摘要: 目的：观察松郁安神方对失眠大鼠下丘脑生物钟基因表达及学习记忆能力的影响。方法：将40只雄性SD大鼠，采用腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)建立失眠大鼠模型，造模成功后随机分为模型组、松郁安神方(SYF)组、Luzindole (Luz)组、SYF + Luz组以及阿戈美拉汀组，另设不造模的对照组，每组8只。灌胃1次/d，连续7d。大鼠空间学习记忆能力采用Morris水迷宫实验测试。下丘脑组织CLOCK和Per1蛋白表达水平采用Western Blotting实验检测。结果：同模型组比较，SYF组和SYF + Luz组大鼠的体质量显著增加(
P < 0.01)，SYF组大鼠的逃避潜伏期时间显著缩短(
P < 0.01)，跨越平台次数显著增加(
P < 0.01)，SYF能够显著上调失眠大鼠下丘脑CLOCK蛋白表达(
P < 0.01)，下调Per1蛋白的表达(
P < 0.01)。同SYF组相比较，Luz组和SYF + Luz组大鼠的逃避潜伏期时间均显著延长(
P < 0.01)，跨越平台次数显著减少(
P < 0.01)，Luz组和SYF + Luz组大鼠下丘脑CLOCK蛋白均被显著下调(
P < 0.01)，Per1蛋白均被显著上调(
P < 0.01)。结论：松郁安神方能够改善失眠大鼠的学习和记忆能力，调节失眠大鼠下丘脑CLOCK和Per1蛋白表达变化，恢复失眠大鼠的正常睡眠节律，该作用可以被褪黑素受体拮抗剂阻断，说明其机制可能与调控下丘脑褪黑素受体通路相关。
Abstract: Objective: To observe the effects of Songyu Anshen Prescription on the expression of biological clock genes and learning and memory abilities in the hypothalamus of rats with insomnia. Method: Forty male SD rats were used to establish the insomnia rat model by intraperitoneal injection of p-chlorophenylalanine (PCPA). After successful modeling, they were randomly divided into the model group, the Songyu Anshen Prescription (SYF) group, the Luzindole (Luz) group, the SYF + Luz group and the agomelatine group. Another control group without modeling was set up, with 8 rats in each group. They were gavaged once a day for 7 consecutive days. The spatial learning and memory ability of rats was tested by the Morris water maze experiment. The expression levels of CLOCK and Per1 proteins in hypothalamic tissues were detected by Western Blotting experiments. Result: Compared with the model group, the body weight of rats in the SYF group and the SYF + Luz group increased significantly (P < 0.01), the escape latency time of rats in the SYF group was significantly shortened (P < 0.01), and the number of platform crossings increased significantly (P < 0.01). SYF could significantly up-regulate the expression of CLOCK protein in the hypothalamus of insomniac rats (P < 0.01) and down-regulate the expression of Per1 protein (P < 0.01). Compared with the SYF group, the escape latency time of rats in both the Luz group and the SYF + Luz group was significantly prolonged (P < 0.01), the number of platform crossings was significantly reduced (P < 0.01), and the hypothalamic CLOCK protein of rats in both the Luz group and the SYF + Luz group was significantly down-regulated (P < 0.01). All Per1 proteins were significantly up-regulated (P < 0.01). Conclusion: Songyu Anshen Formula can improve the learning and memory abilities of insomniated rats, regulate the expression changes of CLOCK and Per1 proteins in the hypothalamus of insomniated rats, and restore the normal sleep rhythm of insomniated rats. This effect can be blocked by melatonin receptor antagonists, indicating that its mechanism may be related to the regulation of the hypothalamic melatonin receptor pathway.
1. 引言
失眠作为睡眠障碍最主要的表现形式之一，影响患者的正常工作和生活，会给社会发展带来负面影响。近几年，我国失眠患者人数呈逐年增长趋势，其发病年龄亦趋于年轻化，失眠发生率高于国外发达国家[1] [2]。中医药在失眠的临床治疗中具有一定优势。我们前期研究证实松郁安神方治疗失眠确有疗效，发现其机制与调节褪黑素水平相关[3]。本研究在课题组前期研究的基础上选取松郁安神方治疗失眠大鼠，探讨松郁安神方通过影响褪黑素受体途径调节失眠大鼠下丘脑生物钟基因表达及学习记忆能力的分子机制，为临床中医药诊治失眠症提供科学依据。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 实验动物
SPF级SD大鼠，雄性，体质量(250 ± 10) g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(许可证号：SCXK (沪) 20017-0005)。饲养于恒温、恒湿和12 h:12 h固定明暗节律的安静环境下，自由摄取食物和水[4]。本研究所涉及动物实验，经福建省中医药科学院实验动物福利伦理委员会批准(批准文号：FJATCM-IAEC2022031)。
2.1.2. 主要试剂
对氯苯丙氨酸(4-Chloro-DL-phenylalanine, PCPA) (C6506-25G)购于Sigma公司。阿戈美拉汀片(批号：131211003)购于江苏豪森药业集团有限公司。Luzindole (货号：B6483)购于美国APExBIO生物科技有限公司。Per1(E-8) Mouse mAb (货号：sc-398890)购于SANTA CRUZ公司。CLOCK (D45B10) Rabbit mAb (货号：#5157)；GAPDH (14C10) Rabbit mAb (货号：#2118S)；Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody (货号：#7074S)；Anti-mouseIgG，HRP-linked Antibody (货号：#7076S)购于CST公司。
2.1.3. 实验药物
松郁安神方药物组成：甘松10 g、郁金15 g、玫瑰花10 g、生龙骨30 g、珍珠母30 g、首乌藤30 g、丹参15 g、酸枣仁15 g。购于鹭燕(福建)药业股份有限公司[4]。药物一次性煎煮，分装后−20℃保存备用。大鼠用量为成人6倍(按体质量计算)剂量，按15 mL/kg灌胃给药，1次/d，给药时间1周[4]。
2.2. 治疗方法
2.2.1. 失眠大鼠模型的建立及分组
参考前期文献方法造模[4] [5]：给予实验大鼠连续腹腔注射PCPA (300 mg/kg, 15 mL/kg) 2 d。造模成功后随机分为模型组、松郁安神方(SYF)组、Luzindole (Luz)组、SYF + Luz组和阿戈美拉汀组，每组8只。另设不参与造模的对照组实验大鼠8只。
2.2.2. 给药方法
SYF组按17 g/kg灌胃给药，1次/d，1周[4]。阿戈美拉汀用量为2.25 mg/kg，灌胃给药，1次/天，给药1周。Luz组1 mg/kg，腹腔注射，1次/天，给药1周。SYF + Luz组用松郁安神方和Luz联合用药。对照组和模型组灌胃等容积生理盐水，1次/d，1周。
2.3. 检测指标与方法
2.3.1. 大鼠学习记忆能力测定
采用Morris水迷宫对大鼠进行定位航行和空间探索实验，参照文献方法进行[6]。
2.3.2. 取材
大鼠称重后，腹腔注射1%戊巴比妥钠(45 mg/kg)进行麻醉。腹主动脉取血后，迅速分离下丘脑组织，置于液氮中保存[6]。
2.3.3. 大鼠下丘脑组织CLOCK和Per1蛋白表达检测
运用WesternBlotting检测蛋白表达量。下丘脑组织经裂解、变性后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭后分别上一抗4℃过夜，二抗室温孵育2 h，ECL显色，应用Image J进行分析[6]。
2.4. 统计学方法
采用SPSS20.0进行统计分析，多组间比较使用单因素方差分析。P < 0.05具有统计学意义，P < 0.01为差异显著，P > 0.05无统计学意义。
3. 结果
3.1. 实验药物对大鼠体质量的影响
对实验结束时各组大鼠的体质量进行统计分析，结果如图1所示：与对照组相比较，模型组、Luz组、SYF + Luz组和阿戈美拉汀组大鼠的体质量均显著低于对照组(P < 0.01)。与模型组比较，SYF组和SYF + Luz组大鼠的体质量显著增加(P < 0.01)。与SYF组相比较，Luz组、SYF + Luz组和阿戈美拉汀组大鼠的体质量均显著低于SYF组(P < 0.01)。与SYF + Luz组相比较，Luz组和阿戈美拉汀组大鼠的体质量均显著低于SYF + Luz组(P < 0.01)。以上的实验结果表明，失眠会引起大鼠体质量显著下降。而给予褪黑素受体抑制剂和阿戈美拉汀治疗的大鼠体质量也表现为显著下降。但是给予中药复方松郁安神方治疗失眠大鼠的体质量显著上升。表明松郁安神方在改善失眠引起的不良体征表现上具有一定优势。
注：与对照组比较：*P < 0.01；与模型组比较：#P < 0.01；与SYF组比较：◆P < 0.01；与SYF + Luz组比较：★P < 0.01
Figure 1. The effect of experimental drugs on the body weight of rats
图1. 实验药物对大鼠体质量的影响
3.2. 实验药物对失眠大鼠学习记忆能力的影响
Morris水迷宫实验检测结果如表1所示：同对照组相比较，模型组、Luz组和SYF + Luz组大鼠的逃避潜伏期时间均显著延长(P < 0.01)，跨越平台次数显著减少(P < 0.01)。同模型组比较，SYF组和阿戈美拉汀组大鼠的逃避潜伏期时间显著缩短(P < 0.01)，跨越平台次数显著增加(P < 0.01)。同SYF组相比较，Luz组和SYF + Luz组大鼠的逃避潜伏期时间均显著延长(P < 0.01)。Luz组和SYF + Luz组大鼠跨越平台次数显著减少(P < 0.01)。本实验结果表明，失眠可以显著降低实验大鼠空间学习记忆能力。松郁安神方和阿戈美拉汀可以改善失眠引起的大鼠学习记忆能力下降，该作用可以被褪黑素受体抑制剂阻断。
3.3. 实验药物对失眠大鼠下丘脑CLOCK和Per1蛋白表达的影响
失眠会引起昼夜节律紊乱，为了探索药物对失眠大鼠下丘脑时钟基因的影响，我们运用Western Blotting实验检测各组大鼠的下丘脑组织中时钟基因CLOCK和Per1的蛋白表达变化，检测结果如图2所示：同对照组相比较，模型组、Luz组、SYF + Luz组大鼠下丘脑CLOCK蛋白均被显著下调(P < 0.01)，Per1蛋白均被显著上调(P < 0.01)。同模型组比较，SYF和阿戈美拉汀均能够显著上调失眠大鼠下丘脑CLOCK蛋白表达(P < 0.01)，下调Per1蛋白的表达(P < 0.01)。同SYF组相比较，Luz组和SYF + Luz组大鼠下丘脑CLOCK蛋白均被显著下调(P < 0.01)，Per1蛋白均被显著上调(P < 0.01)。结果表明松郁安神方能够调节失眠大鼠下丘脑CLOCK和Per1蛋白表达变化，其作用可以被褪黑素受体抑制剂阻断或降低。
Table 1. The influence of each medication group on the learning and memory ability of insomnia model rats
表1. 各用药组对失眠模型大鼠学习记忆能力的影响
组别 |
例数 |
逃避潜伏(s) |
跨越平台次数 |
对照组 |
8 |
10.92 ± 4.85 |
3.50 ± 1.31 |
模型组 |
8 |
45.42 ± 2.89★ |
0.25 ± 0.46★ |
SYF组 |
8 |
18.03 ± 2.33▲◆ |
3.38 ± 1.69★▲ |
Luz组 |
8 |
47.10 ± 5.49★△ |
0.63 ± 0.74★△ |
SYF + Luz组 |
8 |
40.18 ± 6.52★△ |
0.50 ± 0.76★☆△◆ |
阿戈美拉汀组 |
8 |
11.86 ± 3.34▲◆ |
2.75 ± 0.71▲△◆ |
注：与对照组比较：★P < 0.01；与模型组比较：▲P < 0.01，☆P < 0.05；与SYF组比较：△P < 0.01；与Luz组比较：◆P < 0.01。
注：与对照组比较：*P < 0.01；与模型组比较：#P < 0.01，△P < 0.05；与SYF组比较：★P <0.01；与Luz组比较：☆P < 0.05。
Figure 2. The expression changes of CLOCK and Per1 proteins in the hypothalamus of rats in each experimental group
图2. 各实验组大鼠下丘脑CLOCK和Per1蛋白表达变化
4. 讨论
失眠是一个全球性的公共问题，长期失眠与多种疾病相关，同时增加了患者和社会的经济负担。如果能够解决或缓解失眠引起的症状，保证人们日常的生产和生活，具有重要意义。
睡眠和觉醒是由生物钟基因调控的。褪黑素是一种具有明显昼夜节律的神经内分泌激素，在调控昼夜节律中起到重要作用[7]。在失眠的临床治疗中，褪黑素被广泛应用，有助于患者恢复正常昼夜节律[8]。褪黑素通过与其受体结合发挥生理功能，褪黑素受体可广泛地存在于人体的下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)、下丘脑前体以及垂体中。其中SCN是褪黑素受体最为集中的区域之一[9]。课题组前期研究及本研究也发现松郁安神方能够调节褪黑素的合成释放恢复失眠大鼠正常睡眠节律状态。
昼夜节律是最普遍的一种节律变化，哺乳动物的昼夜节律主要的控制中枢在SCN，SCN主导昼夜节律的产生、维持和调控[10]。昼夜节律系统参与睡眠觉醒周期，代谢，炎性反应等生理过程，周期大约24 h [11]。昼夜节律的发生和变化受到核心生物钟基因调控，包括CLOCK、BMAL1、PER以及CRY基因[12]。其中，CLOCK和PER基因是最核心的两个生物钟基因。另外，钟控基因还包括Rev-Erbα、RORα、dbp等[13]，协同核心生物钟基因一起参与了昼夜节律的调控。昼夜节律维持在24 h主要是靠生物钟的转录翻译负反馈环路(Transcription-Translation Feedback Loop, TTFL)机制调控[14]。本研究结果显示松郁安神方能够显著调节失眠大鼠下丘脑CLOCK和Per1蛋白表达变化(P < 0.01)，其作用可以被褪黑素受体抑制剂阻断或降低。
睡眠与学习记忆能力密切相关，足够的睡眠时间可以巩固和增强学习和记忆能力[15]。有文献报道，人体睡眠时间不足会损伤学习和记忆能力，睡眠障碍的人群，其反应速度、学习能力和准确记忆均显著性下降[16] [17]。还有研究发现，每天晚上睡眠时间不足或超过7~8 h的人群中，大约有一半人数会表现出认知能力下降[18]。本研究发现，失眠显著影响实验大鼠空间学习和记忆能力，使得大鼠的该能力减弱(P < 0.01)。松郁安神方和阿戈美拉汀可以显著改善失眠引起的大鼠空间学习和记忆能力下降(P < 0.01)，该作用可以被褪黑素受体抑制剂阻断。
5. 结论
综上所述，松郁安神方能够改善失眠大鼠的学习和记忆能力，调节失眠大鼠下丘脑CLOCK和Per1蛋白表达变化，恢复失眠大鼠的正常睡眠节律，其机制可能与调控下丘脑褪黑素受体通路相关。关于松郁安神方如何调控褪黑素受体发挥作用，还有待进一步深入研究。
基金项目
国家自然科学基金项目(81774285)；福建省科技厅省属公益类科研院所基本科研专项(2022R1003001)。
NOTES
*通讯作者。