1. 引言
卵巢癌是发生在卵巢上的恶性肿瘤，其发病率低于宫颈癌和子宫内膜癌，居妇科癌症的第三位，但其死亡率高居妇科癌症首位，严重威胁妇女健康的致命疾患[1]。浆液性卵巢癌(serous ovarian cancer, SOC)是最常见的上皮性卵巢癌类型，占卵巢癌的75%病例[2]。由于卵巢癌早期缺少症状，筛查的作用又有限，因而早期诊断较难，大多数患者就诊时已处于晚期，5年生存率较低。因此，寻找SOC的生物标志物和有效的分子靶点至关重要。
转运RNA (tRNA)蛋白质合成中充当适配器的翻译机[3]。tRNA衍生小RNA，又叫tRNA碎片包括tRNA半片段(tiRNA)和tRNA衍生片段(tRF)来源于前体tRNA或成熟tRNA的非编码小RNA [4]。研究表明在细胞中tRF和tiRNA重要作用包括细胞增殖、DNA损伤应答、肿瘤进展和神经退行性变等[5]-[7]，可能通过在不同水平调控基因的表达在癌症中发挥关键作用[8]。近年来，tRF和tiRNA被认为是新的潜在生物标志物和肿瘤治疗靶点[9]。本研究使用高通量tRF和tiRNA测序筛选了HGSOC患者的tRNA碎片的表达谱，芯片结果发现tiRNA-His-GTG-001表达水平上调，然后将tiRNA-His-GTG-001在67例HGSOC组织中进行验证，以便研究tiRNA-His-GTG-001的表达情况和恶性进展机理。
2. 资料与方法
2.1. 一般资料
本研究选取了2020年1月至2022年1月期间，在扬州大学附属医院接受手术治疗的63例卵巢癌患者作为研究对象。收集卵巢癌组织及癌旁正常组织和临床病理资料。纳入标准：① 临床资料完整，病理诊断为SOC；② 术前未接受化疗、放疗和免疫治疗；③ 患者同意并能进行随访。排除标准：① 合并其他恶性肿瘤患者；② 血液类系统疾病以及免疫类系统疾病患者；③ 中途失访者。本研究已获得扬州大学医学伦理委员会的批准(YXYLL2020-142)。本研究获得患者及其家属知情并同意。
2.2. 材料和试剂
2株卵巢癌细胞株A2780和SKOV3以及正常卵巢上皮细胞IOSE-Van来源于中国科学院上海细胞库。所有细胞系在添加了10%胎牛血清(FBS, Gibco) DMEM培养基，包括100 U/ml青霉素/链霉素双抗，在37℃，5% CO2的温湿细胞培养箱中孵育。tiRNA-His-GTG-001 mimic (过表达)和si-tiRNA-His-GTG-001 (降低表达)以及相关对照组的质粒(载体MSCV)合成于南京金斯瑞生物科技有限公司。通过Lipofectamine 3000试剂盒将过表达质粒和降低表达质粒转染到卵巢癌细胞中。
2.3. tRF和tiRNA表达谱测序
提取3例HGSOC组织和癌旁正常组织的总RNA，将提取的RNA提交给上海康成生物工程技术有限公司(中国上海)进行Arraystar tRF和tiRNA微阵列筛选和表达谱分析。人类Arraystar tRF和tiRNA阵列(Arraystar, Rockville, MD)用于本研究。数据分析和图像采集由Shanghai Kangcheng Bioengineering Technology Co., Ltd. (Shanghai, China)提供。
2.4. 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)实验
首先使用Trizol法萃取子宫内膜癌组织的总RNA，测定RNA浓度并记录保存。使用cDNA合成试剂盒将上述提取的总RNA反转录为cDNA。反应管内容物：试剂盒混合液Mix 2 μL + 总RNA 0.5 μg，然后用ddH2O加满置10 μL，反应条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，得到cDNA。使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR反应(Vazyme生物公司，南京)。每个反应管内容物：2 × ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL + Primer 1 (10 µM) 0.4 μL + Primer 2 (10 µM) 0.4 μL + 50 × ROX Reference Dye 1 0.4 μL + Template DNA/cDNA 1 μL + ddH2O 7.8 μL共计20 μL。同样重复的反应管3个。qRT-PCR实验条件：预变性95℃，30秒；然后95℃ 5秒→60℃ 30秒，共计40个PCR扩增循环，内参为U6。所得实验数据均与内参对比后再进行统计分析。tiRNA-His-GTG-001上游引物序列CCTGGTTAGTGGCTCGCC下游引物序列GAGGTTGCTGCGGCCACAA。
2.5. 细胞克隆形成实验
将合成的tiRNA-His-GTG-001mimic和si-tiRNA-His-GTG-001转染至卵巢细胞中，100个/皿接种于60 mm培养皿中。培养2周后，培养皿中可见细胞克隆。细胞经4%多聚甲醛固定后，用0.1%结晶紫溶液染色。Image J分析克隆数。
2.6. 细胞增殖实验
细胞计数试剂盒8 (CCK-8)检测细胞增殖活性情况。取100 μL含5 × 103卵巢癌细胞的培养液，接种于96孔板中。然后，在处理孔中加入CCK-8，在第1~3天评估细胞的OD值。
2.7. 细胞迁移实验
通过Transwell实验检测细胞迁移能力；首先，将含5 × 104细胞的无血清McCoy’s 5a培养基添加到上室，而将含20% FBS的500 μl Dulbecco’s Modified Eagle培养基添加到下室。24 h后，用棉签去除非迁移、非侵袭的细胞，将膜上其余细胞固定后用0.5%结晶紫染色。显微镜下观察并计数细胞迁移数目。
2.8. 统计学处理
统计数据分析使用的是SPSS 22.0和Graph Pad 8.0软件。分类资料采用[例(%)]表示，两组间比较采用Pearson’s法χ2检验。生存分析则通过Kaplan-Meier生存曲线统计。*，P < 0.05为差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. tRF和tiRNA表达谱测序结果
利用Arraystar nrStarTM tRF和tiRNA PCR Arrays芯片检测3例浆液性卵巢癌组织及其癌旁正常组织中tRF和tiRNA的差异性表达。候选tRF和tiRNA的选择标准包括：1) 其在癌症组织中的表达应高于顶部FC ≥ 2.3的邻近组织；2) tRF和tiRNA表达水平上调；3) 基因序列长度超过30个；4) P < 0.001。符合选择条件的有四个表达水平上调的tRF和tiRNA，包括tiRNA-Gln-CTG-003和tiRNA-His-GTG-001 (表1)。本文选择2个低表达piRNA进行验证。
Table 1. Shows two upregulated levels of tRF and tiRNA in serous ovarian cancer
表1. 浆液性卵巢癌中2个表达水平上调的tRF和tiRNA
tRF and tiRNA名称 |
基因序列 |
类型 |
长度 |
表达倍数 |
P值 |
表达 |
tiRNA-Gln-CTG-003 |
GGTTCCATGGTGTAATGGTTAGCACTCTGGACTC |
tiRNA-5 |
34 |
3.797045476 |
0.000433413 |
上调 |
tiRNA-His-GTG-001 |
GCCGTGATCGTATAGTGGTTAGTACTCTGCGTTG |
tiRNA-5 |
34 |
3.36337803 |
0.000124177 |
上调 |
3.2. 63例SOC中tiRNA-Gln-CTG-003和tiRNA-His-GTG-001的表达
本研究对tiRNA-Gln-CTG-003和tiRNA-His-GTG-001的表达进一步在63例SOC组织中进行了qRT-PCR验证，实验结果如图1所示，在SOC中tiRNA-Gln-CTG-003 (3.064 ± 0.213)表达水平与癌旁正常组织(3.189 ± 0.226)无统计学差异，P > 0.05。tiRNA-His-GTG-001 (4.577 ± 0.227)表达水平明显高于癌旁正常组织(1.753 ± 0.129)，t = 11.000，P < 0.05。该实验提示tiRNA-His-GTG-001在SOC中发挥促癌基因的作用。
Figure 1. The expression of tiRNA-Gln-CTG-003 and tiRNA-His-GTG-001 in 63 cases of SOC
图1. 63例SOC中tiRNA-Gln-CTG-003和tiRNA-His-GTG-001的表达
在63例SOC中tiRNA-His-GTG-001表达明显高于癌旁正常组织；tiRNA-Gln-CTG-003表达与癌旁正常组织无统计学差异。*P < 0.05，NSP > 0.05。
3.3. tiRNA-His-GTG-001表达的临床病理意义
基于上述qRT-PCR验证结果，探讨tiRNA-His-GTG-001表达与临床资料的相关性。实验分为两组：高表达组(表达水平高于对照组)和低表达组(表达水平低于或等于对照组)，其中高表达组例数n = 48，低表达组例数n = 15。四格交叉表统计结果如表2所示，在SOC中，tiRNA-His-GTG-001肿瘤大小和病理分级有着表达性差异，均P < 0.05；而在年龄、临床分期和淋巴转移中的表达无明显差异，均P > 0.05。
Table 2. Relationship between the expression of tiRNA-His-GTG-001 and the clinical characteristics of SOC
表2. tiRNA-His-GTG-001表达与SOC临床特征的关系
指标 |
高表达组(n = 48) |
低表达组(n = 15) |
χ2/P |
年龄(岁) |
≤55 |
20 |
7 |
2.547/0.110 |
>55 |
28 |
8 |
肿瘤大小(cm) |
≤5 |
8 |
9 |
10.892/0.001* |
>5 |
40 |
6 |
病理分级 |
低级别 |
18 |
10 |
3.938/0.047* |
高级别 |
30 |
5 |
淋巴结转移 |
有 |
29 |
7 |
0.882/0.348 |
无 |
19 |
8 |
临床分期 |
Ⅰ~Ⅱ |
18 |
8 |
1.182/0.277 |
Ⅲ |
30 |
7 |
注：*P < 0.05。
3.4. tiRNA-His-GTG-001促进SOC细胞增殖
考虑到tiRNA-His-GTG-001的表达与肿瘤大小密切关联，使用细胞克隆实验和CCK-8实验研究tiRNA-His-GTG-001对SOC细胞增殖和生长的影响。首先通过qRT-PCR验证了SOC细胞中tiRNA-His-GTG-001过表达或降低表达质粒的有效性(P < 0.05，图2(a))。
CCK-8实验结果显示(图2(b))，在A2780细胞72 h时，与Scramble-NC (0.67 ± 0.04)相比，过表达tiRNA-His-GTG-001 (0.85 ± 0.03)促进细胞增殖活性(P < 0.05)。与si-NC对照组(0.64 ± 0.02)相比，降低tiRNA-His-GTG-001表达(0.37 ± 0.02)抑制细胞增殖活性(P < 0.05)；在SKOV3细胞72 h时，与Scramble-NC (0.62 ± 0.04)相比，过表达tiRNA-His-GTG-001 (0.86 ± 0.03)促进细胞增殖活性(P < 0.05)。与si-NC对照组(0.68 ± 0.02)相比，降低tiRNA-His-GTG-001表达(0.37 ± 0.02)抑制细胞增殖活性(P < 0.05)。
细胞克隆实验显示(图2(c))，在A2780细胞中，与Scramble-NC (0.62 ± 0.04)相比，过表达tiRNA-His-GTG-001 (0.86 ± 0.03)细胞克隆数目明显增加(P < 0.05)。与si-NC对照组(0.68 ± 0.02)相比，降低tiRNA-His-GTG-001表达(0.41 ± 0.02)细胞克隆数目明显减少(P < 0.05)；在SKOV3细胞中，与Scramble-NC (0.71 ± 0.04)相比，过表达tiRNA-His-GTG-001 (0.84 ± 0.03)细胞克隆数目明显增加(P < 0.05)。与si-NC对照组(0.67 ± 0.02)相比，降低tiRNA-His-GTG-001表达(0.40 ± 0.02)细胞克隆数目明显减少(P < 0.05)。CCK-8实验和细胞克隆实验均提示，tiRNA-His-GTG-001能促进SOC细胞的增殖和生长。
(a) 验证过表达或降低tiRNA-His-GTG-001表达有效；(b) 过表达tiRNA-His-GTG-001 SOC细胞增殖活性增加(均P < 0.05)；降低tiRNA-His-GTG-001表达减弱SOC细胞增殖活性(均P < 0.05)。(c) 过表达tiRNA-His-GTG-001 SOC细胞克隆数目增加(均P < 0.05)；降低tiRNA-His-GTG-001表达SOC细胞克隆数目减少(均P < 0.05)。
Figure 2. tiRNA-His-GTG-001 promotes the proliferation of SOC cells
图2. tiRNA-His-GTG-001促进SOC细胞增殖
3.5. tiRNA-His-GTG-001对SOC细胞迁移的影响
为了解tiRNA-His-GTG-001对SOC细胞迁移的影响，本研究进行了Transwell迁移实验。实验结果如图3所示，在SKOV3细胞中，过表达tiRNA-His-GTG-001后细胞的迁移数目为18.7 ± 2.1个，而对照组为17.1 ± 1.9个，两者间差异无统计学意义，P > 0.05。降低tiRNA-His-GTG-001表达后细胞的迁移数目为13.9 ± 2.8个，与对照组(11.2 ± 1.2个)差异也无统计学意义，P > 0.05。在A2780细胞中，过表达tiRNA-His-GTG-001后细胞的迁移数目为18.9 ± 2.2个，而对照组为19.1 ± 2.3个，两者间差异无统计学意义，P > 0.05。降低tiRNA-His-GTG-001表达后细胞的迁移数目为8.2 ± 1.1个，与对照组(7.1 ± 0.9个)差异也无统计学意义，P > 0.05。该实验说明tiRNA-His-GTG-001对SOC细胞迁移的影响无统计意义。
无论是过表达tiRNA-His-GTG-001还是降低tiRNA-His-GTG-001表达，对SOC细胞的迁移数目均无统计学差异，均P > 0.05。(200×，标尺50 μm)
4. 讨论
转运RNA (tRNA)是翻译过程中的关键分子。这种分子以mRNA引导的方式将氨基酸递送到核糖体[10]。在核糖核酸酶的作用下，tRNA可被片段化，产生一类被称为tRNA衍生小RNA (tRNA-derived small RNAs, tsRNAs)参与了许多细胞的生理过程[11]。越来越多的证据表明，tsRNAs在各种疾病，尤其是癌症的发病机制中占据了关键的位置[12] [13]。异常表达的tsRNA通过多种机制促进肿瘤的发生发展。此外，tsRNAs具有成为肿瘤诊断生物标志物和治疗靶点的潜力[14]-[16]。同样，在卵巢癌中也存在着tRNA衍生小RNA的差异性表达，例如，高级别SOC患者和对照组之间共有27个tRFs存在差异表达，其中tRF-03357在HGSOC血清样本和SK-OV-3细胞中的表达水平显著高于对照组；tRF-03357显著下调HMBOX1表达促进了SK-OV-3细胞的增殖、迁移和侵袭[17]。在卵巢癌 A2780中，tRF-T11直接靶向癌基因TRPA1 mRNA的3’UTR。tRF-T11与AGO2相互作用，并通过RNAi途径抑制TRPA1 [18]。Chen等[19]通过分析卵巢癌样本中的tsRNAs，确定了20个上调和15个下调的tRF和tiRNA。Panoutsopoulou等[20]在两个独立的卵巢癌样本中研究了i-tRF-GlyGCC的预后潜力。结果发现i-tRF-GlyGCC水平升高是预测卵巢癌患者短期进展和不良治疗结局的不良独立价值。评估i-tRF-GlyGCC有助于卵巢癌的个体化预后和精准医疗决策。Zhou等[21]在5个卵巢癌细胞系中研究了tRF5-Glu，发现tRF5-Glu与BCAR3癌基因的3’UTR结合并抑制其表达。因此，tRF5-Glu过表达降低了PEO4和2008卵巢癌细胞的增殖，BCAR3和tRF5-Glu参与了卵巢癌细胞复杂的肿瘤异质性，可能为治疗干预提供新的靶点。
Figure 3. The migration effect of tiRNA-His-GTG-001 on SOC cells
图3. tiRNA-His-GTG-001对SOC细胞的迁移影响
本研究在3例SOC组织的tsRNAs表达谱中发现tiRNA-His-GTG-001表达水平升高，然后收集了63例SOC组织，通过qRT-PCR实验验证了tiRNA-His-GTG-001表达水平上调。该验证结果说明，tiRNA-His-GTG-001在SOC的发生发展中发挥了重要功能，tiRNA-His-GTG-001表达水平升高提示其在SOC的进展中发挥促癌基因的作用。通过四格交叉表统计分析发现，tiRNA-His-GTG-001的高表达水平与SOC的肿瘤大小和分化程度密切关联，而与患者其他的临床指标无相关性。该实验结果表明，tiRNA-His-GTG-001与SOC的增殖和肿瘤级别有关，即在SOC中tiRNA-His-GTG-001表达越高，肿瘤就处于高级别状态，因而就越能生长增殖，进一步说明了tiRNA-His-GTG-001促癌基因的功能，也可能成为SOC增殖活跃程度的标志物，并最终影响SOC的进展和预后。
进一步功能性研究发现，过表达tiRNA-His-GTG-001后，细胞增殖活性升高、克隆数目增多；降低tiRNA-His-GTG-001表达后，细胞增殖活性下降、克隆数目减少。再次提示tiRNA-His-GTG-001促进SOC细胞的增殖生长。而在迁移实验中，tiRNA-His-GTG-001表现出没有关联。本研究下一步将通过生物信息学预测tiRNA-His-GTG-001的调控的靶基因，以便发现tiRNA-His-GTG-001调控细胞增殖生长的可能机制，为临床的诊治提供一定的策略。
综上所述，tiRNA-His-GTG-001在SOC中表达水平升高，发挥促癌基因的作用。功能上tiRNA-His-GTG-001促进SOC细胞的增殖生长。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。