摘要: 背景：儿童社区获得性肺炎(CAP)是儿科常见的感染性疾病，其病原体复杂多样，传统的病原学检测方法如痰液和血液培养在多重病原体感染的识别方面存在局限。靶向二代测序通过高效的基因检测和生物信息分析，实现了对多种致病病原微生物的快速识别，特别适用于复杂的病原体检测。目的：本研究旨在探讨tNGS技术在儿科CAP患者中病原体检测的应用价值，通过对比tNGS结果与传统实验室检测结果，评估tNGS在检测敏感性、复合感染识别及耐药基因筛查方面的优势。方法：选取2023年7月至2024年6月在广州某医院住院的705例儿科CAP患者，对其支气管肺泡灌洗液进行tNGS检测，并与肺泡灌洗液常规培养及血清学检测结果进行对比分析。结果：在传统培养方法中，110株病原菌被成功培养，检出率为14.75%，主要病原体包括流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、肺炎链球菌和鲍曼不动杆菌。相较之下，tNGS阳性检出699例，检出率高达99.15%；tNGS检测在705例患者中单一感染致病性病原菌或条件致病菌的病例为52例(7.38%)，未检出病原菌的病例数为6例(0.85%)，其余病例均检出双重或多重病原菌感染。tNGS检出的主要致病性病原体依次为肺炎支原体、人呼吸道合胞病毒B型、人类腺病毒B型、鼻病毒A型及人呼吸道病毒3型，复合感染中最常见的是肺炎支原体和人类腺病毒B型。耐药基因检测结果显示，tNGS检出耐药基因532例，以肺炎支原体的Mp_23S_rRNA (A2063G)和金黄色葡萄球菌的mecA为主，分别占比80.3%和8.46%。血清学检测显示，检出率最高的病原体包括肺炎支原体、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、腺病毒和嗜肺军团菌。tNGS检测与传统方法的检测结果相比，差异显著(54.6% vs. 99.1%, P < 0.01)，一致性较低(Kappa值 = 0.241，P = 0.019)。结论：tNGS技术在儿科肺部感染病原体的检测中表现出显著的敏感性优势，不仅提高了病原菌的检出率，特别是在识别儿科肺部感染常见的难培养病原体和复合感染方面具有显著优势，还提供了耐药基因的高效筛查手段。tNGS技术在复杂感染的早期诊断及精准治疗方案制定中具有较高的临床应用价值。
Abstract: Background: Children’s community-acquired pneumonia (CAP) is a common infectious disease in pediatrics. Its pathogens are complex and diverse. Traditional etiological detection methods, such as sputum and blood culture, have limitations in the identification of multiple pathogen infections. Through efficient gene detection and bioinformation analysis, targeted second-generation sequencing realizes rapid identification of a variety of pathogenic microorganisms, especially for complex pathogen detection. Objective: The purpose of this study was to investigate the application value of tNGS technology in pathogen detection in pediatric CAP patients, and to evaluate the advantages of tNGS in detection sensitivity, identification of complex infection and screening of drug resistance genes by comparing the results of tNGS with those of traditional laboratory tests. Methods: 705 pediatric patients with CAP admitted to a hospital in Guangzhou from July 2023 to June 2024 were selected for tNGS detection of bronchoalveolar lavage fluid, and compared with the results of routine culture and serological detection of alveolar lavage fluid. Results: In the traditional culture method, 110 strains of pathogenic bacteria were successfully cultured, the detection rate was 14.75%, the main pathogens included Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Streptococcus pneumoniae and Acinetobacter baumannii. In contrast, 699 cases of tNGS were detected, the detection rate was as high as 99.15%. Among the 705 patients, 52 (7.38%) were infected with single pathogenic bacteria or opportunistic pathogens, 6 (0.85%) were not detected by tNGS, and the other cases were detected with double or multiple pathogenic bacteria. The main pathogenic pathogens detected by tNGS were Mycoplasma pneumoniae, human respiratory syncytial virus type B, human adenovirus type B, rhinovirus type A and human respiratory virus type 3, and the most common complex infections were Mycoplasma pneumoniae and human adenovirus type B. The results of drug resistance gene detection showed that 532 cases of drug resistance genes were detected by tNGS, mainly Mp_23S_rRNA (A2063G) of Mycoplasma pneumoniae and mecA of Staphylococcus aureus, accounting for 80.3% and 8.46% respectively. Serological tests showed that the pathogens with the highest detection rate included Mycoplasma pneumoniae, respiratory syncytial virus, influenza A virus, adenovirus and Legionella pneumophila. The results of tNGS detection were significantly different from those of traditional methods (54.6% vs. 99.1%, P < 0.01), and the consistency was low (Kappa = 0.241, P = 0.019). Conclusion: tNGS technology has a significant sensitivity advantage in the detection of pathogens of pediatric pulmonary infection, which not only improves the detection rate of pathogens, but also has a significant advantage in the identification of common difficult-to-culture pathogens and complex infections in pediatric pulmonary infection, and also provides an efficient screening method for drug-resistant genes. tNGS technology has high clinical application value in the early diagnosis of complex infection and the formulation of precise treatment plan.
1. 引言
儿童社区获得性肺炎(CAP)是全球范围内儿童感染性疾病发病率和死亡率的主要原因之一，特别是在免疫力相对较低的幼儿中，CAP的高发率和病原体的复杂性对临床管理提出了巨大挑战[1]。CAP的致病病原体涉及多种细菌、病毒、真菌和非典型病原体，病原谱因地域差异、季节变化及年龄分布而呈现高度多样化[2] [3]。然而，传统的病原学检测方法如痰液和血液培养技术在识别这些复杂病原体方面存在显著不足[4]，其在多重感染检测和难培养病原体识别上灵敏度较低，导致诊断周期长且检出率低。这一局限性可能延误对病原体的识别和治疗的开始，进而增加了病情进展风险和医疗负担。
靶向二代测序(targeted next-generation sequencing, tNGS)技术的发展为复杂感染病原体的快速检测提供了一种新的、有效的工具。tNGS利用高通量基因组测序技术，通过对病原体基因组的靶向捕获和扩增，实现对多种致病微生物的高敏感性检测[5]。与传统培养方法相比，tNGS不仅在检测细菌、病毒和真菌等常见病原体方面显示出更高的阳性检出率，还能够识别传统方法难以检测的非典型病原体及其耐药基因。此外，tNGS技术还可以通过数据分析识别出多重病原体感染，弥补传统方法在复合感染检测方面的不足，为临床提供了多维度的病原学数据支持，有望显著提升感染性疾病的诊断准确性和治疗的精准性。
本研究的目的是评估tNGS技术在儿科CAP病原学检测中的实际应用效果。我们选取了2023年7月至2024年6月间在我院住院的705例CAP患儿，使用tNGS技术对其支气管肺泡灌洗液、痰液、鼻咽拭子等样本进行病原体检测，并与传统培养及血清学检测结果进行对比。通过分析两种方法在病原体阳性检出率、复合感染识别率及耐药基因筛查的差异性，我们希望明确tNGS在提升病原学检测灵敏度及优化临床诊疗决策中的潜在价值，为未来复杂感染性疾病的快速、精准诊断提供可靠的技术依据。
2. 资料和方法
2.1. 研究对象
此研究纳入2023年7月至2024年6月广州某医院儿科因肺部感染收治住院的患者705例。纳入标准：所有患儿均符合《儿童社区获得性肺炎诊疗规范(2019版)》的诊断标准，年龄1~16岁，病程 < 1个月。① 症状：有发热、咳嗽或喘息、呼吸增快等表现；② 体征：肺部可闻及固定的湿性锣音，部分肺炎支原体性肺炎患儿可无锣音；③ 影像学：胸部X片或胸部CT提示存在实变影，或合并肺不张，或合并胸腔积液；④ 纤维支气管镜适应证：符合《中国儿科可弯曲支气管镜术指南(2018年版)》的适应症第9条胸部影像学异常：a. 气管、支气管肺发育不良和/或畸形；b. 肺不张；c. 肺气肿；d. 肺部团块状病变；e.肺部弥漫性疾病；f. 纵隔气肿；g. 气道、纵隔占位；h. 血管、淋巴管、食管发育异常；i. 胸膜腔病变需鉴别诊断者。第10条肺部感染性疾病的病原学诊断及治疗。排除标准：① 合并严重心、肝、肾等疾病；② 影像学检查不支持肺炎；③ 存在纤维支气管镜检查相对禁忌症；④ 家属拒绝行纤维支气管镜检查；⑤家属拒绝行tNGS检测。该研究已获得广州医科大学附属中医医院伦理委员会批准(批件号：2024NK040)。
2.2. 方法
2.2.1. 支气管镜肺泡灌洗方法
入院后完善支气管镜肺泡灌洗术前检查，排除禁忌证，根据患儿的病情及家属的意愿，在入院的第2~7天，征得家属知情同意后，由具有操作资质的医生行支气管镜肺泡灌洗术，术中严格遵守无菌操作，根据镜下所见将支气管镜前端插入至病变部位的肺段，注入37℃灭菌生理盐水每次5~10 ml，灌洗2~3次，收集肺泡灌洗液两份各5 ml，一份送本院检验科行常规细菌培养，另一份行tNGS检测。
2.2.2. 痰标本的留取
留取深部痰液(晨起清水漱口后用力咳出第一口痰)于无菌容器中及时送检。鼻咽拭子培养标本需使用无菌拭子深入鼻咽部(到达咽后壁)旋转擦拭采集分泌物后，置于无菌试管内密封及时送检。
2.2.3. 传统的病原体检测
完善血培养及肺泡灌洗液、痰液、鼻咽拭子等样本培养、肺炎支原体血清学检测、呼吸道病毒八项抗原(嗜肺军团菌、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒B组)检测等。其中灌洗液培养为细菌培养法，将标本接种于血琼脂平板培养基、嗜血巧克力培养基、沙保罗平板；血琼脂平板培养基、嗜血巧克力培养基放置于35℃、5% CO2培养箱中培养72小时，沙保罗平板放置于35℃培养箱中培养至7天。肺炎支原体抗体、呼吸道病毒八项检测为免疫荧光法，严格按照试剂盒操作说明书进行。
2.2.4. tNGS检测
肺泡灌洗液、痰液、鼻咽拭子等样本征得家属同意后由检验科外送第三方检测机构(广州达安医学检验有限公司)行呼吸道多重病原体靶向二代测序(tNGS)，98种病原体及25个耐药基因/基因型，其中40种细菌，33种病毒，4种真菌，及4种特殊病原体。根据病原体的致病性分为致病性病原菌和条件致病菌。标本的采集、运输和保存严格按照公司的标准规范执行。检测流程分为以下关键步骤：首先进行核酸提取，随后构建测序文库，并在样本池中进行合并处理(pooling)，接着通过高通量测序获取大量病原体基因组数据，最后进行精确的数据分析与解读。整个检测过程控制在12小时以内，从标本送达至报告发布的时限则严格控制在24小时内。这一高效的tNGS检测流程，为临床提供了快速、精准的病原体识别手段，助力感染性疾病的早期干预和精准治疗。
2.3. 观察指标
病原体检出率：统计tNGS和传统细菌培养及血清学检测方法在肺泡灌洗液和血样中检出的病原体类型和数量，计算各方法的病原体检出率，对比分析tNGS与传统方法在病原体识别上的差异。
复合感染检出率：分析tNGS对复合病原体感染的识别情况，记录多种病原体的同时检出情况，并与传统检测方法的复合感染检出率进行对比，以评估tNGS在复合感染识别方面的优势。
耐药基因检测：使用tNGS技术对肺泡灌洗液样本中的耐药基因进行分析，记录检出的主要耐药基因类型和检出率。
检测一致性：对比tNGS与传统方法的检测结果，评估tNGS与传统检测方法之间的检出一致性。
2.4. 统计分析
本研究使用SPSS统计软件对数据进行分析。计数资料(如病原体检出率和复合感染检出率)以频数和百分比表示，组间比较采用卡方检验(χ2检验)，显著性水平设定为P < 0.05。对于tNGS与传统方法间的检测一致性，通过Kappa一致性检验进行评估。
3. 结果
3.1. 研究对象基线资料
本研究纳入2023年7月至2024年6月广州某医院儿科因肺部感染收治住院的患儿705例。患者平均年龄为5.19 ± 3.592岁，其中小于1周岁的患儿占11.1%，1~3周岁的占22.4%，4~6周岁的占28.6%，而6岁以上的学龄期患儿占37.9%。性别比例方面，男孩占52.1%，女孩占47.9%。见表1。
Table 1. Baseline data of study subjects
表1. 研究对象基线资料
|
均值/例数 |
标准差/占比 |
年龄 |
5.19 |
3.592 |
小于1周岁患儿 |
78 |
11.1 (%) |
1~3周岁幼儿 |
158 |
22.4 (%) |
4岁至6周岁的学龄前患儿 |
202 |
28.6 (%) |
6岁以上的学龄期患儿 |
267 |
37.9 (%) |
性别 |
|
|
男 |
367 |
52.1 |
女 |
338 |
47.9 |
WBC (109/L) |
8.8918 |
4.50942 |
NEU (109/L) |
4.988 |
3.86748 |
LYM (109/L) |
3.1835 |
2.81214 |
PLT (109/L) |
340.0324 |
128.80478 |
PCT (ng/ml) |
0.3605 |
2.28117 |
注：WBC：白细胞计数；NEU：中性粒细胞计数；LYM：淋巴细胞计数；PLT：血小板；PCT：降钙素原。
3.2. 传统培养方法检出病原菌情况
结果共培养出病原菌110株，检出率为14.75%：其中流感嗜血杆菌 > 金黄色葡萄球菌 > 白色念珠菌 > 肺炎链球菌 > 鲍曼不动杆菌。见图1，其中红色为细菌，绿色为真菌。3例为金黄色葡萄球菌和流感嗜血杆菌共感染，其他均为单一细菌或真菌感染。检出的真菌有：白色念珠菌、近平滑念珠菌、阿萨丝孢酵母菌、黄曲霉、热带念珠菌、克柔念珠菌、烟曲霉。
Figure 1. Culture results of alveolar lavage fluid by traditional method
图1. 肺泡灌洗液传统方法培养结果
3.3. tNGS检出病原菌情况
tNGS阳性检出699例，检出率高达99.15%。705例中单一感染致病性病原菌或条件致病菌为52例(占比7.38%)，未检出病原菌为6例(占比0.85%)，其他均为双重或多重病原菌感染。感染致病性病原菌前五位为肺炎支原体，人呼吸道合胞病毒B型，人类腺病毒B型，鼻病毒A型，人呼吸道病毒3型；见图2。混合感染最多的是肺炎支原体和人类腺病毒B型混合感染。感染条件致病性病原菌前五位为流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、卡他莫拉菌；另外，惠普尔养障体检出23例，真菌检出烟曲霉5例、耶氏肺孢子菌11例，见图3。
3.4. 耐药基因
共检出耐药基因532例，首位检出的是肺炎支原体Mp_23S_rRNA (A2063G)，占比80.3%；其次是金黄色葡萄球菌mecA，占比8.46%。见图4。在检出的450例肺炎支原体中，430例存在Mp_23S_rRNA (A2063G)耐药基因，占比高达95.56%；在检出的74例金黄色葡萄球菌中，45例检出mecA耐药基因，占比达60.00%。
Figure 2. Results of pathogenic bacteria detected by tNGS in alveolar lavage fluid
图2. 肺泡灌洗液tNGS检测出致病性病原菌结果
Figure 3. Results of conditional pathogenic bacteria detected by tNGS in alveolar lavage fluid
图3. 肺泡灌洗液tNGS检测出条件致病菌结果
Figure 4. Results of drug-resistant genes detected by tNGS in alveolar lavage fluid
图4. 肺泡灌洗液tNGS检出耐药基因结果
Figure 5. Results of pathogen serological tests
图5. 病原体血清学检测结果
3.5. 血清学检测结果
呼吸道病原体抗原血清学结果显示，检出排前5的是肺炎支原体、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、腺病毒、嗜肺军团菌，合并感染常见的有肺炎支原体合并呼吸道合胞病毒；肺炎支原体合并甲型流感病毒共感染。见图5。
3.6. 检测性能比较
将传统培养和血清学检测结果与tNGS结果进行比较，χ2检验结果显示两者检出率存在显著性差异(54.6% vs 99.1%) (P < 0.01)；检出结果一致性占比：完全一致9.36%，部分一致24.54%，完全不一致66.10%。两种方法的检测结果一致性较低(Kappa值为0.241，P = 0.019)。
4. 讨论
本研究通过比较传统培养、血清学检测与靶向二代测序(tNGS)技术在儿童社区获得性肺炎(CAP)病原体检测中的应用，探讨了不同方法的检出率、检出内容及耐药基因分析。研究结果显示，tNGS在病原体的阳性检出率、复合感染识别及耐药基因筛查方面均显著优于传统方法，尤其在难培养病原体和少见菌的检测上展现出更高的灵敏度和特异性。同时，tNGS能够快速提供病原体耐药基因信息，为临床精准用药提供了可靠的数据支持。尽管tNGS在病原学检测中展现了明显的优势，但其高灵敏度也提示呼吸道感染需结合实验室病原学检测、影像学、临床症状、病理学以及生物标记物和急性相炎症反应指标等综合诊断，以避免过度诊疗。
本研究中，传统培养方法的病原菌检出率为14.75%，在特定细菌(如流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌)和真菌(如白色念珠菌、黄曲霉等)的识别方面具有一定的效果。相关研究对于儿童常见肺部感染细菌的研究表明，培养细菌前三位分别为流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌[6]。梁学耀[7]等人回顾性分析了2191例住院肺炎患儿常见呼吸道病原体，结果显示最常见的细菌是肺炎链球菌，占21.7%。传统培养方法在酵母样真菌方面的检出率高于tNGS，这可能由于NGS测序技术对真菌破壁提取核酸尚未满足需求，仍需攻破真菌细胞壁厚破壁难的问题。已有研究指出，传统培养对难培养或少见真菌的识别敏感性较差，特别是肺泡灌洗液标本中的非典型真菌[8]。肺部真菌感染在免疫功能低下的儿童中相对常见，并可能危及生命[9]。因此，如何提高真菌的检出率，特别是对临床常见且不易培养的真菌种类的识别，成为急需解决的临床问题。
tNGS在病原体检出率及病原体种类的识别上显著优于传统培养，整体检出率高达99.15%，在病原体检测方面，tNGS在检测包括肺炎支原体在内的难培养细菌方面显示出靶向优势。与传统培养相比，tNGS能够更为精准且快速地识别多种病原体，尤其在多重感染的识别上表现突出。耶氏肺孢子菌是人类免疫缺陷病毒和免疫系统减弱儿童中常见的机会性呼吸道感染病原菌[10]，而常规实验室检查对于该菌的检出率极低，这与该菌的特殊性相关[11]。本研究结果在705例患儿中检出了11例耶氏肺孢子菌，这对于临床诊疗具有重要意义[12]。tNGS的优势在于其对核酸的直接检测，不依赖于微生物的生长过程，从而能检测到包括病毒、细菌和非典型病原体在内的广谱病原体。然而，这也为临床诊断带来了一定的困惑。结果报告将所有的检出菌均罗列出来，且尚未参考呼吸道标本是否合格，以及标本涂片结果，这存在一定的缺陷，需结合实验室常规细菌涂片及标本上皮细胞及白细胞数量进行综合判断。本研究发现，tNGS不仅在细菌的检出方面优于传统方法，还能有效识别肺炎支原体、人呼吸道合胞病毒等难以培养的病原体，与文献报道一致[6]。这说明，tNGS技术的应用可有效弥补传统培养的不足，特别是在传统方法检测阴性但临床怀疑存在感染的情况以及复杂感染的早期诊断中具有较高的临床价值[13]，以及针对儿童社区获得性肺炎这一类病原体与成人肺炎病原体差异较大的人群中更具临床价值[14]。
在耐药基因方面，tNGS在本研究中检出了532例耐药基因，尤其是肺炎支原体的Mp_23S_rRNA (A2063G)和金黄色葡萄球菌的mecA，分别占比80.3%和8.46%。这一结果表明，tNGS不仅能识别病原体，还能提供其耐药性信息，为临床用药提供依据。Lin等人估计了tNGS在检测47例儿童支气管肺泡灌洗液标本中呼吸道病原体和抗菌耐药基因方面的表现，研究成果证明了tNGS在病原体检测方面的优越性，特别是对多种难培养的病原体，以及在预测对红霉素和四环素的耐药性方面，对准确诊断病原体感染和指导临床治疗具有重要意义[15]。Chen的研究对245例儿科肺泡灌洗液标本进行检测，结果显示肺炎支原体对大环内酯类抗菌药物的耐药率 > 70%，对克拉霉素的耐药率最高，其次是罗红霉素、克林霉素、乙酰螺旋霉素、红霉素、阿奇霉素。207例肺炎支原体DNA阳性标本中，41例(19.8%)无耐药基因突变，166例(80.2%)有耐药基因突变，其中154例(74.4%)在23SrRNA V区中心环2063位点发生A→G突变，7例(3.4%)在2064位点发生A→G突变，5例(2.4%)在2063和2064位点均发生突变[16]，这与本研究结果肺炎支原体Mp_23S_rRNA (A2063G)耐药基因检出达80.3%相符。表明该病原体在儿童社区获得性肺炎(CAP)中的耐药性问题较为突出。该突变位点与大环内酯类抗生素的耐药性密切相关，临床上这类抗生素是治疗肺炎支原体感染的常用药物。因此，高检出率提示临床在选择抗生素时需慎重，可能需要避开大环内酯类药物，转向其他抗菌方案，或结合耐药基因检测结果，进行精准的个体化治疗以提升治疗效果并减少无效用药。然而，tNGS检测到的耐药基因是否完全代表临床实际的耐药情况仍有待进一步探讨。耐药基因的检出需结合具体的感染环境、宿主免疫状态和实际药物暴露情况来综合评估。已有研究提示，耐药基因的阳性并不完全等同于临床耐药性，其在耐药机制中具有重要参考价值，但仍需通过临床表现及药敏实验进行验证。
本研究的血清学检测结果显示，肺炎支原体合并呼吸道合胞病毒、肺炎支原体合并甲型流感病毒是常见的合并感染类型，而tNGS检测中则发现肺炎支原体和人类腺病毒B型的混合感染较为多见，一项国内的研究亦表明，腺病毒是最流行的合并感染生物，且病毒合并感染在3岁以下患者中更常见[17]。该差异可能与血清学检测的特异性和灵敏度不足有关，tNGS则可直接检测病原体基因组，不受抗体产生时间的限制。Li [18]等人通过对47例儿科重症肺炎患者的48份肺泡灌洗液样本进行回顾性研究，所有样本均采用多重PCR检测和tNGS检测，结果显示48份样本中发现了呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、甲型流感病毒(FLUA)、乙型流感病毒(FLUB)、副流感病毒1-3 (PIV1-3)和人偏肺病毒(hMPV) 8种常见呼吸道病毒，占31.2%。以培养、直接荧光抗体法和单链聚合酶链反应的常规测试结果作为tNGS结果鉴定的“黄金标准”，tNGS检测病原体的比例为70.8% (34/48)。tNGS与常规检测病原体的比例差异无统计学意义(P = 0.232)。tNGS对基于规检测病原体检测的敏感性和特异性分别为87.1% (95%CI, 71.77%~95.18%)和100.0% (95%CI, 62.88%~100%)，阳性预测值和阴性预测值分别为100.0% (95%CI, 87.35%~100%)和64.2% (95%CI, 35.62%~86.02%)。而多重PCR结果被用作“黄金标准”，tNGS总病原体检出率为83.3% (40/48)，与多重PCR的总病原体检出率(P = 0.003)有显著差异。tNGS与多重PCR相比的敏感性和阳性预测值分别为83.3% (95%CI, 69.23%~92.03%)和100.0% (95%CI, 89.08%~100%)。常规检测、多重PCR和tNGS证明了高的合并感染率。肺炎支原体(MP)和腺病毒是所有三种检测中检测最频繁的两种病原体，这与本研究血清学检测结果显示合并感染常见的有肺炎支原体合并呼吸道合胞病毒相一致。多个临床回顾性研究表明：与单纯肺支感染患儿相比，肺支和和腺毒共感染患儿的临床表现和气道黏膜病变更严重，更可能需要氧疗，合并感染可能导致重症肺炎，但大多数实验室标志物缺乏特异性[6] [19] [20]。
tNGS检测肺泡灌洗液、痰液、鼻咽拭子等样本中的细菌和病毒病原体具有良好的检测性能，但需要更多的研究来建立基于tNGS读数或分析平台的解释标准。此外，tNGS在病原体复合感染的识别上更为敏感，有助于准确了解感染的实际情况。文献中也提到，tNGS在病毒间的共感染识别上比血清学更为可靠[21]，为复合感染的病因分析提供了更为全面的数据支持。
在tNGS检测中还检出惠普尔养障体检出23例。惠普尔养障体是一种少见的细胞内病原体，通常与Whipple病相关[22]，但近年来的研究表明，它在免疫功能低下的患者中也可能导致肺部感染。惠普尔养障体感染的肺炎症状常不典型，可能表现为持续性咳嗽、呼吸困难甚至发热等[23]，与其他呼吸道感染难以区分，给临床诊断带来挑战。由于传统培养方法难以分离该病原体，靶向二代测序(tNGS)技术在其检出方面展现出独特优势。tNGS的应用有助于早期识别惠普尔养障体感染，为临床提供及时的治疗指导，特别是对免疫抑制患者来说，这一早期诊断手段具有重要的临床价值。tNGS技术的优势在于能够检测到这些特殊病原体，为疑难病例的诊断和治疗提供了更全面的依据。相关研究也显示，tNGS在检测少见或罕见病原体方面具有显著的临床价值，特别适用于传统方法难以检出的病原体，可以成为补充儿童肺炎常规方法的潜在诊断工具[24]。然后，本研究中，传统培养出的约氏不动杆菌、皮氏不动杆菌、抗辐射不动杆菌在tNGS中未被检出，这是由于此研究所用的98种呼吸道病原体中并未包含这些病原体，而导致的漏检，实验室应时刻关注儿科病原谱的变化而对检测靶向病原菌进行相应的调整以更好的未临床提供诊断价值。
综上所述，本研究通过比较传统培养、血清学检测与靶向二代测序(tNGS)技术在儿童社区获得性肺炎(CAP)病原体检测中的表现，全面分析了不同检测方法的优势与局限。结果表明，tNGS技术在提高病原体检出率、识别复合感染及耐药基因筛查方面具有显著的临床价值，尤其在难培养病原体和少见病原体的检出上展现了独特的优势。同时，tNGS提供的耐药基因信息为精准抗感染治疗提供了数据支持。然而，tNGS的高灵敏度也提示在应用时需结合患者的临床表现，避免过度诊疗。tNGS作为一种创新的分子诊断工具，在儿童CAP复杂感染的早期诊断和个体化治疗中具有重要的应用前景。然而本研究是回顾性研究，对于tNGS检出结果无法采用其他独立的方法或平台进行验证，也是本研究的局限性。
基金项目
S202410570099-2024年广东省大学生创新训练计划项目；02-408-240603131031-2023年度广州医科大学学生创新能力提升计划项目。
NOTES
*通讯作者。