摘要: 目的：基于网络药理学探究赤芍治疗先天性心脏病的活性成分及其作用机制。方法：通过整合TCMSP数据库及文献挖掘筛选赤芍活性成分与靶点，结合GeneCards、OMIM和DisGeNET数据库获取CHD相关靶标。利用Venny 2.1和Cytoscape 3.7.2软件构建“药物–成分–疾病靶点”网络，基于STRING数据库建立蛋白互作网络，并通过DAVID数据库进行GO功能注释与KEGG通路富集分析。结果：共筛选出赤芍14个活性成分，作用于87个CHD相关靶点，其中
β-谷甾醇、鞣花酸等核心成分与AKT1、TNF等关键靶点具有显著结合活性。通路富集分析表明，赤芍主要通过调控PI3K-Akt、TNF及MAPK信号通路，介导炎症反应抑制、细胞凋亡调控及血管内皮功能改善。结论：本研究首次系统揭示赤芍通过多成分、多靶点及多通路协同网络治疗CHD的分子机制，为核心成分的临床应用及创新药物研发提供理论依据。
Abstract: Objective: To investigate the active components of Paeoniae Radix Rubra (Paeonia) and their mechanisms of action in treating congenital heart disease (CHD) based on network pharmacology. Methods: Active components of Paeonia and their targets were screened by integrating the TCMSP database and literature mining. CHD-related targets were retrieved from GeneCards, OMIM, and DisGeNET databases. A “drug-component-disease target” network was constructed using Venny 2.1 and Cytoscape 3.7.2. Protein-protein interaction (PPI) networks were established via the STRING database. Gene Ontology (GO) functional annotation and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analyses were performed using the DAVID database. Results: Fourteen active components of Paeonia targeting 87 CHD-related genes were identified. Core components, including β-sitosterol and ellagic acid, exhibited significant binding activity with key targets such as AKT1 and TNF. Pathway enrichment analysis revealed that Paeonia primarily modulates the PI3K-Akt, TNF, and MAPK signaling pathways to mediate inhibition of inflammatory responses, regulation of apoptosis, and improvement of vascular endothelial function. Conclusion: This study systematically elucidates, for the first time, the molecular mechanism by which Paeonia treats CHD through a multi-component, multi-target, and multi-pathway synergistic network, providing a theoretical foundation for the clinical application of core components and the development of innovative therapeutics.
1. 引言
先天性心脏病(congenital heart disease, CHD)是胚胎期心脏大血管发育异常所致的先天性畸形，全球发病率约为9.4% [1]。临床表现为胸痛、呼吸困难、心悸和心律失常、头晕昏厥等症状，其病理机制涉及心肌供氧与需氧失衡、炎症反应、氧化应激及细胞凋亡等多因素交互作用。目前，尽管现代医学已探索出血运重建、抗血小板药物及β受体阻滞剂等治疗方法[2]，可在一定程度上缓解CHD的临床症状，但部分患者疗效欠佳且副作用多，停药后易复发仍是未能解决的难题。
赤芍(Paeoniae Radix Rubra)作为中医经典活血化瘀药，已被证实具有抗炎、抗肿瘤、调节免疫活性等药理作用[3]，但现有研究多聚焦于单一成分或靶点的效应，其在CHD治疗中的具体作用机制仍缺乏系统性阐释。因此，本研究基于网络药理学分析方法，通过筛选赤芍关键活性成分，构建“药物–成分–靶点”相关作用网络，并深入分析核心靶点与信号通路，揭示赤芍通过多靶点协同调控CHD的作用机制。研究结果不仅为赤芍的临床应用提供科学依据，也为基于中药多组分协同作用的新药研发奠定了理论基础。
2. 方法
2.1. 网络药理学研究
2.1.1 赤芍活性成分筛选及靶点挖掘
使用中药系统药理学数据库分析平台(https://tcmsp-e.com/)以“赤芍”为关键词进行检索，以口服生物利用度(OB) ≥ 30%、类药性(DL) ≥ 0.18为条件进行筛选靶点，结合文献补充获得赤芍的有效成分，将整理得到的靶点经Uniprot (https://www.uniprot.org/)数据校准后，剔除非人源基因和无效重复靶点，得到标准化的成分靶点[4]。
2.1.2. 先天性心脏病靶点收集
通过GeneCards (https://www.genecards.org/)、OMIM (https://omim.org/)数据库，输入关键词“congenital heart disease”进行检索，将检索得到的所有靶点整合在Excle中，剔除重复基因，并经Uniprot数据库进行校正[5]，得到与CHD相关的疾病靶点信息。
2.1.3. 赤芍活性成分抗先天性心脏病靶点预测
将获得的药物成分靶点与疾病靶点相互映射，然后使用Venny2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)软件作Venn图，从而获得交集基因。使用Cytoscape3.7.2软件，对药物、活性成分及药物–疾病交集基因进行关联性分析，构建构建“药物–成分–作用靶点”网络图[6]。
2.1.4. 靶点蛋白互作网络(PPI)构建及核心靶点筛选
将交集基因导入String (https://string-db.org/)数据库，设置以下参数：物种为“Homosapiens (人类)”，最低相互作用阀值大于0.4，其余参数保持默认设置，构建靶点蛋白相互作用网络[7]，导入Cytoscape3.7.2软件中，利用Networkanalyzer进行拓扑学分析，筛选出PPI网络核心靶点。
2.1.5. GO功能与KEGG通路富集分析
把筛选得到的交集靶点上传至DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)，基因标识符选择“OFFICIAL GENE SYMBOL”，物种设置为：HomoSapiens (人类)，进行功能富集分析(GO)和信号通路富集分析(KEGG)，固定分析结果筛选条件为P < 0.01，得到GO功能中生物过程(BP)、细胞成分(CC)、分子功能(MF)三种功能模块数据和KEGG通路富集分析的结果。筛选P-value值 < 0.01的分析结果，选取富集度较高的GO各项前10位条目和前20条KEGG通路，作为赤芍治疗先天性心脏病的主要基因功能富集过程和信号通路，将其通路名称、富集指数、P值以及基因数等相关数据上传至微生信平台绘图网站绘制条形图和气泡图，预测赤芍治疗先天性心脏病的作用机制[8]。
3. 结果
3.1. 赤芍网络药理学活性成分预测及先天性心脏病的潜在机制
3.1.1 赤芍活性成分及靶点预测
通过TCMSP平台检索，共收集到赤芍14个成分，列表如下表1。
3.1.2. 先天性心脏病相关靶点
通过GeneCards、OMIM数据库检索，分别获得7557、559个疾病靶点，去重后共获得8001个与先天性心脏病相关的靶点，将得到的基因经Uniprot数据库校正。将药物的作用靶点与先天性心脏病的靶点基因取交集后，于微生信平台绘制韦恩图，获得87个交集靶点，见图1。
Table 1. Active ingredients of Radix paeoniae rubra
表1. 赤芍有效成分信息表
MOL ID |
名称 |
OB (%) |
DL |
MOL000358 |
beta-sitosterol |
36.91 |
0.75 |
MOL000359 |
sitosterol |
36.91 |
0.75 |
MOL000449 |
Stigmasterol |
43.83 |
0.76 |
MOL000492 |
(+)-catechin |
54.83 |
0.24 |
MOL001002 |
ellagic acid |
43.06 |
0.43 |
MOL001918 |
paeoniflorgenone |
87.59 |
0.37 |
MOL001924 |
paeoniflorin |
53.87 |
0.79 |
MOL002714 |
baicalein |
33.52 |
0.21 |
MOL002776 |
Baicalin |
40.12 |
0.75 |
MOL002883 |
Ethyl oleate (NF) |
32.4 |
0.19 |
MOL004355 |
Spinasterol |
42.98 |
0.76 |
MOL005043 |
campest-5-en-3beta-ol |
37.58 |
0.71 |
MOL006992 |
(2R,3R)-4-methoxyl-distylin |
59.98 |
0.3 |
MOL006999 |
stigmast-7-en-3-ol |
37.42 |
0.73 |
Figure 1. VENN map of drug-disease common targets
图1. 疾病–药物交集靶点韦恩图
3.1.3. 核心靶点及网络相互作用
运用Cytoscape3.7.2软件构建“药物–成分–交集靶点”网络图，见图2，图中包括102个节点和143条边。对该网络中的各个节点进行拓朴学分析，degree值排名前五的化合物分别是beta-sitosterol (β-谷甾醇)、Stigmasterol (豆甾醇)、catechin (儿茶素)、ellagic acid (鞣花酸)、baicalein (黄芩苷)，这五个化合物能够作用于CHD中的大部分靶点，可能是赤芍治疗CHD的重要起效物质，将其作为潜在生物活性核心成分。
3.1.4. PPI网络图的构建与分析
将得到的87个交集靶点基因导入String数据库分析，构建蛋白相互作用网络，预测靶蛋白之间的相互作用关系，其中包括87个节点和1504条边，见图3。选取度值排名前十的关键靶点进行重点分析，分别是：AKT1、TNF、IL6、ESR1、PTGS2、FOS、TP53、BCL2、MMP9、TGFB1，这10个靶点可能是赤芍调控CHD的重要位点，将其作为潜在核心靶点。
Figure 2. Network diagram of “drug-constituent-common target” interactions
图2. “药物–成分–交集靶点”网络图
Figure 3. Protein-protein interaction network
图3. 蛋白相互作用网络
3.1.5. 生物功能富集分析
1) GO富集分析
利用DAVID数据库对交际靶点进行分析，以P < 0.05为标准共筛选出GO功能富集条目439条，包含317个生物过程(BP)、44个细胞组成(CC)、78个分子功能(MF)，其中主要的生物过程(BP)为对外来刺激的反应、信号转导、对缺氧的反应、凋亡过程、凋亡过程的负调控、MAPK级联的正调控、细胞凋亡过程的积极调控、基因表达的正调控、细胞迁移的正向调节、炎症反应；细胞成分(CC)涉及质膜、细胞质、核、胞质、核原形质核浆、膜、细胞外区域、细胞外空间、细胞外外泌体、染色质；分子功能(MF)涉及蛋白质结合、相同蛋白结合、酶结合、蛋白质同分异构化活性、DNA结合转录因子活性、锌离子结合、泛素蛋白连接酶结合、转录顺式调控区结合、蛋白质异二聚化活性、蛋白激酶结合。分别取三者中P值前10的过程进行可视化，见图4。
Figure 4. Visualization of GO enrichment analysis
图4. GO富集分析可视化图
2) KEGG通路富集分析
利用DAVID数据库进行通路富集分析，根据P < 0.05筛选出赤芍与治疗先天性心脏病相关的KEGG通路131条，主要涉及脂质与动脉粥样硬化、IL-17信号通路、细胞凋亡、流体剪应力与动脉粥样硬化、Toll样受体信号通路等。按照p值大小，取前20条通路进行富集分析，绘制富集桑基气泡图，见图5。横轴以富集到通路上的基因数目表示，气泡的大小代表富集在相应通路上的基因数目的多少，颜色的深浅代表显著性，P值越小颜色越红，富集结果可信度越高。
Figure 5. Visualization of KEGG pathway enrichment analysis
图5. KEGG通路富集分析结果图
4. 讨论
中医认为“气为血帅”，心气不足则推动血液无力，导致血行迟滞，形成血瘀。古籍《金匮要略》提出“阳微阴弦”是胸痹心痛的主要病机，即胸中阳气不足，阴寒、痰浊等邪气壅盛，两者相互作用导致心脉痹阻[9]。赤芍作为经典活血化瘀药，具有“通血脉、散恶血”之功，临床治疗上赤芍主治瘀滞经闭，疝瘕积聚，具有行淤、止痛、清热凉血等功效[10]。现代研究多聚焦于赤芍单一成分的抗血小板或抗氧化作用[11]，其在CHD中的治疗作用和机制尚不清楚。
本研究通过“药物–成分–靶点”网络模型的预测分析，得到β-谷甾醇、鞣花酸、儿茶素等14个核心活性成分，筛选出AKT1、IL6、TNF等87个枢纽靶点，系统揭示了赤芍抗CHD的“多成分–多靶点–多通路”协同作用机制。KEGG富集分析表明，赤芍可通过调控PI3K-Akt、TNF及MAPK等信号通路，从而抑制炎症因子释放、改善细胞凋亡并促进血管内皮功能恢复，发挥“多成分–多靶点–多通路”的综合调控作用。这一发现与中医“配伍增效”理论相吻合，提示赤芍治疗CHD的优势可能源于多种成分对凋亡、炎症及氧化应激通路的协同调控，而非单一成分的线性作用。近期研究表明，激活PI3K-Akt信号通路可以抑制NF-kB的表达，从而减轻心肌细胞炎症反应[12]，而赤芍核心成分可能通过同时靶向PI3K-Akt和MAPK节点，形成双通路抑制效应，这一假说需通过体内外实验进一步验证。
综上所述，本研究基于网络药理学方法，系统解析了赤芍治疗CHD的潜在药效物质基础与作用机制，研究结果与中医药辩证论治整体观念相契合，为进一步阐明赤芍抗CHD的生物学机制提供了理论依据。后续研究可通过临床动态监测血清生物标志物与转录组特征谱，并结合基因编辑技术验证关键靶点的功能特异性，系统评估赤芍干预CHD的长期疗效及安全性。
基金项目
广东省大学生创新创业训练计划项目(S202413684031)；广东省大学生创新创业训练计划项目(S202413684028)。
NOTES
*共同第一作者。
#共同通讯作者。