C4D在肾脏疾病中的研究进展

C4D and Primary Glomerular Diseases

摘要: 补体级联是一种蛋白质系统，其主要作用是启动和调节免疫反应。在补体激活过程中，循环蛋白被切割，新生切割片段参与广泛的下游先天和适应性免疫功能。尽管这些功能中的大多数是稳态的或保护性的，但是大量的实验和临床证据也强调了补体系统在许多类型的肾小球疾病的发病机理中的中心作用。本综述旨在总结现有的关于不同肾小球疾病的肾活检肾小球C4D沉积的数据，这些数据可能有助于进一步研究补体激活在肾小球疾病中的作用。

Abstract: The complement cascade is a protein system whose main role is to initiate and regulate the immune response. During the process of complement activation, circulating proteins are cleaved, and the newly generated cleavage fragments are involved in a wide range of downstream innate and adaptive immune functions. Although most of these functions are homeostatic or protective, a large amount of experimental and clinical evidence also highlights the central role of the complement system in the pathogenesis of many types of glomerular diseases. This review aims to summarize the existing data on glomerular C4D deposition in native renal biopsies of different glomerular diseases, and these data may contribute to further research on the role of complement activation in glomerular diseases.

1. 介绍

补体系统可以通过3种途径激活——经典途径(CP)、凝集素途径(LP)和替代途径(AP)。所有3种途径汇聚形成C3转化酶，该酶激活C3，产生活性形式C3a和C3b，后者与C3转化酶结合，形成C5转化酶，将C5裂解成活性形式C5a和C5b、C5b可以进一步与C6、C7、C8和C9结合形成C5b-9，即膜攻击复合物(MAC)。MAC导致无核细胞溶解，但导致对有核细胞的亚致死性损伤，包括细胞活化和组织损伤，最终导致C1s的激活，C1s将C2和C4裂解成活性形式。通过甘露糖结合凝集素(MBL)与细菌生物体内碳水化合物部分的结合来激活LP，这导致MBL相关丝氨酸蛋白酶的激活从而切割C4和C2的酶。CP和LP都导致C4b2b的形成，C4b2b作为CP/LP的C3转换酶。在AP中，通过硫酯键的水解，C3自发活化，结果，因子B和因子D被募集。因子D切割因子B形成活性丝氨酸酯酶(Bb)，然后将C3转化为C3a和C3b。C3b与Bb结合形成AP，C3转化酶C3bBb [1]。肾脏总是处于补体攻击的威胁之下。肾小球具有一种功能和结构，可以很容易地捕获大分子，包括免疫复合物，从而激活补体系统。有研究表明在肾小球肾炎中，眼镜蛇毒因子补体耗竭可改善免疫介导的肾小球损伤[2] [3]。蛋白尿患者的小管直接暴露于各种补体成分。由于近端小管的刷状边界可以激活组织和细胞中补体的替代途径，因此小管腔中补体成分的存在可能导致补体攻击小管细胞，这些事件都可能导致严重的肾损伤[4]。C级联的激活产生几个可溶的和组织结合的蛋白质片段，这些片段可以用作组织炎症的生物标志物，C4的水平是补体激活标志物，而C4D仅由补体激活产生。C4D是补体级联的降解产物，是补体激活的标志物。肾活检常规免疫染色沉积C4片段，C4失活后，C4D片段仍然附着在表面，这加强了其作为生物标志物的适用性。此外，与其他补体活化产物如C3a或C5a相比，C4D具有较好的半衰期。肾小球疾病与补体异常的关联正逐渐成为对其潜在发病机制提出新观点的重要工具。研究表明[5]，C4D免疫染色被用作辅助诊断抗体介导的排斥移植物活检。C4D是C4激活的副产物，由于其硫酯键作为补体激活的标志，因此具有与细胞表面结合的倾向。通过免疫荧光(IF)或免疫组织化学(IHC)技术检测C4D沉积可用于显示原发性肾脏疾病中明显/隐藏的抗原–抗体复合物沉积[6]。

2. C4D与肾脏疾病

2.1. IgA肾病

免疫球蛋白A肾病(IgAN)被认为是最常见的原发性肾小球肾炎，占所有肾小球肾炎患者的30%以上，其病理生理被认为是一个多重模式，包括过量的IgA1的产生，随后形成免疫复合物，它们在系膜区域沉积，最后肾小球炎症和瘢痕过程导致进行性慢性肾病阶段。在IgAN患者中，有多的补体产物共同沉积在系膜区，并与严重程度有一定的相关性[5] [7]。现有研究表明，IgA可以直接激活AP，替代途径被认为是驱动IgA固定肾小球损伤的最突出的补体途径[8]。在一项对IgA肾病成人患者的回顾性研究中显示，与C4D阴性组相比，阳性组初始蛋白尿发生率更高。系膜细胞增多在C4D阳性组更为常见，而肉眼血尿在C4D阴性组更为常见。C4D阳性组受累肾小球的比例明显更高，呈弥漫性分布，而C4D阴性组则为局灶性沉积。这项研究表明C4D阳性组肾脏受累更严重，尤其是肾病性蛋白尿[9]。在一项380例患者中，72例(18.9%)有C4D(+)的系膜沉积。关于C4D沉积，两组之间在年龄、男女比例或高血压状况方面没有差异。然而，C4D(+)的患者eGFR水平明显低于对照组的患者，UPCR水平明显高于对照的患者。此外，在随访期间，系膜沉积C4D(+)的患者更有可能出现更高的M或T评分，并接受更多的RAS阻滞剂和免疫抑制药物。与对照组相比，患有C4D(+)系膜沉积的患者表现出不利的特征，如基线MAP、eGFR和UPCR。然而，C4D沉积与主要结局风险之间的关联不大。在最近一项对96例IgA肾病患者的研究中，系膜C4D沉积(IHC)在儿童患者中被认为是eGFR下降的独立预测因子；肾表面C4D阳性患者的生存期为8.6年，而C4D阴性患者的生存期为15.1年。凝集素途径激活产生的C4D似乎与更差的肾脏预后有关[10]。在一项儿童IgAN研究中，29例C4D阳性患儿，C4D主要沿肾小球毛细血管袢沉积，少量分布于系膜区。既往报道包括儿童C4D染色显示C4D沉积主要发生在系膜和毛细血管袢。然而，成人C4D染色的报道显示，C4D主要沉积在系膜区，只有少数报道显示C4D沿肾小球毛细血管袢沉积。成人和儿童之间C4D沉积部位差异的原因尚不清楚。而且C4D阳性组和C4D阴性组儿童之间蛋白尿的差异似乎高于成人[11]。总之，IgA肾病中肾小球C4D沉积被认为反映了LP的活化，一些研究发现这与更差的组织病理学特征、蛋白尿以及肾脏预后有关。聚合IgA能够与MBL结合并激活[12]并可能通过补体激活造成更大的免疫损伤，但需要对其机制进行进一步研究。

2.2. 狼疮性肾炎

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)为一病因未明的以多系统损害伴多种自身抗体形成为特征的自身免疫性疾病。狼疮性肾炎(LN)是一种增殖性肾小球肾炎，这种增殖性疾病的发病机制主要是免疫介导的。补体分裂产物C4D在SLE中升高，狼疮性肾炎患者的C4D也较高。C4D是SLE疾病的生物标志物且代表活动性指标[13]，肾炎患者的C4D高于无肾脏受累的患者[14]。值得注意的是，C4D的比值比高于C3和C4，但低于dsDNA。抗dsdna联合C4D与肾炎有显著相关性。此外，少数受试者的数据还表明，C4D可能能够预测已经发生肾炎的患者的狼疮肾炎发作。同一组还分析了不同患者群体的C4D/C4比值，发现SLE患者(尤其是狼疮性肾炎)的C4D和C4D/C4比值均高于健康对照组[15]。狼疮性肾炎C4D/C4比值的ROC曲线AUC为0.76，高于单独使用C4D和C4的AUC。比值比分析显示，C4D高、C4低、C3低与肾炎有显著相关性，且C4D/C4比值相对比值最高。C4D水平与尿白蛋白与肌酐比值和肾活动指数显著相关。免疫组化染色显示肾活检中肾小球C4D沉积，与血浆C4D水平显著相关。狼疮性肾炎的临床和组织病理学反应表明，血浆中C4D的测定至少可以部分取代侵入性活检来评估活动性肾炎。对于疾病治疗反应，与C4D阴性患者相比，伴有肾C4D沉积的LN患者持续缓解的可能性更小，复发的风险更高。肾C4D沉积在伴有小管间质纤维化病变的V级膜性LN中尤为强烈[16]。然而，由于LN患者各亚组的病例太少，无法进行分析证实这一结论。此外，这也可能是由于随访时间不够长，不足以使LN患者出现肾功能恶化。先前的研究已经证明C4D与LN复发的决定性作用[17]。研究者推测，延长随访时间可能会发现肾脏C4D沉积与LN进展之间的关系。在儿童LN研究中表明，pct-C4D阳性患者蛋白尿和血尿较C4D阴性组加重，ptc-C4阳性LN患者的肾脏病理AI和SLEDAI评分较高，活检的肾脏CI较低，补体成分C3和C4水平较低，这与之前一些研究数据一致[18]。此外，研究还显示，ptc-C4D阳性患者的IV级LN比例高于ptc-C4D阴性患者，这在以往的成人发病SLE人群研究中未见报道。这些观察结果表明，儿科发病的LN患者比成人患者具有更大的疾病活动性或严重程度，这意味着PTC-C4D染色是儿科发病LN的更敏感的生物标志物[19]。

2.3. 膜性肾病

膜性肾病(MN)，也称为膜性肾小球病，是成人肾病综合征的主要原因之一，其定义为肾小球基底膜(GBM)中存在上皮下免疫复合物沉积，并伴有一系列变化。IgG4是MN亚上皮沉积物中的主要抗体亚型，其固定补体的能力较差，这强调了在激活膜攻击复合体(MAC)时补体激活的另一种途径。由于C4D是经典途径和凝集素途径的副产物，免疫复合物介导的肾小球肾炎涉及经典途径和凝集素途径时，可观察到C4D的沉积[20]。C4D IHC可作为免疫荧光的有用辅助手段，尤其是在早期MN病例中[21]。此前报道了一例MBL缺乏症患者的MN，其中补体激活被认为是通过AP激活发生的；他们进一步评估了77例特发性MN患者，在4例C4D弱染色的患者中发现了类似的MBL缺陷。然而，所有剩余的MBL没有缺陷的患者中发现沿肾小球毛细血管壁有强烈的C4D染色(通过IF)，表明MN的补体激活是通过LP激活。在31例特发性MN的%活检中，C4D沉积(通过IHC)呈颗粒状基底膜分布[22]。在一项比较21名膜性患者和19名微小病变患者(MCD)的研究中，毛细血管C4D沉积(通过IHC)出现在100%的膜性患者中，而没有出现在MCD患者中[23]。此外，在一项研究中表明，C4D阳性的MCD和FSGS均表现为肾病范围蛋白尿，3例阴性病例均未出现肾病范围蛋白尿。Heybeli等人的研究发现，原发性FSGS患者中，C4D的系膜染色模式与较差的生存率相关[19]。早期研究表明，肾小球疾病中C4D沉积与预后较差并发展为终末期肾脏疾病相关，特别是在FSGS [24]。在一项研究31例(100%)特发性MN患者中发现在基底膜中发现有特征性的肾小球、颗粒状C4D沉积物。用福尔马林固定和石蜡包埋的组织C4D染色可以检测MN中补体因子的膜状颗粒沉积。这种方法被证明是非常可靠的，当肾小球冷冻玻片或超微玻片无法用于电子显微镜时，它可能会避免进一步活检的需要[25]。C4D的免疫组化染色彻底改变了肾脏病理学领域。虽然这是一种简单的诊断测试，但它的效用可能是至关重要的，特别是在资源贫乏的环境中，可能无法获得免疫荧光。对早期MGN的诊断以及MCD和FSGS的发病机制有一定的帮助。

2.4. 膜增生性肾小球肾炎

膜增生性肾小球肾炎(MPGN)(与血管毛细血管肾小球肾炎同义)约占所有活检确诊肾小球肾炎病例的7%~10%。据报道，其年发病率为0.14~0.93/10万。在过去的10年里，对MPGN病理生理学的理解有了很大的进步。最近，一种新的分类被引入两种形式，免疫复合物介导的MPGN (Ig-MPGN)和补体介导的MPGN (C-MPGN)或C3肾小球病(C3G) [25] [26]。在一项研究了18例免疫复合物肾炎活检标本、30例C3肾炎活检标本和13例感染后肾炎活检标本的肾小球C4D染色的研究中。除了2例IgA肾病和1例硬化性膜增生性肾小球肾炎标本外，所有免疫复合物介导的肾小球肾炎标本均显示明亮的(2~3+) C4D染色。C4D的分布反映了免疫球蛋白和C3的分布。相反，在30例C3肾小球病标本中，24例(80%) C4D染色完全阴性，在6例(20%)标本中仅检测到微量/1 + C4D染色。关于感染后的GN，13例标本中有6例(46%) C4D染色阴性，7例(54%)标本C4D染色阳性。总之，C4D是免疫复合物介导的肾小球肾炎的阳性标志物，但在C3肾小球疾病中不存在或很少检测到，作者提出C4D是区分IC、GN和C3G的一个有价值的标记[22]。此外，最近一项研究对2000年至2012年间诊断的15例MPGN I、II、III型和13例MCD患者进行了回顾性研究。根据2013年C3G共识分类，15例MPGN I、II和III型活检重新分类为MPGN(8)和C3G。经C4D染色，诊断为MPGN的8例活检中，4例有经典通路受累[C1q(+), C3(+), C4D(+)]；2例有凝集素通路参与[C1q(−), C3(+), C4D(+)];两个被重新分类为C3G，因为C4D和C1q的缺失表明存在替代途径[C1q(−), C3(+), C4D(−)]。7例C3G活检中有3例显示经典通路受累，并被重新分类为MPGN。另外4例被认为是C3G的活检中有1例存在替代途径。2例C3G活检累及凝集素通路，1例致密沉积病累及凝集素通路。更加证实4d是区分IC GN和C3G的一个有价值的标记[28]。与此同时，C4D是补体系统激活的经典和凝集素途径中C4激活的分裂产物，在移植学中被认为是抗体介导的排斥反应中组织损伤的足迹[29]。

2.5. 链球菌感染后肾小球肾炎

急性链球菌感染后肾小球肾炎(APS-GN)是由A组β-溶血性链球菌引起的免疫复合物介导的肾小球疾病(GAS)或化脓性链球菌感染。APSGN是儿童获得性肾脏损伤的主要原因[30]。基本的病理生理机制包括GAS的肾原性抗原对补体系统的激活。补体系统的激活主要涉及选择性途径，但也涉及凝集素途径。这一过程对于通过沉积的免疫复合物(ICs)产生炎症是至关重要的。补体的经典途径成分如C1q通常缺乏，支持该疾病中补体旁路的激活。另一方面，可以观察到C4D，特别是在那些对IgG具有强免疫荧光的情况下[31]。在14例APSGN患儿的系列血清标本的研究实验中，有8个发现该比率值升高，表明C4激活，并且在一些患者中，该比率保持升高数周；相比之下，只有1个标本的血清C4水平较低(C4D/C4比率最高的标本) [32]。在Sethi等人的研究中，被列为感染后GN的13名患者中约有7名出现C4D沉积，2例纤维性GN患者均出现C4D沉积，且活检标本中存在IgG和C3。如Sethi等人所示，C4D在免疫沉积物方面具有诊断效用[33]。

3. 结论

肾小球肾炎有许多不同的形式，我们已经认识关于补体系统激活和调节的临床重要性和机制。在一些但不是所有的研究中，不同肾小球疾病中的C4D沉积似乎与较差的肾脏预后相关。C4D染色与补体沉积的其他成分一起使用将帮助描述肾小球疾病中不同的补体激活途径，帮助理解疾病的病理发生。此外，在一些疾病中，C4D染色可能有助于识别肾脏预后较差的患者，这可能有助于指导治疗决策。幸运的是，这已经改善了诊断，并且在某些情况下已经改善了治疗。循环中有害的自身抗体可以通过血浆置换去除，严重的终端途径激活的后果可以通过治疗性补体抑制抗体来限制。C4D染色是一种简单的染色方法，可以在大多数实验室中进行，并且在组织不能用于IF时很有价值。需要在动物模型中进行进一步的研究，以了解发病机制和在人类中的前瞻性研究，特别是研究不同补体途径的沉积和活化及其在不同肾小球疾病中的作用。患者的成功治疗需要在该领域进行进一步的研究，并需要临床医生和对补体系统有兴趣和特殊专业知识的研究人员之间的密切合作。

NOTES

^*通讯作者。