摘要: 内生菌是植物微生态系统的重要组成部分，不同植物器官内生细菌分布数量存在差异，为了解刺梨根内生微生物群落结构特征，以贵州省龙里县人工种植不同林龄5年、10年、15年、20年的刺梨根系为研究对象，采用高通量测序法分析了刺梨根内生细菌、真菌的群落结构特征。结果表明：刺梨随着种植年限的增加，根际土壤理化性质不断改善，20年林龄速效磷、速效钾含量达最高，分别高达187.32 mg∙kg
−1、578.02 mg∙kg
−1，10年林龄刺梨的Vc含量最高，高达13.99 mg∙g
−1。根内生细菌和真菌群落多样性丰富度随着种植年限增加呈上升趋势，20年树龄根内微生物群落结构多样性最丰富，OTUs值均最大。刺梨根内生微生物群落结构与土壤因子有显著相关性，与果实Vc含量无显著相关性。
Abstract: Endophytes are an important component of the plant microecosystem, and the distribution and abundance of endophytic bacteria vary among different plant organs. To understand the structural characteristics of the endophytic microbial community in the roots of Rosa roxburghii, we studied the root systems of R. roxburghii planted in Longli County, Guizhou Province, with different stand ages of 5, 10, 15, and 20 years. High-throughput sequencing was used to analyze the community structure characteristics of endophytic bacteria and fungi in the roots. The results showed that as the planting years increased, the physicochemical properties of the rhizosphere soil of R. roxburghii continuously improved. The contents of available phosphorus and available potassium reached their highest levels in the 20-year-old stand, at 187.32 mg∙kg−1 and 578.02 mg∙kg−1, respectively. The Vitamin C (Vc) content was highest in the 10-year-old stand, reaching 13.99 mg∙g−1. The diversity of endophytic bacterial and fungal communities in the roots continuously increased with the planting years, with the 20-year-old stand exhibiting the richest diversity in the root microbial community structure and the highest OTU (Operational Taxonomic Unit) values. The structure of the endophytic microbial community in the roots of R. roxburghii was significantly correlated with soil factors but not significantly correlated with the Vc content of the fruit.
1. 引言
刺梨属蔷薇科蔷薇属为多年生落叶散生灌木植物，其果实又名茨梨、山王果、佛朗果和刺石榴等，作为我国西部山区独有的野生植物[1]，具有极高的营养价值与药用价值，在贵州省分布最为广泛。刺梨中Vc含量丰富[2]。刺梨根系较为发达，对喀斯特地区的石漠化治理具有极其重要的作用[3]。
根是植物为适应陆地生活在长期进化过程中形成的营养器官，其主要功能为吸收土壤中的水分与矿物质，提供营养物质给植物地上部分[4]。植物根内生微生物是植物生态系统的主要组成部分，包括真菌、细菌和放线菌[5]。植物内生菌与植物之间的相互作用，影响植物的生长、发育、抗逆等生命活动[6]，植物生理状态、地理条件及气候环境等因子对植物内生菌的种群组成及丰度产生较大的影响[7]。根内微生物能够加强根系和根际土壤之间的物质交换，从而诱导植物抵抗干旱、高温以及病原微生物等不良环境对植物造成的胁迫[8] [9]。目前，关于植物根内生菌的研究主要集中在药用植物[10]-[12]，对刺梨根内生菌的研究报道较少，李园园等(2013)对从刺梨植株分离得到72株内生真菌进行了抗菌活性实验，结果显示刺梨内生真菌的抗菌活性最强、菌谱最广[13]，张洪等对刺梨内生真菌的物种多样性研究表明刺梨根部的内生真菌多样性最高[14]。刺梨作为喀斯特石漠化地区典型的植物，其根内生微生物群落具有哪些特征？根内生微生物群落结构同刺梨Vc含量、根际土壤理化性质存在哪些关系？为明确以上问题，本研究以贵州省龙里县不同林龄的刺梨为研究对象，对不同林龄刺梨根内生真菌、细菌、土壤理化因子、刺梨果实Vc含量进行了分析，揭示了根内生微生物群落结构与刺梨果实Vc含量、根际土壤理化性质之间的关系，以期为提高人工种植刺梨品质提供了理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 研究区
研究区位于贵州省黔南布依族苗族自治州龙里县谷脚镇(26˚10'19''至26˚49'33''N，106˚45'19''至107˚15'1''E)，属中丘陵地貌，多岩溶丘陵，坡度平缓，洼地宽广，耕地集中。属典型的喀斯特地貌。平均海拔1300米，谷脚镇属亚热带季风气候，其特点是气候温和、雨量充沛、冬无严寒、夏无酷暑。多云雾照，湿度较大。多年平均气温13.9℃，最高达33.2℃，最低温度则在−2℃。年平均降水量1100毫米。无霜期年平均280天，年日照时数一般在1060至1265小时之间。
2.2. 样品采集
刺梨土壤样本及刺梨果实均采自贵州省黔南布依族苗族自治州龙里县谷脚镇。根据刺梨林龄进行采样，刺梨林龄分别为：5年、10年、15年、20年，对每个林龄的刺梨根际土壤进行采样，根际土壤样本取深0~10 cm、黏附于刺梨根系表面的土壤，为减少样本误差，在每种林龄下选取3株刺梨根际土壤混合为一个样本，同一林龄根际土壤样本进行三次重复，根际土壤样本按照树龄逐渐增大分别编码Ga、Gb、Gc、GG；用无菌刀选取根系长约5 cm的刺梨根，方法同根际土壤样品，每种林龄下进行三次重复取样，对应土壤样品，编号为GaG、GbG、GcG、GGG，装于自封袋于无菌条件下带回实验室，用无菌水洗净，送样。
2.3. 样品处理
对采集的土壤样品自然风干，去掉大块杂质，过20目筛，用于土壤理化性质的测定。土壤速效N采用碱解扩散法，速效P采用碳酸氢钠浸提–钼锑抗分光光度法测定，速效K采用醋酸铵浸提–原子吸收分光光度法[15]，有机质采用重铬酸钾外加热法测定土壤有机质[16]，使用酸度计测定pH值；刺梨Vc含量的测定方法参照胡敏[17]方法进行。
2.4. 根内生微生物群落结构测定
根内生微生物群落结构采用高通量测序法，所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，12个植物根系样品由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。
2.5. 数据处理
实验使用Excel软件对土壤理化性质和真菌多样性进行数据整理，运用SPSS对土壤因子进行相关性分析。Mantel tests相关性热图利用R软件进行统计分析。
3. 结果与分析
3.1. 不同林龄下刺梨根际土壤和刺梨根系理化性质
4种林龄刺梨根际土壤理化性质如表1所示，根际土壤样本pH值表现为随林龄的增加而上升；AN含量随刺梨林龄的增加而增加，且AN最高值达98.12 mg∙kg−1；根际土壤AP含量最高为20年林龄，高达187.32 mg∙kg−1；根际土壤AK含量高达578.02 mg∙kg−1；TOC含量均随刺梨林龄的增加而减少。10年林龄刺梨的Vc含量最高，高达13.99 mg∙g−1。
Table 1. Soil physicochemical properties of rhizosphere and vitamin C content in the fruit of R. roxburghii at different forest ages
表1. 不同林龄刺梨根际土壤理化性质及刺梨果Vc含量
样品 |
pH |
AN (mg∙kg−1) |
AP (mg∙kg−1) |
AK (mg∙kg−1) |
TOC (mg∙kg−1) |
Vc (mg∙g−1) |
Ga |
5.18 ± 0.03 |
67.54 ± 22.85 |
79.53 ± 20.13 |
272.27 ± 9.72 |
28.07 ± 1.03 |
12.85 ± 0.65 |
Gb |
5.44 ± 0.02 |
80.21 ± 5.53 |
171.19 ± 3.61 |
417.74 ± 101.64 |
27.03 ± 0.29 |
13.99 ± 1.30 |
Gc |
5.73 ± 0.03 |
91.32 ± 1.27 |
164.33 ± 66.16 |
506.02 ± 11.77 |
21.03 ± 0.61 |
12.65 ± 0.52 |
GG |
5.78 ± 0.03 |
98.12 ± 0.02 |
187.32 ± 34.21 |
578.02 ± 10.11 |
19.78 ± 0.04 |
11.22 ± 0.23 |
3.2. 不同林龄下刺梨根内生微生物高通量测序数据分析
本研究包含4种样本，分别为GaG、GbG、GcG、GGG，采用引物ITS1F和ITS2R分别得到120798、92088、92519、101574条平均原始读数，36058389、30019124、26306093、34899952 bp平均序列；经序列优化后，有效序列平均条数分别为118411、87476、88061、95697，测序序列平均长度分别为444、428、443、426 bp。采用引物341F和805R分别得到161960、120048、148493、106470条平均原始读数，71923062、53242577、64601387、47458588 bp平均序列；经序列优化后，有效序列平均条数分别为152156、112477、136437、98730，测序序列平均长度分别为448、461、440、474 bp。
3.2.1. 不同林龄刺梨根内生微生物多样性分析
Alpha多样性如表2所示，样本GaG、GbG、GcG、GGG的Coverage值99.00％以上，该指数是评价测序样本对低丰度物种的覆盖情况，研究测序覆盖度均高于99.00％，说明测序结果可代表土壤中物种的实际状况，测序结果有效。对不同林龄下根内生真菌测定发现，样本GGG的Shannon指数最大，为0.75，Simpson指数较小，为0.09，表明Gc真菌群落丰富度较高，根内生真菌多样性整体为GGG > GbG > GcG > GaG。根内细菌结果表明，样本GGG的Shannon指数最大，为0.43，Simpson指数最小，为0.44，样本GGG的菌群落丰富度较高，根内生细菌群落丰富度整体表现为GGG > GcG > GbG > GaG。
Table 2. Analysis of alpha diversity of endophytic microorganisms in R. roxburghii roots of different forest ages
表2. 不同林龄刺梨根内生微生物α多样性分析
物种 |
编号 |
Coverage/% |
Shannon指数 |
Simpson指数 |
Ace指数 |
Chao指数 |
真菌 |
GaG |
100.00 |
0.50 |
0.19 |
108.00 |
108.00 |
GbG |
100.00 |
0.67 |
0.10 |
110.14 |
105.00 |
GcG |
100.00 |
0.53 |
0.15 |
163.80 |
164.00 |
GGG |
100.00 |
0.75 |
0.09 |
284.04 |
263.00 |
细菌 |
GaG |
100.00 |
0.13 |
0.71 |
221.05 |
250.33 |
GbG |
100.00 |
0.16 |
0.62 |
467.28 |
406.06 |
GcG |
100.00 |
0.20 |
0.64 |
579.31 |
581.00 |
GGG |
99.00 |
0.43 |
0.44 |
619.12 |
634.82 |
3.2.2. 不同林龄刺梨根内生微生物组成分析
真菌OTUs VENN图 细菌OTUs VENN图
Figure 1. VENN diagram of the number of endophytic fungi and bacteria OTUs within R. roxburghii roots of different forest ages
图1. 不同林龄刺梨根内生真菌和细菌OTUs数量VENN图
根内生真菌和细菌OTUs数量VENN图所示(图1)，不同林龄刺梨内生真菌OTUs数目有较大差异，GaG、GbG、GcG、GGG数量分别为108、102、163、367，各自持有的OTUs数量分别为56、48、80、245。刺梨内生细菌，GaG、GbG、GcG、GGG数量分别为471、1127、274、1694，各自持有的OTUs数量分别为95、464、72、912。结果显示，种植20年的刺梨根内生微生物群落最丰富，真菌和细菌OTUs数量均为最高值。
3.3. 不同林龄下刺梨根内生微生物与土壤因子相关性分析
Mantel图2是不同林龄刺梨根内生真菌和细菌群落多样性与土壤因子、刺梨果实Vc的网络热图，图2(a)表明，根内生真菌群落结构与AP、AK、TOC呈极显著相关性(P < 0.01)，OTUs与AK、ACE指数与TOC、Simpson指数与AP呈现极显著相关性(P < 0.01)，Shannon指数、ACE指数、Simpson指数与pH值、AN呈现显著相关性(P < 0.05)，Shannon指数与AP呈现显著相关性(P < 0.05)，Chao指数与AK、TOC呈现显著相关性(P < 0.05)。图2(b)显示根内生细菌群落结构与TOC呈现极显著相关性(P < 0.01)，Chao指数、ACE指数与TOC呈现极显著相关性(P < 0.01)，OTUs、Chao指数、ACE指数、Simpson指数与pH值呈现显著相关性(P < 0.05)，OTUs与TOC、Shannon指数与AK、Simpson指数与AP、呈现显著相关性(P < 0.05)，Vc含量与根内生微生物α多样性无明显相关性。结果表明，不同林龄刺梨根内生微生物群落结构与土壤因子有显著相关性，与果实Vc含量相关性不显著，但土壤各因子之间存在明显的相关性。
Figure 2. Network heatmap of Alpha diversity of rhizosphere soil and endophytic fungi of R. roxburghii, soil factors, and Vitamin C content in R. roxburghii fruit
图2. 刺梨根际土壤及根内生真菌Alpha多样性与土壤因子、刺梨果实Vc含量的网络热图
4. 讨论
根内生微生物群落多样性随着林龄增长逐渐丰富，刺梨根系更倾向于招募具有直接促生功能的菌群。根内生菌与植物抗逆性等生命活动密切相关，崔博飞[18]等通过对不同品种桃树根部内生细菌群落结构、多样性及功能分析研究，结果表明根内生细菌群落具有促进植物生长和抗逆性的潜力。其中子囊菌门中部分属(如镰刀菌属)已被证实可与植物形成互利共生关系，可通过增强根系酶活性促进氮磷吸收[19]；红菇属真菌可以与植物根系形成共生关系，从而产生菌根，其对植物吸收水分和营养物质起促进作用，进而促进植物生长，并且可以提高植物的抗逆抗病能力[20]。土壤pH值、土壤有机物含量、速效磷含量、土壤氮含量和水分含量等都是影响真菌群落变化的主要驱动因子[21]，本研究中，根内生真菌群落结构与AP、AK、TOC呈极显著相关性(P < 0.01)，OTUs与AK、ACE指数与TOC、Simpson指数与AP呈现极显著相关性(P < 0.01)，根内生细菌群落结构与TOC呈现极显著相关性(P < 0.01)，Chao指数、ACE指数与TOC呈现极显著相关性(P < 0.01)，Vc含量与根际土壤真菌α多样性无明显相关性。不同林龄刺梨根内生微生物群落结构与土壤因子有显著相关性，与果实Vc含量相关性不显著。速效磷、速效钾与刺梨Vc含量呈正相关(P < 0.05)，植物根内生菌可促进宿主植物吸收N、P等营养元素，因此根内生菌可促进Vc的合成[22]。
5. 结论
(1) 随着刺梨林龄的增加，其生境土壤条件、根际土壤及根内生真菌群落多样性发生改变，根内生微生物群落多样性丰富度随着种植年限增加呈上升趋势。
(2) 刺梨根内生微生物群落结构与土壤因子有显著相关性，与果实Vc含量无显著相关性，因此在种植刺梨时应进一步关注土壤各理化因子，调整其在土壤中的范围，寻求提高刺梨品质的土壤环境。
基金项目
贵州省科技计划项目(黔科合基础-ZK [2024]一般651)；贵州省高校人文社会科学研究项目资助[2025RW079]贵州矿山生态修复与生态经济协同发展研究；贵州师范学院大学生创新创业训练计划项目(S2023142234065)、(S2023142234106)、(2023142234206)；贵州省教育厅2023年度普通本科高校科学研究项目(青年项目) (黔教技〔2022〕252号)；贵州师范学院科学研究基金项目(2021BS010)。
NOTES
*通讯作者。