枸杞多糖基于IRE1-α/JNK/AP-1信号通路对肥胖小鼠慢性炎症的影响

Effect of Lycium barbarum Polysaccharide on Chronic Inflammation in Obese Mice via the IRE1-α/JNK/AP-1 Signaling Pathway

摘要: 目的：肥胖作为能量代谢失衡引发的慢性低度炎症，其发生与内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress, ERS)之间存在密切关联。本研究旨在探讨枸杞多糖(Lycium barbarum Polysaccharide, LBP)通过调控IRE1α/JNK/AP-1信号通路改善高脂饮食诱导肥胖小鼠炎症反应的分子机制。方法：实验采用C57BL/6J雄性小鼠建立12周高脂饮食肥胖模型，随机分为普通饮食组(N)、假手术组(J)、模型对照组(G)及LBP高(GH)、中(GM)、低(GL)剂量干预组。经4周灌胃干预后，检测脂肪组织形态变化，结合Western blot、ELISA和免疫组化技术分析内质网应激关键蛋白(IRE1α, JNK, AP-1)及炎症因子(TNF-α, CRP, IL-6)的表达水平。结果：LBP可以有效抑制IRE1α/JNK/AP-1信号通路的异常激活，以及下调脂肪组织炎症因子表达。结论：本研究证实LBP能够通过调控内质网应激IRE1α/JNK/AP-1信号轴缓解肥胖相关炎症反应，且中低剂量干预效果优于高剂量，为开发基于内质网应激调控的肥胖治疗策略提供了实验依据。

Abstract: Objective: Obesity, characterized by chronic low-grade inflammation resulting from energy metabolism dysregulation, is closely associated with endoplasmic reticulum stress (ERS). This study aimed to elucidate the molecular mechanism by which Lycium barbarum polysaccharide (LBP) ameliorates high-fat diet (HFD)-induced inflammatory responses in obese mice through modulation of the IRE1α/JNK/AP-1 signaling pathway. Methods: Male C57BL/6J mice were fed an HFD for 12 weeks to establish an obesity model, followed by randomization into six groups: normal diet (ND), sham-operated (SO), HFD model control (MC), and LBP high- (LBP-H), medium- (LBP-M), and low-dose (LBP-L) intervention groups. After 4 weeks of intragastric administration, adipose tissue morphology was assessed, and key ERS-related proteins (IRE1α, JNK, AP-1) and inflammatory cytokines (TNF-α, CRP, IL-6) were quantified via Western blot, ELISA, and immunohistochemistry. Results: LBP significantly suppressed aberrant activation of the IRE1α/JNK/AP-1 pathway and downregulated pro-inflammatory cytokine expression in adipose tissue. Notably, medium- and low-dose LBP interventions demonstrated superior efficacy compared to the high-dose group. Conclusion: These findings demonstrate that LBP alleviates obesity-associated inflammation by targeting the ERS-mediated IRE1α/JNK/AP-1 signaling axis, with optimal therapeutic effects achieved at moderate doses. This study provides experimental evidence for developing ERS-targeted therapeutic strategies against obesity-related metabolic disorders.

1. 引言

肥胖目前已成为全球性公共卫生危机，其本质已从单纯脂肪蓄积演变为以慢性低度炎症为特征的代谢综合征[1]。在肥胖状态下，内质网功能失衡引发的ERS被证实是慢性低度炎症的关键始动因素[2]。脂肪细胞过度扩张，会导致内质网功能受损，进而引发ERS，并通过转录调控、外泌体介导及免疫细胞极化等途径激活局部炎症[3]-[5]。ERS能够激活未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response, UPR)的三条核心通路：PERK/eIF2α、IRE1/XBP1及ATF6，还可通过多重机制驱动慢性炎症发生[6]。LBP是从枸杞子中提取的一种水溶性多糖，是枸杞品质的重要评价指标之一，能够对脑、心脏、肝脏、肠道、肾脏等不同器官内的炎症产生抗炎作用[7] [8]。目前对LBP的抗炎作用研究仍停留在急性、局部炎症阶段，对于机体所处的慢性炎症状态研究较少，本研究旨在探究LBP对肥胖小鼠的慢性炎症状态以及ERS的影响。

2. 材料与方法

实验所用试剂及器材

1) 材料

枸杞多糖购自上海市源叶生物科技有限公司，批号为B20460。

2) 仪器

SPF级C57BL/6J雄性小鼠(4周龄)均由宁夏医科大学动物中心提供[动物许可证号：SYXK (宁) 2020-0001]。经宁夏医科大学伦理审查委员会批准(伦理编号：IACUC-NYLAC-2022-062)，饲养和干预均于宁夏医科大学实验动物中心SPF环境中进行。实验设备全自动生化分析仪，恒温低速离心机，液体快速混合器，蛋白Western blot检测仪器由宁夏医科大学基础医学院实验平台提供。

3. 实验方法

3.1. 分组及建立小鼠肥胖模型

实验动物为C57BL/6J雄性小鼠44只，按体重随机分为正常组6只，普通饲料喂养；假手术组6只，常规饲料喂养，与干预组同时进行生理盐水灌胃；模型组8只，按照高脂饲料(60%普通饲料、12%猪油、5%花生、10%鸡蛋、5%奶粉、5%蔗糖、2%食盐、1%麻油配比)喂养；三个干预组共24只，各8只，前12周和模型组相同处理，肥胖模型制成后，分别用高、中、低三种剂量LBP进行干预4周。依照动物与人体体表面积换算法，结合《中国药典》中枸杞的人体推荐剂量6~12 g/d，确定枸杞多糖低(75 mg/kg)、中(150 mg/kg)、高(300 mg/kg)剂量组。实验期间定期观察小鼠摄食量，体长，体重，并计算Lee’s指数来评估造模是否成功，Lee’s指数 = 体重(g)/[体长(cm)]²。

3.2. 实验动物标本收集和保存

对小鼠进行称重，麻醉后眼球取血，室温静置2 h，4℃ (3000 rpm, 20 min)离心，取上清液保存于−80℃。收集脂肪、肝脏等组织后一部分立即放入液氮冷冻，2 h后移入−80℃冰箱冷藏保存，另一部分置于4%多聚甲醛中固定。

3.3. ELISA检测CRP、IL-6、TNF-α

设立标准品孔(加入梯度浓度标准品50 μL/孔)、样本孔(加待测样本10 μL及稀释液40 μL，按1:5稀释)及空白孔。除空白孔外，各孔加入HRP标记检测抗体100 μL/孔，封板后37℃孵育。用含0.05% Tween-20的PBS洗涤液洗板5次。依次加入TMB底物A、B各50 μL/孔，37℃避光显色，加入终止液50 μL/孔，于450 nm (参比630 nm)测定OD值，依据标准曲线定量目标蛋白浓度。

3.4. 脂肪组织形态学检测

组织样本处理：将组织置于包埋盒中，经梯度酒精脱水、二甲苯透明、60℃浸蜡处理后，石蜡包埋、切片至防脱片后保存。

HE染色：组织切片经二甲苯脱蜡，无水乙醇、梯度酒精至水化后，苏木素染色，1%盐酸酒精分化，流水返蓝，伊红染色，脱水透明，中性树胶封片。

免疫组化染色：切片脱蜡水化后，柠檬酸钠抗原修复液高温修复，自然冷却。3% H₂O₂避光灭活，山羊血清封闭，一抗4℃孵育过夜。复温后滴加二抗，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。全程PBS洗涤3次/步骤，关键步骤避光操作(注：DAB显色时间需显微镜下实时监控)。

3.5. 脂肪组织Western Blot检测

组织样本经RIPA裂解液(含1% PMSF)冰上裂解，12,000 × g离心15 min取上清，BCA法定量蛋白浓度。制备SDS-PAGE凝胶(分离胶/浓缩胶)，每孔上样20~50 μg蛋白，80 V恒压电泳至溴酚蓝抵达分离胶底端。

电泳后凝胶与PVDF膜经转印夹装配，200 mA恒流转膜(冰浴控温)。转印后膜用5%脱脂牛奶–TBST封闭液室温摇荡封闭。

TBST洗涤3次(5 min/次)，加入稀释一抗(1:1000，4℃孵育过夜)。复温后洗涤，加入HRP标记二抗(1:5000，室温孵育1 h)。TBST充分洗涤，ECL显影液(A:B = 1:1)覆盖膜表面，化学发光仪采集信号，ImageJ分析目标条带灰度值。

3.6. 统计学分析

用Image J 1.8.0，Graph Pad Prism 10.1.2软件进行统计作图，计量数据以均数 ± 标准差($\overline{x}\pm s$ )表示，多组间采用单因素方差分析，P < 0.05表示差异具有统计学意义。

4. 结果

4.1. 小鼠体重及Lee’s指数的结果

实验具体实施方案如图1所示，为了观察枸杞多糖干预前后对肥胖小鼠内质网应激及炎性水平的影响，实验过程中严格进行高脂饲料喂养造模。

Figure 1. Experimental protocol

图1. 实验方案

Table 1. Body weight changes in each group of mice ($\overline{x}\pm s$ ), compared with the G group, ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05

表1. 各组小鼠体重变化情况($\overline{x}\pm s$ )，与G组比较，***P < 0.001，**P < 0.01，*P < 0.05

	N	J	G	GL	GM	GH
0周	18.30 ± 0.67	19.08 ± 1.67	19.11 ± 0.93	17.65 ± 1.86	18.91 ± 1.43	18.59 ± 1.13
16周	28.50 ± 2.43^***	32.50 ± 2.88^**	39.71 ± 2.43	31.85 ± 4.43^**	30.14 ± 2.79^***	33.12 ± 5.94^*

实验过程中详细记录不同实验组小鼠的体重变化，如表1结果显示：在饲养过程中G组以及干预组在高脂饲料喂养后体重增长幅度明显高于N组和J组，开始干预后，干预组体重增长幅度仍高于N组和J组，但是明显减缓，其中GM组增长幅度减缓较为明显。

表2结果显示：小鼠16周末的Lee’s指数，与体重数据结果相似，G组Lee’s指数比N组高，经过LBP干预后下降，其中GM组下降最为明显。

Table 2. Lee’s index of mice ($\overline{x}\pm s$ ), Compared with the G group, ***P < 0.001

表2. 小鼠Lee’s指数($\overline{x}\pm s$ )，与G组相比，***P < 0.001

N	J	G	GL	GM	GH
0.41 ± 0.04^***	0.40 ± 0.04^***	0.55 ± 0.04	0.47 ± 0.01^***	0.47 ± 0.02^***	0.48 ± 0.01^***

4.2. ELISA法检测炎性因子的结果

为了观察LBP干预对肥胖小鼠炎症因子分泌的影响，对小鼠新鲜血清进行TNF-α、CRP、IL-6三个指标的检测，表3结果显示：G组较N组炎性因子的分泌明显增多，但在LBP干预后，分泌量均减少。

Table 3. Serum inflammatory factors (TNF-α, CRP, IL-6) in mice ($\overline{x}\pm s$ ), Compared with the G group, ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05

表3. 小鼠血清炎性因子TNF-α、CRP、IL-6指标分析结果($\overline{x}\pm s$ )，与G组相比，***P < 0.001，**P < 0.01，*P < 0.05

组别	n	CRP (ng/ml)	IL-6 (pg/ml)	TNF-α (pg/ml)
N	6	143.45 ± 29.67^***	30.21 ± 4.21^***	267.77 ± 15.02^***
J	6	177.88 ± 9.70^***	35.41 ± 5.12^***	376.95 ± 61.62^***
G	6	258.02 ± 22.40	59.35 ± 4.60	619.92 ± 50.97
GL	6	222.70 ± 34.73	52.62 ± 3.44^***	564.87 ± 58.35
GM	6	179.70 ± 28.11^***	42.96 ± 5.03^***	449.45 ± 39.88^***
GH	6	182.62 ± 13.30^***	38.74 ± 3.60^***	420.77 ± 54.63^***

4.3. HE染色脂肪组织的结果

Figure 2. HE staining of adipose tissue in mice (400×)

图2. 小鼠脂肪组织HE染色图(400×)

将各组小鼠脂肪组织进行石蜡切片后染HE染色，图2可见N组及J组脂肪细胞形态规整，可见小泡型脂肪细胞；G组大泡型脂肪细胞数量增多，间质内可见巨噬细胞增多。干预组小泡型脂肪细胞数量较G组增加，间质内巨噬细胞数量减少。

通过观察脂肪组织的大泡型脂肪细胞和小泡型脂肪细胞的数量以及面积来确定脂肪组织的形态变化，图3显示对各组组织切片下的大泡型脂肪细胞的面积进行计算，显示高脂模型组较正常组明显增多，经过干预后，明显下降。

4.4. 免疫组织化学法检测脂肪组织ERS相关因子的结果

为探究LBP是否能够改善肥胖小鼠脂肪组织中内质网应激状况，对各组小鼠脂肪组织进行免疫组化染色，图4、图5为脂肪组织JNK、JUN的表达情况，结果显示G组染色部分明显多于N与J组，各干预组着色情况均低于G组。表4为LBP影响下不同因子20×视野下阳性面积，结果显示脂肪组织中，G组阳性面积明显多于N与J组，与G组相比，各干预组在JNK、JUN表达量明显下降。

Figure 3. Area of unilocular adipocytes in murine adipose tissue, compared with the G group, ***P < 0.001

图3. 小鼠脂肪组织大泡型脂肪细胞面积，与G组相比，***P < 0.001

Figure 4. Immunohistochemical staining of JNK expression in adipose tissue (400×)

图4. 免疫组织化学染色JNK在脂肪组织的表达情况(400×)

Figure 5. Immunohistochemical staining of JUN expression in adipose tissue (400×)

图5. 免疫组织化学染色JUN在脂肪组织的表达情况(400×)

Table 4. Immunohistochemical analysis of adipose tissue in mice ($\overline{x}\pm s$ ), compared with the G group, ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05

表4. 小鼠脂肪组织免疫组化指标分析结果($\overline{x}\pm s$ )，与G组相比，***P < 0.001，**P < 0.01，*P < 0.05

	N	J	G	GL	GM	GH
JNK	0.04 ± 0.01^**	0.12 ± 0.06^*	0.26 ± 0.14	0.11 ± 0.07^*	0.11 ± 0.07^*	0.10 ± 0.08^*
JUN	0.03 ± 0.01^***	0.03 ± 0.01^***	0.09 ± 0.01	0.04 ± 0.01^***	0.03 ± 0.01^***	0.03 ± 0.01^***

4.5. Western Blotting法测定脂肪组织ERS相关因子、炎性因子蛋白表达的结果

Figure 6. Analysis of protein markers in adipose tissue: (1): Band images; (2): Quantitative analysis. Compared with the G group, ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05

图6. 小鼠脂肪组织相关蛋白指标分析，(1)：条带图；(2)：统计图。与G组相比，***P < 0.001，**P < 0.01，*P < 0.05

对小鼠脂肪组织中内质网应激相关因子(IRE1α, JNK, JUN)以及炎性因子(CRP, IL-6)的表达情况进行检测，图6结果显示：G组较N组和J组各因子表达量均显著增加，干预后表达均有所下降，其中GL、GM组较GH组下降明显。

5. 讨论

5.1. 肥胖与慢性炎症及内质网应激的关联

肥胖本质上是一种体内脂肪组织过度蓄积的病理状态。近年来的大量研究表明，肥胖与脂肪组织中的慢性炎症密切相关，被视为一种全身性的低度炎性状态。白细胞作为机体防御反应的核心细胞群体，是反映机体炎症状态最为直观的指标。其中，巨噬细胞在免疫应答和炎性异物吞噬过程中发挥着关键作用，主要可分为M1型和M2型。M1型巨噬细胞能够分泌微囊泡，这些微囊泡会触发促炎反应，进而导致人脂肪细胞中NF-κB核转位增加、Akt磷酸化以及GLUT4膜转运减少，最终引发胰岛素抵抗，使内脏脂肪含量升高[9] [10]。此外，有学者研究发现，肥胖者外周血中IL-6、TNF-α等多种炎症反应标志物的浓度显著上升[11] [12]。

本实验对各组小鼠的炎性因子进行检测后发现，相较于正常组，模型组小鼠体内细胞间质中出现大量巨噬细胞浸润，炎性因子的分泌量显著增多，炎症相关因子的蛋白表达水平也明显上升。这一结果表明肥胖机体处于明显的炎症状态，与以往的相关研究结果高度一致。与正常组一样未经过高脂饲料喂养的假手术组虽然体内炎性因子分泌量及表达量也有上升趋势，但推测是由于日常灌胃(生理盐水)操作刺激小鼠使其处于焦虑状态，从而产生炎性因子。

在生理状态下，内质网未折叠蛋白反应(UPR)通过精细调控蛋白质的合成、折叠及降解过程，维持内质网的稳态。然而，肥胖状态下[13]，营养过载、脂毒性以及氧化应激等因素会导致UPR从适应性反应转变为病理性激活。研究表明，内质网应激标志物GRP78和CHOP在肥胖患者内脏脂肪组织中的表达分别升高2.5倍和3.1倍(P < 0.01)，并且与血清MCP-1水平呈显著正相关(r = 0.68) [14]。IRE1α通路可通过TRAF2-JNK轴促进M1型巨噬细胞极化。在高脂饮食(HFD)喂养的肥胖小鼠附睾白色脂肪组织(ATM)中，IRE1α磷酸化水平较对照组升高4.2倍，同时伴随TNF-α和IL-1β分泌量分别增加3.8倍和2.9倍[15]。多项实验均证实肥胖机体中存在内质网应激(ERS)。本实验在对正常组及模型组脂肪组织进行检测后发现，模型组体内ERS通路被激活，相关蛋白表达显著增多，这与相关研究结果相符。

5.2. 内质网应激与慢性炎症的相互作用机制

肥胖机体内同时存在ERS和慢性低度炎症，且已有研究证实二者之间存在紧密的关联。ERS可通过多种信号通路激活炎症信号。核因子κB (NF-κB)作为一类高度保守的核转录因子家族，在炎症相关基因的转录激活过程中具有核心调控功能，是介导炎症信号转导的关键分子枢纽。当细胞接受外源性刺激信号时，IκB激酶复合物(IKK)通过级联活化机制被激活，其催化亚基随后介导IκB蛋白的磷酸化修饰。该翻译后修饰导致IκB/NF-κB异源二聚体的构象变化，促使NF-κB从复合物中解离并发生核转位，最终在细胞核内与特定DNA调控元件结合，启动下游炎症介导基因的转录程序[16]。

在ERS病理状态下，激活的IRE1α能够与肿瘤坏死因子受体相关因子-2 (TNF-Receptor Associated Factor 2, TRAF2)形成特异性蛋白互作，触发IKK激酶复合物的空间招募，从而使IκB磷酸化，激活涉及炎症应答的靶基因转录调控网络[16]-[18]。有实验发现，在IRE1α基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞中，内质网应激诱导的NF-κB激活和炎症因子TNF-α的产生明显减少[19] [20]，这直接证明了IRE1能够激活NF-κB，进一步揭示了ERS与炎症反应之间的分子机制联系。

5.3. 枸杞多糖对肥胖相关炎症和内质网应激的干预作用

本实验在小鼠饲养以及干预过程中进行了实时的体重和体长记录。结果显示，与正常饲料喂养的小鼠相比，高脂饲养的小鼠体重增长幅度显著加快。在达到肥胖标准后，对小鼠进行不同剂量的枸杞多糖(LBP)干预，干预组的体重增长幅度明显低于模型组，其中GM组增长幅度减缓较为明显。

肥胖机体处于内质网应激和慢性炎症叠加的状态，表现为血清中炎性因子分泌增多、脂肪细胞数量增多且形态发生改变、巨噬细胞浸润增加，同时ERS相关蛋白IRE1-α、JNK、AP-1和炎症相关因子CRP、IL-6、TNF-α的表达显著上调。而经过枸杞多糖干预后，各项指标均有所改善。进一步研究发现，LBP对炎症的改善作用能够通过ERS通路IRE1α/JNK/AP-1来实现的。

值得注意的是，本研究发现在不同剂量的干预下，低剂量和中剂量的LBP干预效果优于高剂量，这表明LBP干预呈现非剂量依赖性的抗炎效应。这一现象提示LBP可能通过多靶点协同作用实现疗效优化，而非单纯依赖剂量累积效应。对此本研究仍存在若干需深入探讨的问题：如继续评估其他UPR分支的响应情况，高剂量LBP的抑制机制等[21] [22]。后续研究中，我们将致力于检测PERK/eIF2α-ATF4及ATF6/XBP1s通路的激活程度及基于LBP的多糖结构特性，探讨其作用发挥的剂量效应调控机制[23]。

6. 结论

肥胖与脂肪组织慢性炎症及内质网应激密切相关，ERS可通过IRE1α-TRAF2-JNK轴等通路激活炎症信号。LBP能通过调控IRE1α/JNK/AP-1信号通路减缓肥胖慢性炎症，降低炎性因子分泌，减少相关细胞数量及蛋白表达。LBP对肥胖相关炎症的改善作用并非剂量依赖性，低、中剂量干预效果优于高剂量，为肥胖治疗策略开发提供了依据。

基金项目

2023年大学生创新创业训练计划项目(S202310752021)。

NOTES

^*通讯作者。