1. 材料与方法
1.1. 实验藻类的培养
实验所用铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa, PCC905)，购于中国科学院淡水藻种库(Freshwater Algae Culture Collection at the Institute of Hydrobiology, FACHB)，将两种藻种分别置于无菌BG11培养基中，于光照培养箱中培养，培养条件如下：光暗比12 h:12 h (L:D)，光照强度40 m−2s−1photons，温度为26℃。
1.2. 棕鞭藻的分离纯化与鉴定
(1) 棕鞭藻的分离纯化
本研究实验前期发现一种能够使产毒铜绿微囊藻死亡的藻类，将其转移至含无菌BG11培养基的孔板中于光照培养箱中扩大培养，以备后续实验使用。
(2) 棕鞭藻的形态鉴定
Figure 1. Microscopic picture of the Poterioochromonas malhamensis A: Poterioochromonas malhamensis morphology under light microscope; B: Feeding state diagram of Poterioochromonas malhamensis; C: Aggregated lorica; D: Previously identified microscopic images of Poterioochromonas malhamensis under optical microscopy; E: Images of capsule shells aggregated into clusters in previous studies
图1. 杯棕鞭藻的显微镜图片(A)：光学显微镜下的杯棕鞭藻形态图；(B)：杯棕鞭藻的摄食状态图；(C)：聚集的囊壳；(D)：以往研究已确定的杯棕鞭藻光学显微镜图片；(E)：以往研究中囊壳聚集成群体图片
运用倒置显微镜(ZEISS)对纯化后的微藻进行形态观察，并用数码相机及显微镜拍摄软件(Axiocam 820 color成像系统)对该藻进行拍摄，结果如图1所示，该藻细胞外体透明、细胞器呈黄褐色具有两个色素体、无细胞壁、可自由游动，整体大多呈圆形或卵圆形，没有眼点；每个细胞有两根长短不等的鞭毛；长鞭毛是体长的1~1.5倍，短鞭毛在显微镜下有时很难观察到，细胞长度6~18 μm (如图1 (A))，该藻株可同时摄食10个以上的微囊藻细胞(如图1(B))。该藻株在显微镜下可观察到游离囊壳的聚集现象(图1 (C))。并与以往研究中确定的藻株比对[10] (图1(D)、(E))，最终确定本研究发现的微藻为金藻门金藻纲棕鞭藻目棕鞭藻科杯棕鞭藻属杯棕鞭藻Poterioochromonas malhamensis。
1.3. 实验过程与方法
1.3.1. 预处理
取足够密度和体积的铜绿微囊藻和杯棕鞭藻同时加入氨苄青霉素(100μg/mL)、卡那霉素(50 μg/mL)和硫酸链霉素(50 μg/mL)，过夜培养一天后(排除细菌的干扰)，使用离心法(8000 rpm, 10 min)将杯棕鞭藻和铜绿微囊藻中的抗生素去除。
1.3.2. 实验过程
本实验设置微囊藻初始密度为107 cell/mL，将杯棕鞭藻按照1:50 (杯棕鞭藻:微囊藻)的密度比接种于含有100 mL微囊藻的500 mL锥形瓶中，均设置三组平行。实验期间，测定和观察0 h、12 h、24 h、48 h和72 h的微囊藻和杯棕鞭藻的密度、聚团情况，来反映微囊藻的生长情况和杯棕鞭藻的摄食能力，确定最佳摄食效率时二者的密度比，并在最佳密度比下，每24 h测定微囊藻毒素(MC-LR)和GSH含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶活性(CAT)和ROS水平变化。
1.4. 指标测定
(1) 密度计算
每12 h取1 mL溶液使用2%鲁戈试剂固定至少6 h，随后利用0.1 mL的浮游藻类计数框按照中华人民共和国国家生态环境标准法对杯棕鞭藻和铜绿微囊藻进行计数。
(2) MC-LR测定
胞内和胞外MC-LR含量测定采用铜绿微囊藻毒素酶联免疫(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)试剂盒，具体的检测步骤参照试剂盒说明书，使用酶标仪测定450 nm时的微囊藻毒素含量。
(3) ROS含量测定
利用活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)每24 h测定一次，装载探针后使用激光共聚焦显微镜直接观察。
(4) 超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶活性(CAT)测定
使用过氧化氢酶(Catalase, CAT)试剂盒，每24 h测定一次样品，具体检测步骤参照试剂盒说明书，使用酶标仪测定405 nm时的微囊藻毒素含量。
(5) 谷胱甘肽(GSH)含量的测定
使用还原型谷胱甘肽(reduced glutathionem, GSH)试剂盒每24 h测定一次样品，使用酶标仪在吸光度412 nm波长处测定GSH含量。
以上所有试剂盒均来自上海酶联生物(Enzyme-Linked Biotechnology, Shanghai, China)。
1.5. 数据处理与统计分析
本文统计数据(包括图表)均为平均值 ± 标准差(n = 3)的形式，采用GraphPad Prism 9对数据结果进行分析和绘图；采用方差分析研究杯棕鞭藻对微囊藻降解效率的影响。
2. 结果
2.1. 杯棕鞭藻对藻毒素的摄食效率
当杯棕鞭藻:微囊藻的密度比为1:50时，杯棕鞭藻的密度随时间逐渐增加，60 h时达到最大密度；微囊藻的密度在12 h后出现大幅度降低，最终在72 h时杯棕鞭藻对微囊藻的摄食效率为96% (如图2)。
Figure 2. The density changes of P. malhamensis and M. aeruginosa at 1:50
图2. 1:50时杯棕鞭藻和微囊藻的密度变化
2.2. 杯棕鞭藻对藻毒素的降解效率
本实验研究的杯棕鞭藻可以在摄食微囊藻同时降解藻毒素(如图3)。对照组胞内和胞外微囊藻毒素含量随着生长时间延长逐渐增加，胞内藻毒素含量从800 μg/L增加到865 μg/L。处理组中，胞内微囊藻毒素在24 h内藻毒素含量持续降低，降解率达到45%，而在36 h胞内藻毒素增加到590 μg/L，随后又随着处理时间增加逐渐下降，在处理72 h时胞内藻毒素降解率为42%；胞外藻毒素含量自处理开始到36 h逐渐增加，36 h胞外藻毒素含量达79 μg/L，随后逐渐下降，并在处理72 h时达到最低值，同时该时间降解率最高，为80%。
Figure 3. Changes in the content of intracellular and extracellular MCs when the density ratio of Poterioochromonas and M. aeruginosa was 1:50. “***” denoted an extremely significant difference between control and grazing treatment (P < 0.001), “**”denoted highly significant difference (P < 0.01)
图3. 杯棕鞭藻和微囊藻密度比为1:50时胞内和胞外藻毒素的含量变化。“***”表示处理组与对照组间极其显著的差异(P < 0.001)，“**”表示处理组与对照组间极显著的差异(P < 0.01)
2.3. GSH含量
在杯棕鞭藻降解藻毒素过程中，GSH含量变化如图4所示，单独培养的微囊藻在试验期间GSH含量为5.5~5.8 μM/mL，各处理时期差异不显著(P > 0.05)；而杯棕鞭藻和微囊藻以1:50的初始密度共培养处理后，处理组的GSH含量在48 h内活性逐渐增加，由初始的5.5 μM/mL增加到12.56 μM/mL，随后在72 h时GSH含量增加至最高，为17.2 μM/mL。此外，除了处理开始时期(0 h)外，处理组中GSH含量在各时期均显著高于对照组。
Figure 4. Changes in GSH content at a density ratio of 1:50 between P. malhamensis and M. aeruginosa. “***”denoted an extremely significant difference between control and grazing treatment (P < 0.001), “*” denoted significant difference (P < 0.01)
图4. 杯棕鞭藻和微囊藻密度比为1:50时GSH的含量变化。“***”表示处理组与对照组间极其显著的差异(P < 0.001)，“*”表示处理组与对照组间显著的差异(P < 0.01)
2.4. ROS、SOD和CAT活性
如图5所示，在实验处理12 h后荧光强度(ROS含量)最高，随着处理时间增加ROS荧光强度逐渐降低，直至最后在72 h时完全消失。
Figure 5. Changes in reactive oxygen species when the density ratio of P. malhamensis and M. aeruginosa was 1:50
图5. 杯棕鞭藻和微囊藻密度比为1:50时活性氧的变化
如图6所示，单独培养的微囊藻各处理时间之间SOD和CAT活性无显著差异(P > 0.05)，并保持在较低水平；而杯棕鞭藻和微囊藻以1:50的初始密度共培养处理后，SOD活性在48 h时达到最高值，为58 U/mg proteins，到72 h时活性降低至36 U/mg proteins；在所有处理时间，杯棕鞭藻和微囊藻混合培养SOD活性均显著大于对照组。对照组的CAT活性在72 h内有所增加但差异不显著(P > 0.05)，处理组的CAT活性在24 h增加到最高，为1.25 U/mg proteins，而后随着处理时间逐渐降低，至72 h出现最低值，为0.4 U/mg proteins；除0 h和72 h外，其他处理时间内杯棕鞭藻和微囊藻混合培养CAT活性均显著大于对照组。
Figure 6. Changes in SOD and CAT contents at a density ratio of 1:50 between and P. malhamensis and M. aeruginosa. “***” denoted an extremely significant difference between control and grazing treatment (P < 0.001), “**” denoted highly significant difference (P < 0.01), and “ns” represents no significant difference (P > 0.05)
图6. 杯棕鞭藻和微囊藻密度比为1:50时SOD和CAT含量变化图。“***”表示处理组与对照组间极显著的差异(P < 0.001)，“**”表示处理组与对照组间极显著的差异(P < 0.01)，“ns”表示处理组与对照组间无差异(P > 0.05)
3. 讨论
已有研究证实，杯棕鞭藻可以摄食铜绿微囊藻[11]，本实验的杯棕鞭藻可以啃食并消化微囊藻，同时通过增加GSH含量和SOD和CAT活性来摄食过量的ROS并降解摄入体内的藻毒素。
微囊藻在被摄食的12 h内ROS荧光强度最高，说明微囊藻在此时受到较强的牧食压力，导致其产生较多的ROS。抗氧化酶系统如SOD、CAT等可以有效清除细胞内产生的过量ROS。实验中CAT活性在12 h到24 h时持续增加，同时SOD活性在12 h时也大幅增加(图6)，这可能是因为ROS的增加导致杯棕鞭藻体内抗氧化系统被激活，从而利用CAT和SOD有效清除ROS。而ROS荧光强度在24 h之后开始显著降低，至48 h和72 h几乎消失，原因可能是因为此时微囊藻已被杯棕鞭藻完全摄食，导致无法再继续产生ROS；此外杯棕鞭藻SOD活性在48 h仍维持在较高水平，有效清除了大量的ROS。
以往研究发现，杯棕鞭藻在摄食微囊藻后，GSH途径会被快速激活。在本研究中，杯棕鞭藻摄食微囊藻时，GSH含量显著增加(图4)，说明此时棕鞭藻会通过增加体内GSH含量提高其对藻毒素的耐受性以及降解藻毒素效率。Zhang [12]等通过转录组学结果发现，杯棕鞭藻可以在其体内将藻毒素与谷胱甘肽结合生成毒性较小的GSH-MC复合物，达到降解藻毒素的目的。因此，本研究中GSH含量的增加可能是杯棕鞭藻降解藻毒素的重要生理途径之一。
此外，GSH同样可以清除过量ROS。以往研究表明，GSH水平的大幅增加会增强氧化应激的程度[9]。因此，我们认为杯棕鞭藻在培养初期产生更多的GSH可以诱导其他抗氧化酶(SOD和CAT)活性的增加。当微囊藻被摄食完全后，GSH含量增加到最高，因为此时杯棕鞭藻的密度达到较高水平，用于清除摄入的藻毒素和剩余的藻毒素。
4. 结论
本实验分离纯化得到一株可有效摄食微囊藻的杯棕鞭藻(Poterioochromonas malhamensis)，研究了杯棕鞭藻在高密度微囊藻环境中的降解效率，实验结果表明，杯棕鞭藻对胞内藻毒素的降解率达到42%，胞外藻毒素的降解率高达80%。在藻毒素降解过程中，ROS水平上升。与此同时，SOD和CAT含量也显著上升。此外，实验还发现GSH含量在藻毒素降解期间显著增加，参与杯棕鞭藻的解毒过程。