1. 目的
急性心肌梗死(AMI)是全球主要死亡原因之一，经皮冠状动脉介入治疗是恢复受累心肌血流的主要方法。然而，再灌注可导致心肌损伤，这是影响AMI患者预后的重要因素[1]。缺血/再灌注(I/R)会引发一系列不良事件，包括ROS过度产生、铁死亡、钙超载、炎症、凋亡和线粒体功能障碍，导致细胞代谢和能量供应中断。这最终会导致心肌细胞死亡和心肌损伤[2] [3]。目前，影响再灌注损伤的因素尚未完全明确，明确这些因素有助于发现更多保护再灌注后心脏功能的策略。
白脂素(Asprosin)是一种新发现的脂肪因子，由Romere等人在2016年对新生儿早老症综合征的研究中鉴定出来。它由位于15号染色体q21.1上的纤维蛋白-1 (FBN1)基因的最后两个外显子(65和66)编码，并且来源于纤维蛋白前体的C末端，该前体由FBN1基因编码[4] [5]。白脂素可以增强间充质干细胞(MSCs)对缺血性心脏病的治疗效果[6]。研究表明，白脂素有助于改善糖尿病小鼠的心脏微血管内皮损伤，降低心肌细胞中ROS的含量，对心脏具有保护作用，并且可以显著改善左心室功能[7]-[9]。并且可能降低扩张型心肌病(DCM)患者的不良临床结果的风险[9]。然而，目前尚不清楚白脂素是否参与心肌细胞的线粒体自噬。
线粒体自噬是通过线粒体自噬介导的溶酶体降解选择性去除受损或不必要的线粒体的过程。近年来，越来越多的证据表明，调节自噬在减轻心肌缺血再灌注损伤方面起着重要作用[10] [11]。尽管传统上认为线粒体自噬是一种保护机制，但人们也认识到，虽然适度的线粒体自噬可以维持线粒体健康并维持能量生产，但在没有线粒体生物合成的情况下过度的线粒体自噬可能对细胞有害[12]。因此，自噬的具体作用仍然是一个激烈争论的话题。然而，目前尚不清楚白脂素是否可以通过影响线粒体自噬来保护I/R后的心肌细胞。
目前的多条证据表明白脂素在心肌保护中发挥积极作用，但其在心肌缺血再灌注损伤中的功能仍有待探索。本研究旨在阐明白脂素在心肌缺血再灌注损伤中的疗效，并探讨白脂素和线粒体在心肌细胞中的相互作用，为理解白脂素在心肌中的作用提供病理生理学基础，并为心肌缺血再灌注损伤提供新的治疗靶点。
2. 方法与材料
2.1. H9c2细胞培养
H9c2细胞购自中国科学院细胞库(上海，中国)。培养时使用H9C2细胞专用培养基，在37℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞密度达80%~90%时需传代。先弃去旧培养基，加入1~2 mL胰蛋白酶消化液，在室温消化1~2分钟至细胞脱离瓶壁。轻敲培养瓶，使细胞完全脱落，再加入含血清的培养基终止消化。之后，以1000 rpm离心5分钟，弃去上清，用新鲜完全培养基重悬细胞，按1:3的比例分装到含有适量培养基的新培养瓶中继续培养。
2.2. 细胞缺氧/复氧模型
H9c2细胞在标准条件下于37℃用含10% FBS的DMEM培养24小时。用PBS洗涤两次后，将细胞置于有厌氧产气袋的厌氧密封培养盒中6小时诱导H/R。随后，将培养基更换为含10% FBS的高葡萄糖DMEM，并在37℃、95% O2和5% CO2的复氧条件下孵育12小时。白脂素预先给予三种浓度(50、100或150 nM)，持续12小时。
2.3. 细胞内ROS水平测定
将细胞按要求接种到6孔板中，并依据分组实施相应处理。用DMEM按1000:1的比例对DCFH-DA进行稀释。移除孔内培养液后，加入1 ml已稀释好的DCFH-DA溶液，确保覆盖所有细胞。置于37℃、5% CO2的培养箱中孵育20分钟。随后，用DMEM清洗细胞3次，直至彻底去除多余DCFH-DA。清洗完毕后，将共聚焦小皿放置在激光共聚焦显微镜下进行观察，拍摄时要迅速且高效，采用488 nm的激发波长来检测各组细胞的荧光强度。运用ImageJ软件对细胞荧光进行定量分析，获取平均荧光强度值后，再利用GraphPad软件进行作图。
2.4. 细胞活性测定
通过CCK-8检测试剂盒(Sigma-Aldrich; Merck KGaA)和LDH检测试剂盒(Promega Corp.)来评估细胞活性。将H9c2细胞以每孔5 × 105个细胞的密度接种于96孔板中。向每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育4小时后测量450 nm处的光密度(OD)。对于LDH检测，向收集的培养基中加入LDH试剂，在室温下避光孵育30分钟。使用分光光度计在490 nm处定量OD值。通过比较实验组与对照组在CCK-8检测中的OD值计算细胞存活率。通过比较实验组与对照组在LDH检测中的OD值确定相对细胞死亡率。
2.5. 线粒体膜电位评估
参照线粒体膜电位试剂说明书开展实验，首先配制JC-1染色工作液，按200:1的比例用染色缓冲液对JC-1 (200×)进行稀释，借助移液器反复吹打使其充分混匀，制备完成后待用。随后，将CCCP (10 mM)按1:1000的比例添加到各组细胞培养液里，使其稀释至10 μM，对细胞进行20分钟的处理。处理结束后，移除各组细胞培养液，用PBS缓冲液对细胞进行一次清洗，之后加入适量不含抗生素的培养液，再加入等体积的JC-1工作液，充分混合均匀，在37℃培养箱内孵育20分钟。孵育完成后，吸取掉各组细胞培养皿中的残余液体，用JC-1染色缓冲液对细胞洗涤2次，最后加入适量不含抗生素的细胞培养液，在荧光显微镜下对细胞进行观察并拍照记录相关情况。
2.6. 蛋白质的提取
对H9c2心肌细胞进行各种处理后，将其匀浆于预冷的RIPA裂解缓冲液中。收集上清液并加入蛋白缓冲液。将等量的总蛋白(每孔10 μg)通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上。膜用5%脱脂奶粉封闭1小时，然后在4℃下与一抗(PINK1, 1:1000; β-actin, 1:1000)孵育过夜。接着在室温下与辣根过氧化物酶标记的二抗(1:10000, Proteintech)孵育1小时，最后使用生物图像分析系统(Bio-Rad，美国)分析膜。以β-actin水平作为加载对照，确定目标蛋白的相对表达水平。
2.7. 统计分析
数据以均值 ± 标准误(SEM)表示。样本数量(生物学重复)在图例中单独说明。所有数据分析均在盲法条件下进行。使用GraphPad Prism软件(版本7.01)进行统计分析。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素或双因素方差分析(ANOVA)，正态分布数据采用Bonferroni或Dunnett多重比较检验，非正态分布数据采用Mann-Whitney检验。p值 < 0.05被认为具有统计学意义。
3. 结果
3.1. 白脂素对H/R诱导的H9c2细胞损伤的保护作用
Figure 1. Protective effects of ASP on H/R-injured H9c2 cells
图1. 白脂素对H/R损伤的H9c2细胞的保护作用
在H/R后，用白脂素(50、100和150 nM)对H9c2细胞进行预处理，白脂素以剂量依赖的方式部分抑制了H/R诱导的H9c2细胞中ROS的升高(图1A、图1B)。此外，我们采用LDH和CCK-8实验来确定细胞活性。我们观察到白脂素以剂量依赖的方式对H/R诱导的H9c2细胞活性下降发挥了保护作用(图1C、图1D)。
(A, B)用白脂素(50, 100, 150 nM)浓度梯度预处理H/R损伤的H9c2细胞后，用相应的定量检测试剂盒测定细胞内ROS浓度(放大200倍，比例尺250 μm)。(C) 用白脂素(50, 100, 150 nM)浓度梯度预处理损伤的H9c2细胞后，用CCK-8试剂盒评估细胞活性。细胞活性通过将实验组的OD值除以对照组的OD值来计算。(D) 用白脂素(50, 100, 150 nM)浓度梯度预处理损伤的H9c2细胞后，测定LDH介导的细胞死亡。数据(n = 3)以均值 ± 标准差表示，显著性用P < 0.05表示；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
3.2. 白脂素促进H/R损伤后H9c2细胞的线粒体自噬
既往研究表明白脂素可以促进细胞的线粒体自噬，但其在心肌细胞中的作用研究尚不充分。我们观察到白脂素(50、100和150 nM)以剂量依赖的方式增强了H/R损伤后H9c2细胞中PINK1蛋白的表达(图2A、图2B)。随后，我们通过JC-1染色确定了线粒体膜电位的变化。结果表明，随着白脂素预处理浓度的增加，H/R损伤后H9c2细胞中增加的绿色荧光随着白脂素浓度的增加而减少(图2B、图2C)。
Figure 2. ASP is involved in H/R-induced mitophagy in H9c2 cells
图2. 白脂素参与H/R诱导的H9c2细胞线粒体自噬。
(A, B) 通过Western blotting测定PINK1的表达水平；(C) H9c2细胞线粒体JC-1染色的荧光(放大200倍，比例尺250 μm)；(D) JC-1染色绿色/红色荧光比值。数据(n = 3)以均值 ± 标准差表示，显著性用P < 0.05表示；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
3.3. 抑制线粒体自噬会抵消白脂素对H/R诱导的H9c2细胞活性下降的保护作用
Figure 3. Asprosin participates in the alteration of cell viability induced by H/R in H9c2 cells by affecting mitophagy
图3. 白脂素通过影响线粒体自噬参与H/R诱导的H9c2细胞活性的改变
我们用100 nM的白脂素预处理H9c2细胞，并同时用线粒体自噬抑制剂氯喹(10 μM)处理以抑制线粒体自噬。为了确认线粒体自噬的抑制，我们重新评估了PINK1蛋白水平和线粒体膜电位。我们观察到氯喹抑制了白脂素先前促进的PINK1蛋白水平的增加(图3A、图3B)，并增强了绿色荧光(图3C、图3D)，这表明线粒体膜电位下降。此外，氯喹抵消了白脂素对细胞活性的保护作用(图3E、图3H)，并增加了白脂素在H/R损伤后抑制的ROS的产生(图3F、图3G)。这些发现表明，白脂素通过促进线粒体自噬来保护H9c2细胞免受H/R损伤引起的细胞活性下降。
(A, B) 通过Western blotting测定PINK1的表达水平；(C) H9c2细胞线粒体JC-1染色的荧光(放大200倍，比例尺250 μm)；(D) JC-1染色绿色/红色荧光比值；(E) LDH介导的细胞死亡实验；(F, G) 细胞内ROS浓度(放大200倍，比例尺250 μm)；(H) CCK-8细胞活性实验；数据(n = 3)以均值 ± 标准差表示，显著性用P < 0.05表示；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
4. 讨论
在本研究中，我们将白脂素和线粒体自噬抑制剂氯喹应用于H9c2细胞的H/R模型，并观察了线粒体自噬和细胞活性指标的变化。我们提供了多条证据，证明白脂素在H/R诱导的心肌细胞损伤中发挥了保护作用。此外，我们发现将氯喹添加到白脂素中可以减弱这种抑制效果。从机制上讲，白脂素影响PINK1蛋白，并在H/R后促进H9c2细胞中线粒体自噬的激活，最终通过保护细胞线粒体功能，缓解细胞氧化应激保护心肌细胞。总之，我们认为白脂素可以保护H/R诱导的心肌细胞损伤，在严重心血管疾病(如心肌缺血再灌注损伤)中具有实际应用的潜力。
白脂素是一种新近发现的激素，有许多与心脏相关的机制值得进一步探索。近年来，越来越多的证据表明白脂素在心脏中具有保护作用。临床研究表明，白脂素改善了扩张型心肌病患者的长期预后，并降低了心力衰竭事件的风险，这些效果归因于心肌细胞中线粒体功能的增强[9]。肌肉组织的研究也表明，白脂素可以增加PGC-1α水平[13]，PGC-1α是线粒体生物发生和线粒体质量控制机制(包括分裂、融合和线粒体自噬)的调节因子[14]。白脂素还可以通过激活细胞外信号调节激酶1/2通路和上调抗氧化蛋白超氧化物歧化酶2，保护间充质干细胞免受过氧化氢诱导的凋亡和ROS损伤[6]。在本研究中，我们观察到用不同浓度的白脂素预处理H9c2细胞后，H/R损伤后的细胞活性显著提高，这进一步证明了白脂素对H/R诱导的心肌细胞损伤具有保护作用。
线粒体自噬是选择性自噬的关键途径[15]，在细胞清除受损线粒体中发挥着重要作用。PINK1蛋白在调节线粒体自噬中起着关键作用。在正常条件下，PINK1被PARL切割并降解。在应激条件下，PINK1转移到线粒体外膜，招募Parkin，并将受损线粒体靶向溶酶体降解[16]。其他研究也表明，白脂素可以诱导脂肪细胞中的线粒体自噬[17]。缺氧损伤会导致细胞线粒体呼吸功能受损；然而，白脂素治疗可使线粒体功能显著恢复[9]。细胞内ROS的主要来源之一是线粒体。线粒体自噬通过在溶酶体中特异性隔离和吞噬线粒体，清除老化和受损的线粒体，从而限制线粒体ROS的产生[18]。本研究表明，白脂素通过PINK1抑制线粒体膜电位的下降，并促进细胞中线粒体自噬，从而逆转I/R损伤引起的损伤。白脂素对线粒体的保护作用还逆转了再灌注过程中ROS爆发引起的氧化应激损伤，中断了死亡信号的传递，从而维持了心肌细胞的能量供应。
在正常条件下，线粒体自噬通过清除受损线粒体来维持线粒体稳态，从而减少ROS的产生并防止脂质过氧化。然而，当线粒体功能受损时，如在H/R损伤期间，ROS的产生增加，导致脂质过氧化和铁死亡。例如，Lin等人发现，通过BNIP3介导和PINK1-PARK2介导的线粒体自噬，可以通过ROS/HO-1/GPx4轴保护肾小管上皮细胞[19]。同样，Chen等人表明，在糖尿病心肌病条件下，促进Parkin依赖的线粒体自噬可以保护心肌细胞[20]。Wang等人证明了线粒体自噬可以促进谷胱甘肽的产生，谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂，可以中和ROS并防止脂质过氧化[21]。在我们的研究中，我们使用氯喹抑制细胞中的线粒体自噬，发现白脂素的保护作用被抑制。这些发现表明，白脂素通过促进PINK1相关的线粒体自噬，恢复了细胞内正常的线粒体功能，降低了H/R损伤引起的细胞内ROS水平，最终恢复了细胞活性。
5. 结论
我们已经验证了白脂素对H/R损伤后心肌细胞的保护作用。这一效应的潜在机制可能涉及白脂素促进H/R损伤后心肌细胞中PINK1相关的线粒体自噬，进而抑制细胞氧化应激，保护细胞线粒体，并最终保护心肌细胞。需要进一步的证据来阐明白脂素与铁死亡之间关系的具体机制。
致 谢
本研究获得山东省自然科学基金(ZR2023MH268)资助。
伦理审查
本研究获得青岛市市立医院伦理委员会批准(审批号：2025-KTLL-050)。
NOTES
*通讯作者。