1. 引言
光材料被广泛应用于社会的各个领域，对社会的发展至关重要，有机发光材料具有光色易调、发光效率高、功耗低、响应速度快、易加工、成膜性好等优点，其中三苯胺型光敏剂具有聚集诱导发光效应。该类分子通常情况下在其稀溶液中的荧光强度较低，而一旦溶液的浓度升高或者是以固态形式存在，该类光敏剂的荧光会急剧增强，且其作为新型光敏剂能够克服传统光敏剂的缺陷，因此被众多科研工作者所重视并作为合成目标。
光动力疗法(PDT, photodynamic therapy)是一种很有前途的非侵入性癌症治疗方式。因此，在过去的几十年里，光敏剂(Photosensitizer, PS)的开发已成为超分子化学的一个重要研究课题[1] [2]。光动力治疗作用原理是给予吸收了光敏剂的病变部位适当波长的光照，通过光敏剂介导的和氧分子参与的能量和/或电子转移，在病变组织内产生具有细胞毒性的单线态氧、自由基等具有细胞毒性的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)，通过氧化损伤作用破坏靶部位细胞器的结构和功能，引起靶细胞的凋亡和坏死。具有非侵入性、高治愈率和低副作用等优点[3] [4]，是传统癌症治疗的替代方案之一，除此之外光动力治疗的优势还在于经特定波长的光照射激活后才发挥作用从而将全身毒性降低；无创或微创；可与手术、化疗或放疗联合治疗[5] [6]。
然而，传统光敏剂存在单线态氧产率低、靶向性差、水溶性不佳等问题。本文设计并合成了一种基于苯胺结构的聚集诱导发光(AIE)型光敏剂，通过优化分子结构提高ROS生成效率，并探索其在PDT中的应用潜力。
2. 仪器与材料
2.1. 仪器
层析柱型号为C184323闪式层析柱，外径(mm) 32，内径(mm) 26，有效长度305 mm，有砂芯，磨口24/40，分液漏斗为250 mL，均为欣维尔仪器市售仪器。化合物在合成过程中所用薄层层析硅胶板为G板/GF254硅胶板(购于烟台新诺新材料技术有限公司)，在紫外灯254 nm和365 nm下进行主要成分的鉴定。固定相采用100~200目与200~300目硅胶(购于烟台新诺新材料技术有限公司)，用于化合物的柱层析分离。目标化合物由质谱、1H NMR确证结构。质谱采用超高效液相色谱–串联质谱检测(UPLC-MC)系统测定，核磁共振氢谱经Bruker AVANCE 300 MHz型核磁共振仪测定，氘代试剂以四甲基硅烷(TMS)作为内标。YXQ-LS-50SⅡ立式蒸汽灭菌器(上海博迅实业公司医疗设备厂)，TD5离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)，tecan infinite 200pro酶标仪(瑞士，Tecan)，移液枪(德国，Eppendorf)，BIOBASE超净工作台(山东博科集团)，HERAcell 150i型CO2恒温培养箱(美国，Thermo Scientific)，DK-8D恒温水浴锅(苏州江东精密仪器有限公司)，−80℃冰箱(美国，Thermo Scientific)，AUY120分析天平(日本，SHIMADZU)。
2.2. 材料
2,5-二溴噻吩，4-硼酸三苯胺，4-吡啶硼酸频哪醇酯，5-溴噻吩-2-甲醛，4-溴苯乙腈，间溴苯乙腈，碳酸钾，四(三苯基磷)钯，硫酸钠，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯，无水乙醇，超干乙醇，1,4-二氧六环等反应原料及催化剂均为毕得医药生产的市销的分析纯(AR)级产品，未经处理直接用于实验，浓度为10%的氢氧化钾溶液为实验室自己配置，所用的石油醚沸程为60℃~90℃，二氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇，均为上海凌峰化学试剂有限公司的市销分析纯(AR)级产品，HepG2细胞(北京裕恒丰生物科技有限公司)，MCF7细胞(北京裕恒丰生物科技有限公司)，DMEM (basic1×)培养基(美国，Gibco)，FBS (美国，Gibco赛奥美(北京)细胞技术有限公司)，PBS (北京索莱宝科技有限公司)，双抗(青霉素(1000 U/mL)和链霉素(10 mg/mL))溶液(南京生航生物科技有限公司)，DMSO (北京索莱宝科技有限公司)，胰酶(南京森贝伽生物科技有限公司)，CCK-8试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，T25/T75细胞培养瓶(美国，Thermo Labserv)，96孔板(美国，Thermo LabServ)，纯净水(杭州娃哈哈有限公司)。
3. 实验部分
3.1. 光敏剂的合成与表征
3.1.1. 4-(5-溴噻吩-2-基)-N,N-二苯基苯胺(a)
于干燥的100 mL茄形瓶中，称取4-硼酸三苯胺(720 mg, 2.5 mmol, 1 eq)，无水碳酸钾(1.382 g, 10 mmol, 4 eq)，Pd(PPh3)4 (58 mg, 0.05 mmol, 0.02 eq)溶于50 mL甲苯:水 = 4:1的混合溶剂中，加入2,5-二溴噻吩(560.0 mg, 2.3 mmol, 0.98 eq)，在氩气保护下98℃反应。反应结束后，用氯仿萃取(35 mL × 3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析分离(PE:DCM = 40:1, v/v)，得到淡黄色固体537.9 mg，收率为57.6%。1H NMR (300 MHz, CDC13) δ 7.40 - 7.31 (m, 2H), 7.31~7.19 (m, 4H), 7.15~6.89 (m, 10H). Chemical formula: C22H16BrNS. cal m/z: 406.02 [M + H]+. ESI-MS m/z: 406.05 [M + H]+.
3.1.2. 5-(吡啶-4-基)噻吩-2-甲醛(b)
于干燥的25 mL茄形瓶中，称取4-吡啶硼酸频哪醇酯(643.9 mg, 3.14 mmol, 1.2 eq)，无水碳酸钠(416.5 mg, 3.93 mmol, 1.5 eq)溶于8 mL 1,4-二氧六环与2.7 mL超纯水的混合溶剂中，加入5-溴噻吩-2-甲醛(0.28 mL, 2.62 mmol, 1 eq)，在氩气保护下加热回流18 h。反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取(50 mL × 3)，合并有机相，滤除不溶物(硅藻土助滤)，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，减压浓缩，柱色谱分离(DCM:MeOH = 120:1, v/v)，得到浅黄色固体494.8 mg，收率为99.8%。Chemical formula: C10H7NOS. cal m/z: 190.02[M+H]+. ESI-MS m/z: 190.50[M+H]+.
3.1.3. 2-(4-溴苯基)-3-(5-(吡啶-4-基)噻吩-2-基)丙烯腈(b2)
于干燥的50 mL圆底烧瓶中，称取中间体b1 (495.8 mg, 2.62 mmol, 1 eq)和4-溴苯乙腈(513.6 mg, 2.62 mmol, 1 eq)溶于25 mL乙醇中，室温搅拌5分钟，加入5滴10% KOH，升温至50℃反应半小时，TLC监测，KMnO4显色。反应结束后，减压浓缩，硅胶柱层析分离(PE:EA = 10:1~40:1洗去杂质，后用甲醇快速洗脱目标物)，得到亮黄色固体886.6 mg，收率为92.1%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.68~8.60 (m, 2H), 7.64~7.41 (m, 9H). Chemical formula: C18H11BrN2S. cal m/z: 366.98 [M + H]+. ESI-MS m/z: 365.97 [M + H]+.
3.1.4. 3-(5-(吡啶-4-基)噻吩-2-基)-2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)丙烯腈(b3)
于干燥的200 mL茄形瓶中，称取中间体b2 (885.1 mg, 2.41 mmol, 1 eq)，连硼酸频哪醇酯(733.9 mg, 2.89 mmol, 1.2 eq)，KOAc (709.6 mg, 7.23 mmol, 3 eq)，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(175.6 mg, 0.24 mmol, 0.1 eq)，溶于55 mL无水1,4-二氧六环中，在氩气保护下100℃反应24 h。反应结束后，加入10 体积的超纯水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取(30 mL × 3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，硅胶柱色谱分离(PE:EA = 10:1, v/v~MeOH)，得到暗黄色固体430.0 mg，收率为91.6%。Chemical formula: C24H23BN2O2S. cal m/z: 415.16 [M + H]+. ESI-MS m/z:415.14 [M + H]+.
3.1.5. 2-(4-(4-(二苯胺基)苯基)噻吩-2-基)苯基)-3-(5-(吡啶-4-基)噻吩-2-基)丙烯腈(B)
于干燥的50 mL茄形瓶中，称取中间体e (373.8 mg, 0.92 mmol, 1 eq)，中间体b3 (451.0 mg, 1.1 mmol, 1.2 eq)，无水碳酸钾(63.6 mg, 0.46 mmol, 0.5 eq)，Pd(PPh3)4 (32.4 mg, 0.028 mmol, 0.03 eq)溶于16 mL 1,4-dioxane:水 = 3:1的混合溶剂中，在氩气保护下110℃反应28 h。反应结束后，将反应液倒入120 mL冰水中，用DCM萃取(30 mL × 3)，合并有机相，抽滤(硅藻土助滤)除去萃取过程中产生的絮状物，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析分离(DCM:MeOH = 99:1, v/v)，得到暗红色固体148.3 mg，收率为26.3%。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.47 (dd, J = 146.5, 62.1 Hz, 1H), 7.99~7.43 (m, 13H), 7.42~7.17 (m, 6H), 7.14~6.96 (m, 7H). 高效液相色谱及质谱结果见图1。Chemical formula: C40H27N3S2. cal m/z: 614.16 [M + H]+. ESI-MS m/z: 614.16 [M + H]+.
Figure 1. Liquid chromatography and mass spectrometry of the photosensitizer
图1. 光敏剂的液相色谱与质谱
3.2. 光敏剂的理化性质测试
3.2.1. 光敏剂的紫外可见吸收光谱
准备三根的50 mL石英管，分别称取2 mg光敏剂加入其中，在第一、第二根石英管中，分别加入EtOH，DCM，并定容至50 mL，于第三根石英管中先加入0.5 mL DMSO，超声溶解后再加入49.5 mL超纯水，混匀后得到测试液，上机测试。
3.2.2. 光敏剂的活性氧生成能力测试
称取0.5 mg DCFH-DA，加入1 mL无水乙醇溶解，再加入4 mL 0.01 M NaOH(aq)，室温搅拌30 min以激活探针，再加入20 mL 1 × PBS得到4 × 10−5探针使用液，在10 mL棕色样品瓶中加入1 mL 14.8 μM 的PS或RB水溶液(加1% DMSO助溶)，1 mL的探针使用液，8 mL 1 × PBS，之后用氙灯进行光照，时间分别为0，30，60，90，120，150 s。稀释10倍后用于荧光光谱测定(激发光：490 nm，检测范围：500~800 nm，峰值523 nm)。
3.2.3. 光敏剂的单线态氧生成能力测试
称取4.1 mg ABDA，加入1 mL DMSO溶解，转移至100 mL量瓶，加入超纯水定容，得到100 µM的ABDA探针储备液；在10 mL棕色样品瓶中加入3 mL PS UV-Vis的测试液(16.4 µM)，3 mL的探针储备液，4 mL 1 × PBS，之后进行光照，时间分别为0，1，2，3，4，5 min。直接用于UV-Vis测定(检测：399 nm)。
3.3. 光敏剂的细胞实验
3.3.1. 光敏剂的生物相容性测试
HepG2细胞和MCF7细胞采用的完全培养基配方为：含10% FBS和1%青霉素和链霉素双抗的高糖DMEM培养液。将细胞从−80℃冰箱中取出对应细胞冻存管，置于37℃水浴中快速摇晃解冻使细胞复苏。再加入1 mL PBS重悬，离心弃上清。用完全培养基重悬后，将细胞种入T75细胞培养瓶，置于细胞培养箱中培养(37℃, 5% CO2)。每两天进行细胞换液。待T75瓶中细胞长满后，以1:2进行细胞传代至细胞生长状态稳定后用于测试。
将光敏剂用无血清完全培养基(含1%青霉素和链霉素双抗的高糖DMEM培养液)：DMSO = 99:1作溶剂，预先配制成浓度为1 mM的母液，再用培养基将其稀释到不同浓度的工作液。
将处于对数生长期的细胞，进行细胞计数，将细胞以5 × 103个/孔的密度接种于96孔板中，每孔200 μL，于细胞培养箱中孵育培养过夜，使细胞贴壁。分组：不同浓度的光敏剂(100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM, 1 μM, 0.1 μM)，空白对照(铺板时加入细胞，给药时加入培养基)，背景(铺板时加入培养基，给药时加入培养基)。用培养基配制不同浓度的光敏剂溶液以换液的方式分别加入96孔板中，每孔200 μL，并设置3个复孔。给药后，将96孔板置于细胞培养箱中(37℃, 5% CO2)孵育12 h，孵育结束后，弃去培养基，用PBS洗涤孔板3次。以换液的方式加入200 μL含10% cck-8的完全培养基。孵育 3.5 h后用酶标仪测试450 nm处的OD值。
3.3.2. 光敏剂的光毒性测试
细胞系种类及培养方式与生物相容性测试一致，96孔板铺板细胞密度以及给药方式也与生物相容性测试一致。给药后，将96孔板置于细胞培养箱中(37℃, 5% CO2)孵育12 h，孵育结束后，用400 nm光照20 min，继续孵育12 h。弃去培养基，用PBS洗涤孔板3次。以换液的方式加入含10% cck-8的完全培养基。孵育3.5 h后用酶标仪测试450 nm处的OD值。
4. 结果与讨论
4.1. 光敏剂的紫外可见吸收光谱
由图2得，光敏剂的最大吸收波长在400 nm附近，因此后续细胞实验的激发光波长定为400 nm。
4.2. 光敏剂的活性氧生成能力测试
由图3可知，新设计合成的光敏剂的活性氧生成能力优于阳性参照物p-o-1。
4.3. 光敏剂的单线态氧生成能力测试
由图4可知，新设计的光敏剂能使ABDA的吸光度下降56.7%，表现出良好的单线态氧生成能力。
Figure 2. UV visible absorption spectra of photosensitizer
图2. 光敏剂的紫外可见吸收光谱
Figure 3. (A) Fluorescence spectra of p-p-Thi after adding reactive oxygen species probe DCFH-DA; (B) The trend of fluorescence intensity over time
图3. (A) p-p-Thi添加活性氧探针DCFH-DA后的荧光光谱；(B) 荧光强度随时间的变化趋势
Figure 4. (A) UV visible absorption spectra of p-p-Thi with added singlet oxygen probe ABDA; (B) The trend of p-p-Thi absorbance over time
图4. (A) p-p-Thi添加单线态氧探针ABDA后的紫外可见吸收光谱；(B) p-p-Thi吸光度随时间变化趋势
4.4. 光敏剂的细胞实验
从图5可知新合成的光敏剂在不经光照的条件下对HepG2和MCF7两种细胞均没有显著的毒性，且光敏剂对细胞的杀伤作用没有明显的浓度依赖性，过高或过低的浓度均使得杀伤效果减弱，且过高的光敏剂浓度会由于激活癌细胞促生存信号通路如NF-κB，HIF-1α等反而促进癌细胞增殖。在实验的浓度梯度中光敏剂C2即p-p-Thi杀伤HepG2与MCF7细胞的最佳浓度均为3.125 µM。
Figure 5. (A) Biocompatibility and photolethality testing of photosensitizers on HepG2 cells; (B) Biocompatibility and photolethality testing of photosensitizers on MCF7 cells
图5. (A) 光敏剂对HepG2细胞的生物相容性以及光杀伤能力测试；(B) 光敏剂对MCF7细胞的生物相容性以及光杀伤能力测试
5. 结论
本研究设计并合成了一种新型三苯胺型聚集诱导发光(AIE)光敏剂，用于肿瘤的光动力治疗(PDT)。通过电子供体与受体芳香环的共轭连接，优化了光敏剂的分子结构，显著提高了其活性氧生成能力。
通过多步反应合成了目标光敏剂，并通过质谱和核磁共振氢谱确认了其结构。合成过程中采用了Suzuki偶联等关键反应，最终产物收率为26.3%。其最大吸收波长在400 nm附近，为后续细胞实验的激发光波长选择提供了依据。新设计的光敏剂在ROS生成能力上优于阳性参照物，尤其在单线态氧生成能力测试中表现出色(56.7%)。
在无光照条件下，光敏剂对HepG2和MCF7细胞无明显毒性，表明其具有良好的生物相容性。在400 nm光照条件下，光敏剂对肿瘤细胞表现出显著的光杀伤效果，最佳浓度为3.125 µM。杀伤效果与浓度相关，但过高或过低浓度均会减弱效果。
6. 总结与展望
本文采用电子供体与受体芳香环的共轭连接设计并合成了一种新型三苯胺型聚集诱导发光型光敏剂。新型三苯胺型AIE光敏剂具有高效的ROS生成能力和低毒性，为光动力治疗提供了潜在的高效工具。通过波长拓展、纳米递送系统和联合治疗策略，有望进一步推动此类光敏剂的临床转化。光敏剂的“智能化”与“多功能化”将成为下一代PDT研究的核心方向。该光敏剂在精准肿瘤治疗中具有重要应用前景，其优异的性能为克服传统光敏剂的缺陷(如低ROS产率、靶向性差等)提供了新思路。
基金项目
中国药科大学高层次人才引进项目(3150050052)；中国药科大学大学生创新创业训练计划项目(3322400295)。
NOTES
*通讯作者。