铁棒锤挥发油的提取及生物活性研究

Research on the Extraction and Biological Activity of Volatile Oil from Aconitum pendulum Busch

摘要: 铁棒锤(Aconitum pendulum Busch)，系毛茛科(Ranunculaceae)乌头属(Aconitum)多年生草本植物，有极高的药用价值，常以块根入药，具有祛风除湿、活血止痛的功效。本研究使用气–质联用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC/MS)技术，从铁棒锤油状物组分中鉴定出27个化合物，其中脂类化合物数量最多。为进一步探究铁棒锤中挥发油的应用范围，对其进行了抑菌活性测定，实验结果表明该物质以计量依赖的方式对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑制效果，而对金黄色葡萄球菌无明显的抑制作用。

Abstract: Aconitum pendulum Busch, a perennial herb of the genus Aconitum in the family Ranunculaceae, has high medicinal value. Its tuberous roots are commonly used in traditional medicine for their effects in dispelling wind and dampness, promoting blood circulation, and relieving pain. In this study, Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC/MS) was used to identify 27 compounds from Aconitum pendulum Busch. To further explore the application scope of the volatile oil from Aconitum pendulum, its antibacterial activity was determined. The experimental results showed that this substance exhibited a dose-dependent inhibitory effect on Escherichia coli and Bacillus subtilis, while having no significant inhibitory effect on Staphylococcus aureus.

1. 引言

铁棒锤(Aconitum pendulum Busch)为毛茛科乌头属多年生草本植物，主产于我国青藏高原东缘及西南、西北高海拔山区，其植株形态特征鲜明，具有倒圆锥形块根，茎秆高度在26~100厘米之间且表面无毛，叶片呈宽卵形且两面均无毛被覆盖，7~9月开黄色或蓝色花。中医认为，铁棒锤块根性温、味辛苦，有大毒，经规范炮制后可入药，具祛风除湿、活血止痛之效，常用于治疗跌打损伤、风湿痹痛、骨折及冻疮等[1] [2]。现代药理研究表明，其药效物质基础主要为二萜生物碱及挥发油成分，具有抑菌、杀虫、抗炎、抗肿瘤等活性[3]。值得注意的是，生品因含高毒性乌头碱类成分[4]-[6]，需经水煮6~8小时等炮制工艺降低毒性，临床应用需严格控制剂量并配伍甘草等减毒药材。

挥发油作为中药材的重要次生代谢产物，主要通过水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法、微波提取法、超声波提取法、冷压榨法、酶解提取法等技术提取[7]，其成分涵盖萜类、芳香族化合物及脂肪族衍生物等。研究显示，用微波法与超声波法提取出的铁棒锤挥发油化学成分差异较大，说明不同方法对某些成分有着不同的针对性[8]。同时，中药挥发油对大肠杆菌等革兰氏阴性菌具有显著抑制作用，而对多数革兰氏阳性菌及真菌抑制效果较弱[9]，这种选择性抑菌活性为开发天然抗菌药物提供了实验依据。提取后的挥发油成分复杂，需借助现代分析技术进行分离鉴定。气–质谱联用仪(GC-MS)是解析挥发油成分的关键工具。该技术结合了气相色谱的高效分离能力与质谱的精准定性优势[10]，通过程序升温使挥发性成分按沸点和极性差异依次分离，再经电子轰击离子源(EI)生成特征碎片离子，结合数据库匹配，可快速鉴定化合物结构。

随着中医药现代化进程加速，天然药用植物活性成分的研究备受关注。但目前对铁棒锤中挥发油的探索存在明显不足，其化学成分尚未得到系统解析，抗菌活性方面的研究也相对较少。基于此，本研究采用气相色谱–质谱联用(GC-MS)等先进技术，剖析铁棒锤挥发油的化学组成，并通过体外抑菌实验，评估其对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果，期望挖掘该植物挥发油的潜在药用价值，为其在医药领域的合理开发与应用奠定理论基础。

2. 实验部分

2.1. 挥发油的提取与鉴定

2.1.1. 实验仪器与材料

本实验中所用到的主要仪器及生产厂家见表1。

Table 1. Main experimental instruments

表1. 主要实验仪器

仪器名称	型号	生产厂家
真空干燥箱	DZF-6010	巩义市予华仪器有限责任公司
循环水式真空泵	XS105	海门市其林贝尔仪器
旋转蒸发仪	N-1100	上海爱朗仪器有限公司
超声清洗器	KQ-250B	昆山市超声仪器有限公司
电子天平	XS105	瑞士梅特勒-托利多集
气质联用仪	7890B	安捷伦科技有限公司
超纯水机	Sartorius arium 611-UF	德国赛得利斯公司

本实验中所用到的试剂材料及生产厂家见表2。

Table 2. Main experimental reagents

表2. 主要实验试剂

试剂/材料	纯度/型号	生产厂家
甲醇	分析纯	天津市大茂化学试剂有限公司
二氯甲烷	分析纯	天津市大茂化学试剂有限公司
柱层析硅胶	200~300目	青岛海洋化工厂
大孔树脂	D101	西安蓝晓科技新材料股份有限公司

2.1.2. 挥发油的提取

将10 kg干燥的铁棒锤粉碎后经甲醇浸泡后减压浓缩，调节pH值至3，用二氯甲烷萃取得到二氯甲烷提取物。经大孔树脂柱层析法，甲醇–水体系作为洗脱剂进行脱色和粗分，分别以10%、30%、50%、80%、100%的甲醇分为组分A~E。取组分E经正相硅胶柱层析，以二氯甲烷–甲醇(50:1~1:1)为洗脱剂，得到油状物，使用气质联用仪对其进行分析。

GC条件：采用程序升温模式，色谱柱初始温度60℃，保持2 min，以5℃/min速率升温至280℃，保持2 min；汽化室温度设定为250℃，载气选用高纯氦气(即纯度 ≥ 99.999%)，恒压模式下柱前压力为52.7 kPa，平均流速1.0 mL/min，分流比40:1，进样量1.0 μL。

EI条件：采用电子轰击离子源(EI+)，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70 eV，发射电流34.6 μA，倍增器电压1388 V；接口温度与柱终温同步(280℃)，溶剂延迟5 min，质量扫描范围m/z 10~550 amu。

2.1.3. 挥发油成分的鉴定

如表3所示，从铁棒锤油状物中鉴定得到27个化合物，以脂类化合物为主，其占比达81.5%，包括十六烷酸甲酯、亚油酸乙酯等脂肪酸衍生物。

2.2. 挥发油的抗菌活性研究

2.2.1. 实验仪器与材料

本实验中所用到的主要仪器及生产厂家见表4。

Table 3. GC-MS determination results of oily substance in Aconitum pendulum Busch

表3. 铁棒锤油状物的GC-MS测定结果

序号	化学名称	保留时间	化学式
1	Octanoic acid, methyl ester	9.78	C9H18O2
2	Dodecane	11.9	C12H26
3	Nonanoic acid, 9-oxo-methyl ester	18.86	C10H18O3
4	2,4-Di-tert-butylphenol	20.69	C14H22O
5	Methyl tetradecanoate	24.87	C15H30O2
6	14-Pentadecenoic acid	26.81	C15H28O2
7	Pentadecanoic acid, methyl ester	27.13	C16H32O2
8	13-Methyltetradec-9-enoic acid methyl ester	27.35	C16H30O2
9	Methyl 16-hydroxyhexadecanoate	27.59	C17H34O3
10	Hexadecanoic acid, methyl ester	29.26	C17H34O2
11	cis-10-Heptadecenoic acid methyl ester	31.64	C18H36O2
12	9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-, methyl ester	32.77	C19H34O2
13	7-Methyl-Ztetradecen-1-ol acetate	33.5	C19H34O2
14	Methyl stearate	34.37	C19H38O2
15	Linoleic acid ethyl ester	34.84	C20H36O2
16	Cyclopropaneoctanoic acid, 2-octyl-, methyl ester	35.59	C20H38O2
17	Methyl 9.cis.,11.trans.t,13.trans.-octadecatrienoate	36.02	C19H32O2
18	6,9,12-Octadecatrienoic acid, methyl ester	36.42	C19H32O2
19	cis-11,14-Eicosadienoic acid, methyl ester	37.1	C21H38O2
20	Linoleic acid ethyl ester	37.37	C20H36O2
21	Methyl 2-[2-({2-[2-((2-pentylcyclopropyl) methyl)cyclopropylmethyl]cyclopropyl}methyl)ethyl]butanoate	37.49	C25H42O2
22	Eicosanoic acid, methyl ester	37.62	C21H42O2
23	Pyrano[4,3-b]benzopyran-1,9-dione,5a-methoxy-9a-methyl-3-(1-propenyl)perhydro	38.17	C17H24O5
24	Pentyl linoleate	39.07	C23H42O2
25	Campesteroln	39.99	C28H48O
26	(Z)-13-Docosenoic acid, methyl ester13	40.53	C23H44O2
27	Methyl 20-methyl heneicosanoate	40.96	C23H46O2

Table 4. Main experimental instruments

表4. 主要实验仪器

仪器名称	型号	生产厂家
超净工作台	SW-CJ-2D	苏州净化设备有限公司
立式压力蒸汽灭菌锅	BXM-30R	上海博讯实业有限公司医疗设备厂
恒温培养箱	SPX-250-GB	上海琅玹实验设备有限公司

续表

恒温摇床	TS系列	上海习仁科学仪器有限公司
电子天平	XS105	瑞士梅特勒–托利多集
超声清洗器	KQ-250B	昆山市超声仪器有限公司
真空干燥箱	DZF-6010	巩义市予华仪器有限责任公司
循环水式真空泵	XS105	海门市其林贝尔仪器
旋转蒸发仪	N-1100	上海爱朗仪器有限公司

本实验中所用到的试剂材料及生产厂家见表5。

Table 5. Main experimental reagents

表5. 主要实验试剂

试剂	纯度	生产厂家
琼脂	生化试剂	上海广瑞生物科技有限公司
蛋白胨	生化试剂	天津市大茂化学试剂有限公司
酵母提取物	生化试剂	北京奥博星生物科技有限责任公司
氯化钠	分析纯	天津市大茂化学试剂有限公司
乙醇	分析纯	天津市大茂化学试剂有限公司

本实验所使用的病源菌菌株均由兰州交通大学天然药物研究所提供，3种供试菌株分别为：大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

2.2.2. 实验操作

菌悬液的制备：在超净台内进行无菌操作，使用灭菌接种环从斜面培养基或甘油冻存管中挑取少量菌体，于固体培养基平板表面进行四区划线接种。将平板倒置放入37℃恒温培养箱，培养18~24小时直至单菌落充分形成。用接种环挑取单菌落接种于5~10 mL液体培养基，置于振荡培养箱中以200 rpm转速进行恒温培养4~6小时。待菌体进入对数生长期(OD₆₀₀约为0.6~0.8)，将培养液转移至灭菌离心管，3000~5000 rpm离心5分钟收集菌体。弃上清液后，加入无菌生理盐水重悬沉淀，通过梯度稀释法校准浓度，最终制备成活菌密度为10⁶~10⁸ CFU/mL的菌悬液。

LA培养基(1 L)：10 g蛋白胨，5 g酵母提取物，5 g氯化钠，16 g琼脂，混合加热溶解，压力蒸汽灭菌锅121℃、103.4 kPa，灭菌30 min。

在无菌操作台中，将灭菌后的LA液体培养基冷却至50℃，取25 mL趁热倒入无菌培养皿(直径90 mm)，静置30分钟待其完全凝固。取100 μL菌悬液滴加于LA平板表面，使用无菌涂布棒轻柔涂布均匀，室温静置5分钟使菌液完全渗入培养基。随后，使用5 mm打孔器获取滤纸片并高温灭菌，用无菌镊子取灭菌后的滤纸片，对称贴置于平板表面两侧。

将挥发油样品用无菌溶剂分别配制成1 mg/mL、3 mg/mL、5 mg/mL待测液，取10 μL滴加于一侧滤纸片中央；另一侧滤纸片滴加10 μL同体积纯溶剂作为空白对照，用抑菌纸作为阳性对照。每个处理设置3组平行实验，平板倒置放入37℃恒温培养箱，培养24小时后观察抑菌圈形成情况，使用游标卡尺以十字交叉法测量抑菌圈的直径。

3. 讨论与结论

Figure 1. The inhibitory effect on Escherichia coli

图1. 对大肠杆菌的抑制效果

Figure 2. The inhibitory effect on Bacillus subtilis

图2. 对枯草芽孢杆菌的抑制效果

Table 6. The inhibition results of 5 mg/mL Aconitum pendulum volatile oil against three kinds of bacteria

表6. 5 mg/mL铁棒锤挥发油对三种细菌的抑制结果

菌株	抑菌圈直径
大肠杆菌	8.06 ± 0.14
枯草芽孢杆菌	11.31 ± 0.71
金黄色葡萄球菌	-

中药挥发油是中药材中具挥发性的油状活性成分，也是中药药效物质的重要组成部分，其在传统方剂及现代制剂中应用广泛。本研究提取了铁棒锤块茎中挥发油成分，并进行气相色谱–质谱联用(GC-MS)分析，鉴定出27个化合物，并对其展开体外抑菌活性实验，测试菌株包括：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。图1表明，铁棒锤挥发油对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用呈剂量依赖性，1 mg/mL时挥发油对大肠杆菌的抑制效果不明显(抑菌圈直径为5.69 mm)，3 mg/mL时抑菌圈直径为6.25 mm，同样抑制效果较弱，直至浓度提高到5 mg/mL才显示出一定的抑制作用(抑菌圈直径为8.06 mm)；图2表明，1 mg/mL的挥发油对枯草芽孢杆菌已表现出明显的抑制作用(抑菌圈直径为7.32 mm)，提高浓度至3 mg/mL后，抑制效果也有一定的增强(抑菌圈直径为10.04 mm)，当浓度升至5 mg/mL时的抑制效果与阳性对照相差不大(抑菌圈直径为11.31 mm)；而对金黄色葡萄球菌无抑制作用(如表6所示)。

本文研究了铁棒锤中挥发油部分的成分，从中鉴定出27种化合物，其中脂类化合物占81.5%，并对挥发油进行了体外抑菌活性测定，证明该挥发油对枯草芽孢杆菌的抑制效果较为明显，对大肠杆菌有微弱的抑制作用，而对金黄色葡萄球菌无抑制作用。以上结论说明铁棒锤油状物在抗菌领域有着潜在的应用价值，并为后续进行开发相关应用提供一定依据。