1. 引言
慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis, CRS)是一种以鼻腔和鼻窦粘膜的慢性炎症性疾病(病程超过3个月)为特征的异质性疾病，病因和病理生理机制复杂，不仅涉及微生物和纤毛屏障功能，还与解剖、免疫、幽门螺旋杆菌感染等因素密不可分。根据病理特征可分为不伴息肉的慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis without nasal polyps, CRSsNP)和息肉的慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis with nasal polyps, CRSwNP)。流行病学调查显示CRS的全球患病率估计为5%~15% [1]，在西方国家发病率达11%~12%，在我国发病率也有2.2%~8%。该病典型临床表现为持续性鼻塞，脓性鼻分泌物及头痛等，严重者还会产生睡眠障碍、焦虑等心理问题[2]。CRS与下呼吸道疾病关系密切，其致病菌可从鼻窦部蔓延迁移至肺等地方[3]，提示其作为系统性气道疾病的重要组成部分。
目前，功能性鼻内镜手术(functional endoscopic sinus surgery, FESS)联合糖皮质激素使用[4]。但FESS术后1年的复发率为38%，术后长期复发率高达78.9% [5] [6]。因此针对鼻息肉的治疗仍然具有挑战性。生物制剂的应用虽然取得的效果好，但其价格昂贵，治疗时间长且有过敏的风险，而噬菌体疗法虽然价格便宜，操作方便，但伦理审查严格以及远期预后不明，且有机会触发免疫反应，使他们应用有限[7]-[9]。
究其根本原因，是目前对CRS的发病机制的认识仍然不足。因此，探讨CRS的发病机制，寻找新的治疗靶点和药物迫在眉睫。在过去的几十年里，人们对CRS的机制已有了很大的进展，但对CRS发病机制的理解仍有待扩展。
生物信息学方法是探索疾病的新型生物标志物和治疗靶标的非常重要和有用的方法。本项研究通过整合多组数据与生物信息学分析，旨在筛选与验证CRS新的生物标志物，以及为开发CRS新的治疗靶点提供理论依据，弥补现有治疗策略的不足。
2. 材料与方法
2.1. 数据获取及处理
从美国国家生物技术信息中心(NCBI)的基因表达综合数据库(GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，根据主题词检索和限定人类基因数据集以及如癌症等相关排除标准，最终纳入3个符合标准的数据集：GSE36830 [10]、GSE179265 [11]、GSE136825 [12]。GSE36830为基于GPL570平台的芯片数据，由6个正常对照组和18个鼻窦炎组组成；GSE179265和GSE136825是分别基于GPL24676、GPL20301平台的高通量(RNA-seq)数据。其中，GSE179265由7个正常对照组和17个鼻窦炎组组成，而GSE136825包括28个正常对照组和75个鼻窦炎组。使用GEOquery包下载芯片数据的相关信息，同时下载人类基因组注释文件Human.GRCh38.p13.annot，对RNA-seq数据进行TPM标准化。在剔除低表达基因后，用tidyverse包进行数据处理。若一个探针对应多个基因名，则保留第一个基因名。对于重复的基因，取其平均值。数据清洗用基于R (4.3.2版本)的RStudio (版本为2024.09.0 + 375)软件完成。
2.2. 差异分析
对三组数据分别作差异分析。芯片数据及RNA-seq数据分别用limma包和edgeR包筛选差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)进行下一步分析。对GSE36830的筛选标准为显著性阈值(P.Value) < 0.05且表达量变化(|logFC|) ≥ 1。对于GSE179265和GSE136825，FDR < 0.01且|logFC| ≥ 1.5和FDR < 0.01且|logFC| ≥ 1分别为两组数据差异基因的特征。且根据logFC的值分为上调和下调基因，对每组数据分别生成上下调基因列表，用于后续功能分析和可视化。ggpubr包、ggthemes包用于上下调基因的可视化。数据集的热图根据筛选标准，从上调和下调基因中各挑选30个基因用pheatmap包绘制。
2.3. 富集分析
用clusterProfiler包对差异基因进行基因本体论(Gene Ontology, GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析。其中GO包括生物过程(BP)、细胞成分(CC)、分子功能(MF)。ggplot2包对p < 0.05的结果可视化，即对GO富集结果以条形图的形式展现显著性最高的前8个条目，以气泡图的形式展示KEGG分析结果前二十条最显著的通路。
2.4. 加权基因共表达网络(WGCNA)分析
基于GSE179265数据集表达矩阵，使用WGCNA包筛选表达量绝对偏差最大的前5000个高变异基因用于网络构建，采用无尺度拓扑标准确定最佳软阈值为4，计算各模块特征基因(ME)与CRS的相关性，对模块中与CRS相关性(相关系数r)最高且p值<0.05的模块重点关注，挑选出其中的基因，以模块成员度(Module Membership, MM) > 0.8和基因显著性(Gene Significance, GS) > 0.2为标准，同时满足MM和GS标准的基因即为module_gene，若其在矩阵中同样差异表达，则定义为关键基因(hub gene)。
2.5. PPI蛋白网络制作
将GSE36830的差异基因输入String数据库(https://string-db.org/)，设定置信度阈值(score cutoff)为0.4，获取蛋白质相互作用关系数据。使用Cytoscape (3.10.3版本)加载STRING生成的互作网络文件，安装并运行cytoHubba插件，通过MCC算法，提取评分靠前的10个基因作为其关键基因(hub gene)。
2.6. 新标志物的确定
用VennDiagram包对GSE179265的module_gene与DEGs取交集，得到该数据集的关键基因(hub_gene)，进一步将GSE179265hub_gene与GSE36830的hub_gene取交集，鉴定共同关键基因(co_hub_gene)。最后，用独立数据集(GSE136825)验证co_hub_gene的表达情况，筛选同时满足|logFC| ≥ 1且FDR < 0.05的基因为候选生物标志物。通过在火山图上标记基因展示验证结果。
3. 结果
3.1. 差异分析
差异表达分析显示，三个数据集分别鉴定出428 (GSE36830)、1896 (GSE179265)和1263 (GSE136825)个DEGs。其中GSE36830以下调基因(292个)为主(68.2%)，而GSE179265和GSE136825中上调基因(1068个和725个)占比略高(56.3%和57.4%)。如图1、图2、图3所示，分别以火山图和热图展示了GSE36830、GSE179265和GSE136825差异基因分布和前60个显著DEGs的样本间表达模式。
3.2. 富集分析
如图4所示，在GSE36830中，GO功能富集分析结果显示，BP中差异基因显著富集于免疫细胞活化与迁移相关通路，包括白细胞细胞间黏附调控(GO:0002696)、细胞激活的正调控(GO:0050867)、细胞间黏附调控(GO:0022407)；CC包括质膜外侧(GO:0009897)、胶原蛋白胞外基质(GO:0062023)；MF包括丝氨酸水解酶活性(GO:0017171)、丝氨酸型肽酶活性(GO:0008236)；KEGG通路分析结果显示DEGs与造血细胞谱系(hsa04640)、神经活性配体–受体相互作用(hsa04080)有关。
如图5所示，在GSE179265中，GO功能富集分析结果显示，BP包括白细胞介导免疫(GO:0002443)、基于免疫球蛋白超家族域体细胞重组的适应性免疫应答(GO:0002460)；CC包括免疫球蛋白复合物(GO:0019814)、质膜外侧(GO:0009897)；MF包括抗原结合(GO:0003823)、碳水化合物结合(GO:0030246)。KEGG通路分析结果显示其与细胞因子–细胞因子受体相互作用(hsa04060)、神经活性配体–受体相互作用(hsa04080)有关。
如图6所示，在GSE136825中，GO功能富集分析结果显示，BP包括白细胞介导免疫(GO:0002443)、趋化作用(GO:0006935)；CC包括胶原蛋白胞外基质(GO:0062023)、质膜外侧(GO:0009897)；MF包括碳水化合物结合(GO:0030246)、酶抑制活性(GO:0004857)。KEGG通路分析结果显示其与细胞因子–细胞因子受体相互作用(hsa04060)、神经活性配体–受体相互作用(hsa04080)有关。
3.3. WGCNA分析
采用软阈值4构建共表达网络，共鉴定出8个与CRS相关的基因模块，簇状树突图、模块与两组的相关性图如图7所示，其中显著正相关模块为蓝绿色模块(r = 0.89, P < 0.05)、黑色模块(r = 0.65, P < 0.05)、棕色模块(r = 0.68, P < 0.05)；显著负相关模块为绿色模块(r = −0.81, P < 0.05)；边缘相关模块为蓝色模块(r = 0.48, P = 0.02)；无显著相关性模块有黄色模块(r = 0.22, P = 0.3)、红色模块(r = 0.14, P = 0.5)和灰色模块(r = −0.28, P = 0.2)。因此，挑选相关性最高的模块为蓝绿色模块及基因为核心研究对象。模块MM和GS相关性如图8所示。
Figure 1. Volcano plot and heatmap of GSE36830
图1. GSE36830的火山图和热图
Figure 2. Volcano plot and heatmap of GSE179265
图2. GSE179265的火山图和热图
Figure 3. Volcano plot and heatmap of GSE136825
图3. GSE136825的火山图和热图
Figure 4. Enrichment analysis bar chart and bubble chart of GSE36830
图4. GSE36830的富集分析条形图和气泡图
Figure 5. Enrichment analysis bar chart and bubble chart of GSE179265
图5. GSE179265的富集分析条形图和气泡图
Figure 6. Enrichment analysis bar chart and bubble chart of GSE136825
图6. GSE136825的富集分析条形图和气泡图
Figure 7. Clustered dendrogram and module correlation plot of GSE179265
图7. GSE179265簇状树突图和模块的相关性图
Figure 8. MM and GS Correlation with GSE36830 hub_gene
图8. MM和GS相关性与GSE36830hub_gene
3.4. PPI蛋白网络制作
如图8所示，通过Cytoscape的cytoHubba插件筛选PPI网络中的核心基因，最终鉴定出以下10个关键基因(hub_gene)，分别是ITGAM、CD86、IL3RA、IFNA1、CD209、CSF1R、CD33、IFNB1、IL2RA、SIGLEC1。
3.5. 新标志物的确定
通过图9的韦恩图发现，GSE179265差异表达基因DEGs与WGCNA模块基因module_gene存在559个关键基因(GSE179265hub_gene)。进一步与GSE36830的hub_gene取交集，获得7个共同关键基因(co_hub_gene)，分别为CD209、CD86、CSF1R、IL2RA、ITGAM、SIGLEC1和CD33。如图10所示，在独立数据集验证可见，除CD33外，其余6个基因均呈显著性表达(|logFC| ≥ 1，FDR < 0.01)。
Figure 9. Identification of co_hub_gene
图9. co_hub_gene的鉴定
Figure 10. Validation of key gene significance using an independent dataset
图10. 独立数据集验证关键基因显著性
4. 讨论
CRS作为耳鼻咽喉头颈外科领域的常见炎症性疾病，是一种常见的鼻腔和鼻窦黏膜长期炎症。其发病机制尚不清楚，可能与免疫失衡、微生物、遗传等有关。该病不仅全球患病率高，且术后复发率可达78.9%，导致显著的医疗负担与患者生活质量下降。因此，基于本研究发现的新型生物标志物(CD209、SIGLEC1、IL2RA)，对实现CRS精准诊断及治疗具有重要意义。
在本研究中，富集分析结果显示三个数据集均显著富集于“神经活性配体–受体相互作用”(hsa04080)和质膜外侧(GO:0009897)，提示神经–免疫调控可能是CRS的关键机制且证明了免疫受体介导的细胞表面信号传导的重要性。
本研究通过多数据集交叉分析(GSE179265、GSE36830和GSE136825)和WGCNA共表达网络，系统筛选出与慢性鼻窦炎(CRS)相关的关键基因模块和hub基因：CD209、CD86、CSF1R、IL2RA、ITGAM、SIGLEC1。
其中CD86、CSF1R和ITGAM已被既往研究报道[13]，因此，最终鉴定出CD209、IL2RA和SIGLEC1作为CRS的新型生物标志物。
CD209 (又称DC-SIGN，全称DC-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin)，编码一种C型凝集素受体，在细胞粘附和病原体识别中发挥作用，其属于II型跨膜蛋白，具有病原体识别、炎症调节等作用[14] [15]。此外，rs657152-A基因变异与CD209高表达相关[16]，可增强HIV、SARS-CoV-2等病毒的侵入效率。在COVID-19重症患者中，CD209可能通过结合病毒刺突蛋白促进免疫逃逸[17] [18]。Hottz [19]和Yu [20]等发现，CD209介导幽门螺杆菌(HP)进入树突状细胞，影响树突状细胞的成熟，使免疫应答削弱，促进慢性感染。因此，CD209作为C型凝集素受体，可能通过结合鼻窦炎相关病原体(如细菌、病毒等)，促进其侵入树突状细胞、巨噬细胞，导致病原体不受免疫监视，从而引发持续性感染。
IL2RA (又名CD25，全称Interleukin-2 receptor subunit alpha)，基因编码白细胞介素-2 (IL-2)受体的α亚基，是构成高亲和力IL-2受体的组成部分。作为调节性T细胞(Treg细胞)的特异性表面标志物，CD25在T细胞免疫调控中具有核心作用，其异常表达与感染和自身免疫性疾病密切相关[21] [22]。江莉等[23]发现，CD25在儿童EBV相关性噬血细胞综合征(EBV-HLH)患儿中高表达，提示其异常激活免疫系统。此外，CD25还参与Tregs调节性T细胞的发育和免疫调节[24]。作为调节性T细胞(Treg细胞)的特异性表面标志物，IL2RA对Tregs的发育和维持至关重要。因此，若IL2RA表达下调或功能异常，导致Tregs减少或功能障碍，可能促进一些炎症因子的释放，从而引发鼻窦黏膜的炎症反应。
SIGLEC1 (又名CD169或Siglec-1)属于唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglec)家族，主要表达于巨噬细胞亚群及部分树突细胞，可与乳腺癌细胞表面黏蛋白1 (MUC1)互相作用而影响肿瘤微环境[25]。在病毒感染时通过IFN-JAK-STAT1通路上调表达[26]，增强抗病毒防御。而且它不含免疫受体酪氨酸抑制基序[27]，提示其功能不依赖经典抑制性信号通路。此外，CD169是一种唾液酸识别蛋白[28]，可以特异性识别唾液酸化修饰的蛋白，维持稳态。因此，CD169可能通过识别CRS致病菌表面的唾液酸结合免疫球蛋白，抑制过度的免疫反应，但当这种平衡被破坏时，可能会导致持续感染。此外，高表达的CD169可使病毒通过IFN-JAK-STAT1通路增强巨噬细胞和树突细胞的抗病毒能力，但当通路被过度激活时，可能导致炎症因子释放，加剧黏膜损伤。
尽管目前缺乏针对CD209、IL2RA、SIGLEC1的诊断特异性的研究，但可结合其免疫调控以及CRS的发病机制，可通过基因检测、蛋白表达分析等实验评估其潜在价值。未来可结合临床样本，验证这些基因成为鼻窦炎新的生物标志物。
5. 结论
本研究基于GSE179265、GSE36830和GSE136825数据集的整合分析，鉴定出CD209 (DC-SIGN)、IL2RA (CD25)和SIGLEC1 (CD169)三个新型生物标志物。这些发现不仅完善了对CRS的免疫机制认识，更重要的是为临床诊断及治疗提供了新的思路。未来研究需通过多中心临床队列验证这些标志物的特异性，并开发相应的靶向治疗策略。
NOTES
*通讯作者。