中的应用也证实了VEGFA的重要作用[18] [19]。
LncRNA H19是一种定位于人类11号染色体的印记基因，其在胚胎形成时大量表达，并随着年龄的增长而表达急剧下降[6]。H19通过与miR-29b结合，从而抵消miR-29b对VEGFA mRNA的负性调节作用，进而间接使VEGFA的表达增加。与他人的研究类似[11] [20]，本研究也发现，高糖及低氧条件下，H19的转录显著增加，miR-29b的转录显著减少，提示其在DR中有重要作用，是一个潜在的治疗靶点。
胡椒碱(piperine, PIP)，是自荜茇、胡椒中提取出的主要有效成分，其拥有广泛的药理作用，包括抗惊厥、抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗新生血管等作用[21]。Choi等[22]发现胡椒碱(50 mg/kg)可显著降低肝脏甘油三酯、游离脂肪酸及胆固醇含量，同时通过增加胰岛素受体底物1 (insulin receptor substrate 1, IRS1)活性而缓解胰岛素抵抗，提示其可能应用于糖尿病的治疗。作为一种安全的食物提取脂溶性生物碱，胡椒碱具有穿透血-眼屏障的能力，因此可能通过全身应用而治疗眼部疾病，既往我们的研究已证实了其在糖尿病小鼠模型中的治疗作用[23]，本研究进一步发现，胡椒碱可通过H19/miR-29b通路减少RPE细胞VEGFA的表达，VEGFA的靶组织为视网膜微血管，即可能通过减少视网膜内的新生血管形成发挥保护作用；同时，其通过增加AKT、ERK1/2及p-AKT的表达而促进RPE细胞的迁移，提示其可在高糖及低氧条件下可保持RPE细胞的活性。虽然临床上眼内注射抗VEGF药物在DME和PDR治疗中取得了良好疗效，但VEGFA本身是一种血管及神经必需的生存因子，拮抗后可能导致血管及神经细胞死亡而引起血管阻塞、神经萎缩的可能性，因此，理想的DR治疗策略应当通过多途径干预其发病机制，同时具备较低的副作用风险。既往我们的研究表明，胡椒碱可在减少促新生血管因子VEGFA表达的同时，增加抗新生血管因子及神经保护因子色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor, PEDF)的表达，提示其具备调控血管新生与神经保护的双重作用[23]，由此推测，胡椒碱可能作为一种治疗DR的潜在多靶点、相对安全的药物。
本研究也存在一些不足之处。首先，本研究发现胡椒碱可促进RPE细胞的迁移，但未检测其对细胞死亡相关的影响，下一步实验将进一步探究其在细胞凋亡或焦亡等存活率相关方面的影响[24]。其次，本研究未进行体内实验，但作为一个机制的初步研究，体外实验结果已提供了初步的可靠方向，且我们前期的研究也证实了胡椒碱在糖尿病小鼠视网膜中的保护作用[23]，下一步将进一步研究H19/miR-29b/VEGFA通路在体内实验中的影响。其三，本研究仅探讨了视网膜外屏障的主要组成细胞RPE的机制，阐明了胡椒碱对RPE细胞VEGFA分泌功能的影响，下一步将通过共培养等实验进一步研究H19/miR-29b/VEGFA通路对VEGFA的主要效应组织——视网膜微血管——的影响机制。最后，本研究尚未深入研究H19/miR-29b/VEGFA通路的精细调控机制，后续的研究将通过双荧光素酶报告基因实验预测三者的结合关系，运用单细胞测序实验明确差异化表达基因，并通过RNA干扰及过表达手段，进一步明确H19/miR-29b/VEGFA通路对相关差异表达基因的调控作用及其潜在机制。
总之，据我们所知，本研究首次探明了胡椒碱对高糖及低氧条件下RPE细胞H19/miR-29b/VEGFA通路的影响机制，并初步发现了其对RPE细胞的保护作用，为胡椒碱在DR中的应用提供了实验基础。
基金项目
湖南省自然科学基金：2025JJ90270，2024JJ9026，2023JJ70014，2022JJ30085。
NOTES
*共同第一作者。
#通讯作者。