1. 引言
胃癌是一种与饮食、环境和遗传相关的多因素恶性肿瘤，是全球第五大最常见的癌症，其具有高度侵袭性和异质性[1]。胃癌目前仍然是肿瘤学领域的一个重大挑战，发病率是世界上第四大最常见的癌症[2]，而中国拥有全球最高的胃癌发病率，年龄标准化5年相对生存率仅为27.4% [3]。中国的胃癌新发病例占全球的44.1%，全球约50%的胃癌死亡病例发生在中国[4]。早期胃癌可以通过手术、放疗和化疗进行有效控制，从而延长生存期。而晚期胃癌患者的中位生存期不到1年，复发率高，预后不佳。因此，深入研究灵敏、特异的分子标志物及其相关机制，对于胃癌的诊断、治疗及预后具有重要意义。
目前有研究表明，线粒体对几乎所有与肿瘤发生相关的过程都有重大影响，包括恶性转化、肿瘤进展、对治疗的反应和抗癌免疫监视，并被作为开发新型抗癌药物的有前途的靶标[5]。线粒体核糖体蛋白(Mitochondrial ribosomal protein, MRPs)由核基因MRP家族编码，是线粒体翻译过程中不可缺少的组成部分。最近，有研究发现MRP基因还通过参与细胞增殖和凋亡与乳腺癌和结直肠癌有关[6] [7]，也有研究将线粒体核糖体蛋白S35 (MRPS35)确定为胰腺癌4662模型中一种以前未描述的新型内源性新抗原，用于监测响应免疫治疗的内源性肿瘤特异性CD8+ T细胞[8]。此外，MRPS35在结肠癌组织和结肠癌细胞中均显著高表达，其可能通过调控wnt/β⁃catenin信号通路抑制结肠癌的发生与发展[9]。然而，MRPS35在胃癌诊断、预后和免疫调节中的作用尚不清楚。
在本研究中，我们对MRPS35进行了全面的生物信息学分析，研究其对预后的影响，并进一步建立基于MRPS35的胃癌生存预测模型。我们的目的是帮助临床医生预测胃癌患者的风险，并为研究人员提供新的治疗方案。
2. 材料与方法
2.1. MRPS35在人类癌症中的差异表达
TIMER数据库、TCGA数据库和GTEx数据库检测MRPS35在泛癌组织中的表达，进一步应用UACLAN数据库分析MRPS35在胃癌亚型中的表达，最后利用CCLE数据库分析MRPS35在胃癌细胞系中的表达情况。
2.2. MRPS35基因组改变和甲基化分析
我们分别通过cBioportal和UACLAN探讨了MRPS35遗传学改变和甲基化水平在泛癌及胃癌中的预后价值。
2.3. 泛癌组织中MRPS35的基因–蛋白质相互作用网络
我们从UCSC下载了MRPS35的基因表达和临床数据。利用GeneMANIA和STRING数据库构建了MRPS35的基因–蛋白质相互作用网络。
2.4. 免疫功能分析
利用TIMER和XCELL工具监测MRPS35免疫学作用。采用TISIDB法分离MRPS35表达与免疫调节因子的关系，计算TMB值，并通过TCGA进行MSI评分。
2.5. 基因功能和通路的生物信息学分析
使用GEPIA数据库发现了胃癌中与MRPS35相关的前50个相似基因，随后进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)途径富集分析，在生物学功能水平上鉴定相关基因和途径。
2.6. 生存分析及预后模型建立
基于综合结果，我们开发了一种基于MRPS35的预后模型，通过校准曲线和时间依赖性受试者工作特征(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)进行评估。
2.7. 统计学分析
采用SPSS 25.0软件及R3.0.1软件进行统计学分析，采用独立样本t检验比较两组样本间的差异；采用例数(%)描述计数资料，运用χ2检验比较组间差异。采用Mann-Whitney u检验和Kruskal-Wallis检验评估MRPS35表达与临床病理参数的关系。采用Kaplan-Meier法和Cox比例风险模型进行生存分析，当P < 0.05时认为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. MRPS35在泛癌中的表达
首先，我们利用TIMER数据库分析了泛癌中的MRPS35表达水平，表明MRPS35在多种人类癌症中增加，特别是在胃癌中(图1(A))。接下来，我们结合了TCGA和GTEx癌症数据库，发现与正常组织相比，MRPS35基因在胃腺癌(STAD)组织中的表达更高(P < 0.0001) (图1(B))。我们进一步利用UACLAN数据库分析发现，MRPS35基因以亚型特异性方式上调，而且几乎在胃腺癌所有亚型中高度上调，尤其是弥漫性胃腺癌、管状胃腺癌及粘液胃腺癌(图1(C))。此外，通过CELL数据库分析验证，我们发现MRPS35在不同细胞系中表达水平不同，在胃腺癌细胞系SH10TC及MKN1中高度表达，而在LMSU细胞系中表达最低(图1(D))。
(A)
(B)
(C)
(D)
Figure 1. MRPS35 expression in tumor tissues, normal tissues, gastric cancer subtypes and gastric cancer cell lines. (A) MRPS35 expression in pan-cancer (TIMER database); (B) Expression of MRPS35 in pan-cancer analyzed by TCGA/GTEx database; (C) Differential expression of MRPS35 in gastric cancer subtypes (UACLAN database); (D) Differential expression of MRPS35 in cell lines (CCLE database) (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001)
图1. MRPS35在肿瘤组织、正常组织、胃癌亚型及胃癌细胞系中的表达。(A) MRPS35在泛癌中的表达(TIMER数据库)；(B) 通过TCGA/GTEx数据库分析MRPS35在泛癌中的表达；(C) MRPS35在胃癌亚型中的差异表达(UACLAN数据库)；(D) MRPS35在细胞系中的差异表达(CCLE数据库) (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001)
3.2. MRPS35的基因突变景观及异质性
我们使用cBioPortal分析了MRPS35突变相关特征，发现卵巢上皮肿瘤、精原细胞瘤、肺癌、子宫内膜癌、胃食管癌及胰腺癌中的突变频率高于其他类型的癌症(图2(A))。MRPS35在不同的肿瘤中具有不同的突变类型(图2(B))。此外，扩增是最常见的改变类型(图2(C))。进一步进行DNA甲基化分析表明，MRPS35表达可能受胃癌中DNA甲基化的调节(图2(D))。所有这些结果表明MRPS35基因变异影响MRPS35的预后能力。
3.3. MRPS35的免疫细胞浸润及肿瘤微环境
免疫系统在肿瘤发生和转移过程中发挥着关键作用[10] [11]，它根据肿瘤细胞的生化成分、抗原结构和生物学行为的不同，将肿瘤细胞与正常细胞区分开来，从而引发先天性免疫系统的识别。TIMER数据库用于揭示39种癌症的浸润水平与CCDC50表达之间的关系。在38种癌症中，MRPS35的表达与6种主要免疫细胞高度相关(图3(A))。MRPS35的表达水平与26种人类癌症的基质评分、31种癌症的微环境、39种癌症的67种免疫细胞以及24种癌症的免疫评分高度相关(图3(B))。总的来说，这些结果证实了MRPS35可以影响抗肿瘤免疫作用。
(A)
(B)
(C)
(D)
Figure 2. Mutational characterization analysis of MRPS35. (A) Mutation types of MRPS35 and distribution in different cancers; (B) Mutation hotspots of MRPS35; (C) Frequency of MRPS35 mutations in pan-cancer (cBioPortal database); (D) Correlation between MRPS35 methylation and expression
图2. MRPS35的突变特征分析。(A) MRPS35的突变类型和在不同癌症中的分布；(B) MRPS35的突变热点；(C) 泛癌中MRPS35突变频率(cBioPortal数据库)；(D) MRPS35甲基化与表达的相关性
3.4. MRPS35在泛癌中的交互作用网络
通过GeneMANIA分析了MRPS35基因与基因之间的相互作用网络(图4(A))。接着，利用STRING对种子基因MRPS35的相互作用–蛋白网络进行了分析。结果显示，我们在PPI网络中获得了几个节点和边(图4(B))。
(A)
(B)
Figure 3. Correlation between MRPS35 expression and immune infiltration. (A) Correlation between MRPS35 expression and immune infiltration levels in 38 human cancers using TIMER; (B) Correlation between MRPS35 expression and immune infiltration level in 38 human cancers using XCELL. (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001)
图3. MRPS35表达与免疫浸润之间的相关性。(A) 使用TIMER在38种人类癌症中MRPS35表达与免疫浸润水平之间的相关性；(B) 使用XCELL的38种人类癌症中MRPS35表达与免疫浸润水平之间的相关性。(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001)
(A)
(B)
Figure 4. MRPS35 interaction network at the gene and protein level. (A) Gene-gene interaction network of a single MRPS35 (GeneMANIA database); (B) Protein-protein interaction network of a single MRPS35 (STRING database)
图4. MRPS35在基因和蛋白质水平上的相互作用网络。(A) 单个MRPS35的基因–基因相互作用网络(GeneMANIA数据库)；(B) 单个MRPS35的蛋白质–蛋白质相互作用网络(STRING数据库)
3.5. MRPS35蛋白表达和生物学功能
在翻译水平上，基于CPTAC数据集，MRPS35在蛋白质组表达方面表现出显著差异(图5(A))。为了进一步分析GO和KEGG富集情况，我们利用GEPIA数据库发现了胃癌中与MRPS35相关的前50个相似基因。GO分析结果证实，MRPS35主要参与酰胺生物合成过程、肽生物合成过程、肽代谢过程、线粒体蛋白质复合体、线粒体和线粒体翻译延伸等(图5(B))。而KEGG结果提示MRPS35主要参与氨基酰-tRNA生物合成、大肠癌进展、RNA运输、代谢途径、碳代谢硒化合物代谢等通路(图5(C))。总之，MRPS35在调控胃癌恶性进展中发挥着至关重要的作用。
(A)
(B)
(C)
Figure 5. Proteomic and biological function analysis of MRPS35 in gastric cancer. (A) Proteomic level differences of MRPS35 gene between gastric cancer and normal tissues (CPTAC) (red indicates gastric cancer tissues, blue indicates normal tissues); (B) GO enrichment analysis of the top 50 similar MRPS35-related genes in gastric cancer; (C) KEGG enrichment analysis of the top 50 similar genes associated with MRPS35 in gastric cancer
图5. 胃癌MRPS35的蛋白质组学和生物学功能分析。(A) 胃癌和正常组织(CPTAC)之间MRPS35基因的蛋白质组学水平差异(红色表示胃癌组织，蓝色表示正常组织)；(B) 胃癌中MRPS35相关前50个相似基因的GO富集分析；(C) 胃癌中MRPS35相关前50个相似基因的KEGG富集分析
3.6. MRPS35在胃癌中的临床特征
我们还进一步探讨了MRPS35表达水平与胃癌临床特征的关系，结果显示，MRPS35表达水平与肿瘤分化程度(G分级)、淋巴结转移(N分期)和肿瘤分期(S分期)显著相关(P < 0.001, P < 0.001, P = 0.007)，但与患者年龄、性别、原发肿瘤范围和大小(T分期)、和远处转移(M分期)无关(P > 0.05) (表1)。
Table 1. Relationship between MRPS35 expression level and clinicopathologic characteristics of gastric cancer patients [n (%)]
表1. MRPS35表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系[n (%)]
临床病理特征 |
患者数量(n) |
MRPS35高表达(n = 177) |
MRPS35低表达(n = 177) |
P |
年龄(岁) |
|
|
|
|
>65 |
195 |
112 (63.28) |
83 (46.89) |
0.451 |
≤65 |
159 |
65 (36.72) |
94 (53.11) |
种族 |
|
|
|
|
亚洲 |
73 |
38 (21.47) |
35 (19.77) |
0.162 |
黑种人 |
10 |
6 (3.39) |
4 (2.26) |
白种人 |
223 |
100 (56.50) |
123 (69.49) |
性别 |
|
|
|
|
男 |
229 |
113 (63.84) |
116 (65.54) |
0.894 |
女 |
125 |
64 (36.16) |
61 (34.46) |
T分期 |
|
|
|
|
T1 + T2 |
84 |
33 (18.64) |
51 (28.81) |
0.831 |
T3 + T4 |
270 |
144 (81.36) |
126 (71.19) |
N分期 |
|
|
|
|
N0 |
67 |
12 (6.78) |
55 (31.07) |
< 0.001 |
N1~N3 |
287 |
165 (93.22) |
122 (68.93) |
M分期 |
|
|
|
|
M0 |
327 |
162 (91.53) |
165 (93.22) |
0.138 |
M1 |
27 |
15 (8.47) |
12 (6.78) |
G分级 |
|
|
|
|
G1 |
60 |
3 (1.69) |
57 (32.20) |
< 0.001 |
G2 + G3 |
294 |
174 (98.31) |
120 (67.80) |
S分期 |
|
|
|
|
S1 + S2 |
210 |
78 (44.07) |
132 (74.58) |
0.007 |
S3 + S4 |
144 |
99 (55.93) |
45 (25.42) |
3.7. MRPS35表达在胃癌中的预后价值及预后模型的建立
对于胃癌的预后，我们将胃癌患者的临床特征进行单因素及多因素COX分析，单因素COX分析结果显示，MRPS35的表达与胃癌的OS相关，此外，年龄、TNM分期，分化程度及S分期也是胃癌的预后因素，随后进一步行多因素COX分析，结果提示，分化程度、S分级及MRPS35表达水平与胃癌预后相关(表2)，这些证实了MRPS35在胃癌进展中起重要作用。在排除无显著统计学差异的变量并比较一致性指数后，我们将MRPS35、年龄、TNM分期、分化程度及S分期整合到nomogram图中(图6(A))，模型总体C-index为0.734 (95% CI, 0.693~0.775, P = 6.9e−29)。随后校准图(图6(B))证实nomogram图的预测与实际观察之间具有良好的一致性。模型预测OS的1年、3年和5年AUC值为0.820 (95% CI, 0.710~0.940)、0.760 (95% CI, 0.680~0.840)和0.750 (95% CI, 0.690~0.800) (图6(C))。因此，基于MRPS35的nomogram图在胃癌生存结局方面具有较高的预测准确性，它有望成为预测MPRS35胃癌患者生存的模型。进一步生存分析发现不同风险组的Kaplan-Meier曲线(图6(D))显示了高风险组和低风险组之间的生存差异。
Table 2. Univariate and multivariate Cox regression analysis of different parameters on OS in gastric cancer (n)
表2. 胃癌不同参数对OS的单因素和多因素Cox回归分析(n)
临床特征 |
患者数量(n) |
单因素分析 |
多因素分析 |
HR (95% CI) |
P |
HR (95% CI) |
P |
年龄(岁) |
|
|
|
|
|
>65 |
195 |
1.461 (1.039~2.053) |
0.029 |
1.206 (0.844~1.724) |
0.304 |
≤65 |
169 |
种族 |
|
|
|
|
|
亚洲 |
73 |
1.502 (0.842~1.313) |
0.657 |
|
|
黑种人 |
10 |
|
|
白种人 |
223 |
|
|
性别 |
|
|
|
|
|
男 |
229 |
1.428 (0.993~2.052) |
0.055 |
|
|
女 |
125 |
|
|
T分期 |
|
|
|
|
|
T1 + T2 |
84 |
2.219 (1.382~3.563) |
0.001 |
1.432 (0.856~2.396) |
0.172 |
T3 + T4 |
270 |
N分期 |
|
|
|
|
|
N0 |
67 |
3.369 (1.771~6.409) |
<0.001 |
1.610 (0.804~3.224) |
0.179 |
N1~N3 |
287 |
M分期 |
|
|
|
|
|
M0 |
327 |
2.564 (1.544~4.258) |
<0.001 |
1.711 (0.992~2.950) |
0.053 |
M1 |
27 |
G分级 |
|
|
|
|
|
G1 |
60 |
41.493 (5.801~296.736) |
<0.001 |
27.395 (3.765~199.309) |
0.001 |
G2 + G3 |
294 |
S分期 |
|
|
|
|
|
S1 + S2 |
210 |
3.503 (2.485~4.937) |
<0.001 |
1.952 (1.307~2.915) |
0.001 |
S3 + S4 |
144 |
MRPS35表达 |
|
|
|
|
|
低 |
177 |
2.438 (1.704~3.489) |
<0.001 |
1.283 (1.070~1.538) |
0.031 |
高 |
177 |
(A)
(B)
(C)
(D)
Figure 6. MRPS35-based prognostic model and its evaluation. (A) A nomogram predicting overall survival in patients with gastric cancer disease; (B) A nomogram calibration curve predicting 1-, 3- and 5-year overall survival; (C) Time-dependent subject operating characteristic curves for predicting 1-, 3- and 5-year overall survival based on the nomogram; (D) Kaplan-Meier survival curves for gastric cancer patients in different risk groups
图6. 基于MRPS35的预后模型及其评价。(A) 预测胃癌病患者总生存率的nomogram；(B) 预测1年、3年和5年总生存率的nomogram校准曲线；(C) 基于nomogram预测1年、3年和5年总生存率的时间依赖性受试者工作特征曲线；(D) 不同风险组胃癌患者的Kaplan-Meier生存曲线
4. 讨论
MRPS35是线粒体核糖体小亚基的组成部分，这个基因位于染色体12p11.22上，编码一个具有蛋白质产物的基因。MRPS35在细胞中扮演着关键角色，特别是在线粒体的蛋白质合成过程中。复合体I、II、III和IV的缺陷是线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)缺乏症最常见的原因，此外，线粒体核糖体缺乏症也可导致线粒体疾病[12]。研究表明癌细胞严重依赖线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)系统获取能量，而MRPs是OXPHOS系统的关键调节因子，参与OXPHOS酶复合物的组成，并与活性氧(ROS)的生成有关[13]。
泛癌分析对于研究揭示肿瘤分子标记物至关重要。既往已经有几项研究表明了MRPS35多种类型的癌症中的异常表达和潜在价值[14]-[17]。在本研究中，MRPS35在BLCA、BRCA、COAD、KICH、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、STAD和UCEC中表达较高。此外，我们进一步研究了MRPS35与突变之间的关系，结果提示在卵巢上皮肿瘤、精原细胞瘤、胰腺癌和胃食管癌的突变频率分别为7.02%、6.35%、4.35%和4.34%。此外，MRPS35表达与肿瘤中DNA甲基化密切相关，尤其是与STAD中的DNA甲基化呈负相关。TMB和MSI是癌症免疫检查点抑制剂的生物标志物[18] [19]。既往有研究表明，MRPS35可能与“War-burg效应”有关，即癌细胞在缺氧条件下表现出高糖酵解率的现象[20]。也有研究提示，某些MRPS35家族基因与细胞周期进程长短及细胞凋亡息息相关，而这些都是通过调控p21WAF1/CIP1、p27Kip1和p53来发挥作用[21] [22]。据报道，MRPS35可促进抑癌基因p21、p27表达，进而抑制肿瘤细胞增殖，还可促进E-钙黏蛋白表达，抑制肿瘤细胞上皮–间质转化，进而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力[23]。本研究结果显示，MRPS35表达水平与人类癌症中的免疫细胞浸润密切相关。
此外，我们发现MRPS35表达水平的降低是关键的独立预后因素，与较好的总生存率结果直接相关。ROC曲线作为诊断标志物的能力先前已在大量文献中报道，本研究中ROC曲线分析显示，MRPS35有望作为胃癌诊断的生物标志物，具有较高的特异性和敏感性。我们还发现MRPS35的表达因不同的GC细胞系和亚型而异，在胃腺癌细胞系SH10TC及MKN1中高度表达，而在LMSU细胞系中表达最低。mRNA表达水平的上调与相关基因扩增(MRPs中最常见的基因改变)以及DNA低甲基化相关。GO分析结果证实，MRPS35主要参与酰胺生物合成过程、肽生物合成过程、肽代谢过程、线粒体蛋白质复合体、线粒体和线粒体翻译延伸等。而KEGG富集结果提示MRPS35主要参与氨基酰-tRNA生物合成、大肠癌进展、RNA运输、代谢途径、碳代谢及硒化合物代谢等通路。
就预后价值而言，MRPs已被确定为转移和复发的有效预测标志物[24]。在本研究中，多因素COX分析结果提示，分化程度、S分级及MRPS35表达水平与胃癌预后相关，随后，我们选择最佳组合来构建基于MRPS35的预后模型用于胃癌生存预测。目前MRPS35基因很少被研究，将来可能成为治疗胃癌的潜在候选疗法。
综上所述，本研究全面分析了胃癌中MRPS35基因的表达、基因组突变、DNA甲基化、免疫微环境变化及预后价值，从生物信息学方面阐述了MRPS35的表达与胃癌临床病理因素之间的关系，表明了MRPS35作为胃癌预后和治疗的潜在生物标志物及靶点的前景。这项研究拓宽了我们对MRPS35在胃癌中应用的视野，但仍存在一些不一致之处。首先，我们只研究了MRPS35与RNA修饰、免疫浸润之间的关系，目前并未通过实验验证MRPS35对免疫细胞功能的影响。其次，尽管基于MRPS35的列线图表明良好的准确性和一致性，但是模型的构建仅基于生物信息学数据，缺乏大规模临床队列的验证，其预测稳定性有待考量，需后续进一步深入研究及证实。此外，尚未研究MRPS35基因与药物治疗效果之间的关联。最后，本研究需要大量的体内及体外实验来研究MRPS35在胃癌中的分子机制。
NOTES
*通讯作者。