基于机器学习算法和生信分析挖掘NSCLC的脂质代谢相关诊断标志物及其免疫细胞浸润特征

Identified Lipid Metabolism-Related Biomarkers and Immune Cell Infiltration Characteristics in NSCLC Based on Machine Learning Algorithms and Bioinformatics Analysis

摘要: 目的：越来越多证据表明，非小细胞肺癌(NSCLC)的发病与脂质代谢异常有关，因此靶向代谢途径可能是一种有效的治疗策略。本研究旨在结合生物信息学和机器学习分析，以确定NSCLC的脂质代谢相关的诊断标志基因。方法：我们利用基因表达总库(GEO)中的基因表达数据集筛选出差异表达基因(DEGs)，并将其与加权基因共表达网络(WGCNA)筛选出的主要模块基因相结合，然后再与732个脂质代谢基因相交。通过最小绝对收缩和选择算法(LASSO)和随机森林算法(RF)确定诊断标志物。利用接收者操作特征曲线(ROC)确认了其有效性。此外，通过CIBERSORT算法研究诊断标志物与浸润免疫细胞之间的关联。最后，进行实验来验证我们的发现。结果：在关键模块基因、DEGs和脂质代谢基因取交集后，共发现了71个交叉基因。通过机器学习算法确定了DPEP2、ACADL、BDH2和CAVl为潜在的生物标志物，其ROC曲线下面积(AUC)值分别为0.999、0.999、0.996和0.997。验证集分析和qPCR结果与我们的发现一致。免疫细胞浸润分析表明，所有诊断特征都可能在不同程度上与NSCLC的多种免疫细胞相关。结论：我们利用机器学习和生物信息学方法确定了NSCLC中与脂质代谢相关的诊断特征基因，为靶向NSCLC异常脂质代谢的治疗提供了依据。

Abstract: Objectives: Targeting the metabolic pathways may be a potentially effective therapy strategy for non-small cell lung cancer (NSCLC), as increasing evidence associates the disease’s development to dysregulated lipid metabolism. Our research combines bioinfommatics and machine learning analysis to identify diagnostic hallmark genes for NSCLC. Methods: Gene expression datasets were available from the Gene Expression Omnibus (GO). First, differentially expressed genes (DEGs) were found and combined with the major modular genes selected by the weighted gene co-expression network (WGCNA) and then intersected with a set of 732 lipid metabolism genes. The biomarkers were identified by applying least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) and random forest (RF) methods. The effectiveness and discrimination of the hub genes were confirmed using the receiver operating characteristic curve. Additionally, the association between diagnostic markers and infiltrating immune cells was investigated by calculating relative subsets of RNA transcripts (CIBERSORT). Finally, qRT-PCR experiments were conducted to validate our findings. Results: Overall, 71 lipid metabolism-related genes were detevted after overlapping key module genes and DEGs. We identified four key genes-DPEP2, ACADL, BDH2, and CAVl—as potential biomarkers, with area under the curve (AUC) values of 0.999, 0.999, 0.996, and 0.997, respectively, in the ROC curves. As indicated by the immune cell infiltration analysis, multiple immune cells may be involved in the development of NSCLC. Additionally, all diagnostic characteristics may correlate with immune cells to varying degrees. Conclusions: The hallmarks related to lipid metabolism (DPEP2, ACADL, BDH2 and CAV1) were identified using machine learning and bioinfommatics. Our study identifies potential diagnostic candidate genes for NSCLC and provides a basis for targeting aberrant lipid metabolism in NSCLC therapy.

1. 引言

非小细胞肺癌约占所有肺癌的85%，治疗难度大，预后差。NSCLC最常见的病理类型包括肺腺癌(LUAD)和肺鳞癌(LUSC) [1]。近几十年来，免疫检查点抑制剂(ICIs)和分子靶向疗法的研发取得了重大进展[2]。尽管如此，但在确定新的治疗靶点以扩大靶向疗法的受益人群方面仍面临严峻挑战[3]。新的证据表明，靶向NSCLC的脂质代谢通路有可能成为一种新的治疗方法。

脂质代谢紊乱是肿瘤细胞的一个关键代谢特征，它通过各种信号通路促进癌症的发展、侵袭和转移，这意味着靶向脂质代谢可能是一种新型的癌症预防和治疗策略[4]。越来越多的研究强调了脂质代谢异常在各种癌症中的作用。He等人[5]发现了一种可预测晚期胃癌预后的脂质代谢相关基因特征。然而，NSCLC中脂质代谢的改变及其作为诊断和治疗反应标志物的潜力还需要进一步研究。

脂质代谢对免疫细胞和恶性肿瘤的发展至关重要。它对控制肿瘤微环境(TME)中免疫细胞的活化、分化和功能至关重要[6]，TME内脂质代谢对氧化应激和代谢物浓度的调节与肿瘤细胞的免疫逃逸和耐药性有关[7]。例如，脂肪酸氧化(FAO)已被证明可提高PD-1免疫疗法的疗效[8]。因此，研究脂质代谢相关诊断标记物与免疫细胞浸润之间的关系将加深我们对NSCLC中TME的了解。

与之前的研究相比，我们的研究独特地整合了机器学习算法和生信分析，以确定脂质代谢相关的特征基因。应用ROC曲线分析评估了这些基因的诊断效果。此外，我们还发现了NSCLC中免疫细胞与这些基因之间的关系。我们的研究为诊断NSCLC提供了潜在的候选基因，并为针对脂质代谢异常的靶向治疗提供了理论依据。

2. 材料与方法

2.1. 数据集来源

数据来自基因表达总库(GEO)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) [9]。筛选标准如下：微阵列数据集必须涉及全基因组基因表达谱，由来自NSCLC患者和健康对照组的样本组成，排除与其他疾病相关的样本，且样本总数超过30个。最后，我们选择了GSE18842作为分析集，GSE74706作为验证集。

2.2. 识别差异表达基因

使用LIMMA软件包[10]确定了NSCLC组和对照组之间的DEGs，并绘制了火山图来显示DEGs的表达差异。分子特征数据库(MSigDB) 7.1版(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb)提供了743个脂质代谢相关基因(LRGs)。

2.3. 加权相关网络分析(WGCNA)

为了找到与NSCLC相关的基因模块，我们使用WGCNA软件包构建了一个无监督共表达网络，对临床特征与模块显著性(ME)之间的关系进行了评估。模块显著性(MS)被定义为模块中所有基因的平均GS，而基因显著性(GS)则用于量化单个基因的临床价值。绝对MS值最高的模块将进行额外的验证[11]。使用Draw Venn Diagram在线工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制DEGs、LRGs和关联度最高的模块基因之间重叠的维恩图，得出了71个交叉基因。

2.4. 交叉基因的功能富集分析

使用“clusterProfiler”软件包[12]对71个交叉基因进行KEGG和GO富集分析。q值小于0.05为显著性阈值。

2.5. 筛选诊断标记物

我们采用了两种机器学习算法来识别NSCLC的新型重要生物标志物。使用“randomForest”R软件包[13] [14]，按重要性排序选出前10个因子进行交叉验证。使用“glmnet”R软件包[15]进行LASSO逻辑回归，最小λ值被认为是最佳值。使用接收者操作特征曲线(ROC)分析来验证诊断标志物的效能，并通过计算曲线下面积(AUC)来衡量模型的预测准确性。

2.6. 免疫细胞浸润的评估和相关性研究

以P值小于0.05为临界值，我们采用CIBERSORT算法计算每个样本中22种免疫细胞类型的浸润水平[16]，并分析了诊断标记物与免疫浸润细胞之间的Spearman相关性。

2.7. 细胞培养

HBE和H460细胞在含10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素和链霉素的RPMI-1640培养基中培养，培养温度为37℃，5% CO₂。所有细胞系都进行了短串联重复(STR)分析。

2.8. RNA提取和qPCR

使用NcmSpin Cell/Tissue Total RNA Kit (NCM生物技术公司，中国苏州)提取总RNA，并使用HiScript IIIRT SuperMix for qPCR (+gDNA eraser) (Vazyme生物技术公司)反转录为cDNA，然后根据生产商的说明在7500系统(Thermo Fisher Scientific)上使用2 × RealStar Fast SYBR qPCR Mix进行qPCR反应。数据以GAPDH作为内源性对照进行归一化处理。

2.9. 统计分析

实验数据使用GraphPad Prism 9.3 (GraphPad Prism Software, La Jolla, CA, USA)进行统计分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 加权基因共表达网络构建

通过WGCNA，我们确定了区分肿瘤组和对照组的重要模块基因。当R² > 0.9时，具有高平均连接的理想软阈值是3 (图1(A))。最终，我们确定了9个基因模块(图1(B))。Turquoise模块与NSCLC呈正相关(r = 0.96，p = 1e−200) (图1(C))，且最具有临床意义。

Figure 1. Construction of co-expression network modules. (A) Optimal soft threshold power; (B) Genes with comparable patterns of expression were grouped together; various colors correspond to distinct gene clusters. (C) Heat map of module-trait correlations

图1. 共表达网络模块的构建。(A) 最佳软阈值；(B) 具有相似表达模式的基因被归为一组，不同颜色对应不同的基因簇；(C) 模块–性状相关性热图

3.2. 筛选NSCLC中的DEGs

我们通过差异表达分析发现了1074个下调基因和839个上调基因。利用火山图对结果进行了可视化(图2(A))。为了进一步完善重要基因的筛选，我们将DEGs和WGCNA中相关性最高的turquoise模块基因与LRGs相交。这一过程产生了71个交叉基因(图2(B))。

Figure 2. Identification of differentially expressed lipid metabolism-related gene. (A) Volcano plot of DEGs; (B) Venn diagram of the intersection of DGEs, LRGs and WGCNA significant module genes

图2. 脂质代谢相关差异表达基因的鉴定。(A) DEGs的火山图；(B) DGEs、LRGs和WGCNA重要模块基因交叉基因的维恩图

Figure 3. Functional enrichment function analysis. (A) GO analysis of 71 intersecting genes including MF, CC and BP; (B) KEGG analysis of genes that overlap

图3. 功能富集功能分析。(A) 包括MF、CC和BP在内的71个交叉基因的GO分析；(B) 重叠基因的KEGG分析

3.3. 功能和通路富集分析

为了深入研究了这71个交叉基因的潜在调控途径，我们对其进行了GO和KEGG富集分析。在三个GO类别中，生物过程(BP)组富集于脂肪酸代谢、二十碳烷代谢和有机酸生物合成。细胞组分(CC)组主要与脂滴、核膜、细胞器外膜等的合成有关。此外，分子功能(MF)组主要与氧化还原酶活性有关(图3(A))。KEGG通路分析显示，交叉基因主要富集在花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢和鞘脂信号通路(图3(B))。

3.4. 机器学习算法识别诊断标志物

我们利用LASSO回归分析挖掘出12个预测基因(图4(A)，图4(B))。利用RF结合特征选择算法，根据基因的重要性确定了前10个基因(图4(C)，图4(D))。两种算法筛选出的诊断标志物都包括DPEP2、ACADL、BDH2和CAV1 (图4(E))。接着，我们通过ROC分析评估了这些核心基因的诊断效能，结果显示，DPEP2、ACADL、BDH2和CAV1的AUC分别为0.999、0.999、0.996和0.997 (图5(A)~(D))。这些结果表明，这些生物标志物具有很高的预测精确度。且其在GSE74706验证集中的表现与训练集中的表达水平一致(图6)，这进一步证实了它们作为特征诊断生物标记物的潜力。

Figure 4. Identification of diagnostic markers through machine learning algorithms. (A) (B) LASSO logistic regression to identify diagnostic markers. (C) (D) RF algorithm to determine biomarkers. (E) A Venn diagram was created to illustrate the intersection of diagnostic biomarkers screeded by the two algorithms

图4. 通过机器学习算法确定诊断标志物。(A) (B) LASSO逻辑回归法确定诊断标志物。(C) (D) RF算法确定生物标志物。(E) 维恩图展示两种算法筛选出的诊断生物标志物的交叉点

Figure 5. The validation of diagnostic markers. (A)~(D) The ROC curve for determining diagnostic effectiveness; (E)~(H) The boxplot compared the expression of diagnostic markers between the tumor and normal groups

图5. 诊断标志物的验证。(A)~(D) 确定诊断有效性的ROC曲线；(E)~(H) 比较肿瘤组和正常组诊断标志物表达的箱线图

Figure 6. The performance of diagnostic markers in the validation set. (A)~(D) The ROC curve for diagnostic efficacy verification; (E)~(H) The boxplot compared the expression of diagnostic markers between the tumor and normal groups in GSE74706

图6. 诊断标记物在验证集中的表现。(A)~(D) 诊断效果验证的ROC曲线；(E)~(H) 箱线图比较了GSE74706中肿瘤组和正常组诊断标记物的表达情况

3.5. 免疫细胞浸润的结果

我们通过CIBERSORT算法发现，与正常样本相比，NSCLC样本含有更多的记忆CD4+ T细胞、M1巨噬细胞和M0巨噬细胞等。相比之下，CD8+ T细胞、活化的NK细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞等在NSCLC样本中的比例相对较低(图7(A))。其中，DPEP2的表达与M1巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞和静息树突状细胞呈正相关(图7(E))。ACADL的表达与静息树突状细胞呈正相关(图7(B))。BDH2的表达与静息肥大细胞呈正相关，与幼稚CD4+ T细胞和浆细胞呈负相关(图7(C))。这些发现意味着，NSCLC患者免疫细胞的组成和活性可能会受到这些诊断标志物表达水平的影响。

Figure 7. Infiltration of immune cells results. (A) Violin Diagram demonstrating the difference in immune cell infiltration between the tumor and normal groups; (B)~(E) Immunocell correlation plot of ACADL, BDH2, CAV1, DPEP2

图7. 免疫细胞浸润结果。(A) 小提琴图显示肿瘤组和正常组免疫细胞浸润的差异；(B)~(E) 分别为ACADL、BDH2、CAV1、DPEP2的免疫细胞相关图

3.6. 验证诊断标记物在NSCLC中的作用

为了评估四种诊断标记物的预后价值，我们对2166名肺癌患者进行了Kaplan-Meier (KM) Plotter分析。OS分析表明，四个关键基因的高表达组和低表达组之间的生存率差异很大(P < 0.05，图8(A)~(D))，诊断标志物表达水平较低的肺癌患者的生存率要低得多。使用qPCR检测了NSCLC细胞系中4个关键基因的表达情况，结果显示ACADL、BDH2、CAV1和DPEP2在H460中的表达量远低于正常肺细胞系HBE (图8(E)~(H))。

Figure 8. Validation of the role of diagnostic markers in NSCLC. (A)~(D) OS analysis of 4 key genes in Lung cancer patients by KM Plotter; (E)~(H) Validation of the mRNA expression of 4 hallmarks in NSCLC cell line by qPCR. Data represent the mean ± SD (n = 3). ^*P < 0.05 vs. the HBE

图8. 验证诊断标记物在NSCLC中的作用。(A)~(D) 利用KM Plotter对肺癌患者的4个关键基因进行OS分析；(E)~(H) 通过qPCR验证NSCLC细胞系中4个标志基因的mRNA表达。数据为平均值 ± SD (n = 3)。^*P < 0.05 vs. HBE

4. 讨论

近年来，针对肺癌的治疗取得了重大进展，但仍有75%的患者被诊断为晚期，错过了根治治疗的最佳时机[17]。因此，确定特异性诊断标志物对于改善NSCLC患者的预后至关重要。

脂质代谢重编程是膜合成、能量产生和信号转导的关键因素，而这些因素都会影响各种恶性肿瘤的肿瘤微环境(TME)、免疫反应和耐药性[18]。此外，脂质代谢异常已被证实是导致肺癌发生和发展的重要因素[19]。因此，针对脂质代谢的治疗策略在癌症治疗中展现了巨大的潜力[4]。脂质代谢与NSCLC之间的关系值得深入研究，因为可以从中发现更多参与肺癌发病、预后、预防和治疗的潜在生物标志物。机器学习在生物医学领域中应用逐渐广泛。这些算法能够识别高通量数据中的模式，生成全面的生物标志物图谱，从而显著提高诊断准确性[20]。RF模型是监督分类中常用的一种非参数方法。射频模型利用从分割数据集构建的决策树进行操作[14]。LASSO逻辑回归通过最大化降低分类错误概率的值来寻找变量[15] [21]。本研究采用两种机器学习算法和生物信息学分析技术来确定NSCLC中潜在的脂质相关特征标记。

我们首先在GEO数据集中发现了71个在NSCLC组和正常组织样本中具有不同表达水平的LRGs。根据GO分析，这些基因主要参与脂滴和脂肪酸代谢活动，而KEGG通路分析则突出了花生四烯酸代谢的富集。接着，通过RF模型和LASSO逻辑回归都将DPEP2、ACADL、BDH2和CAV1确定为关键基因，进一步的验证也证实了它们的准确性。我们的预测也准确地反映了机器学习算法与常规生信分析方法综合策略的可行性。

DPEP2 (二肽基肽酶2)是一种膜结合酶，参与将白三烯D4 (LTD4)转化为白三烯E4 (LTE4)的过程[22]。Zhang等人发现DPEP2是肺腺癌免疫相关预后生物标志物[23]，此外，Han等人建立了由BTK和DPEP2组成的免疫指数，该指数能有效区分肺腺癌的冷热免疫分型，并能评估预后和对放疗的临床反应[24]。虽然迄今为止对DPEP2在NSCLC中的研究还不够充分，但相信在进一步验证后，它很可能成为一个新的治疗靶点。

ACADL是一种催化长链脂肪酰辅酶A发生β-氧化的酶，在能量和磷脂代谢中发挥着重要作用[25]。有趣的是，ACADL在各种癌症中似乎扮演着截然不同的角色，它在食管癌中是一种致癌基因，与预后不良有关[26]。Chen等人认为，ACADL过表达可通过调节YAP磷酸化和阻止其核转位来抑制NSCLC的进展[27]。因此，ACADL能否成为治疗NSCLC的关键靶点仍需进一步研究。

BDH2是一种短链脱氢酶，在人类癌症的发展过程中扮演着重要角色[28]。越来越多的证据表明，BDH2通过抑制自噬和促进线粒体凋亡而成为致癌因子，从而导致肝细胞癌的进展[29]。也有报道称BDH2可促进活性氧诱导的自噬，从而抑制胃癌的生长[30]。此外，BDH2被证实通过增强Akt/mTOR介导的细胞凋亡和自噬，在肺腺癌中发挥抑癌作用[31]。我们的研究为其作为NSCLC未来治疗靶点的潜力提供了更多证据。

CAV1是非平面脂质筏的重要组成部分，可调节细胞信号传导[32]。先前的研究表明，CAV1能促进前列腺癌肿瘤细胞的非粘附性生长，这表明CAV1具有重要的致癌作用[33]。然而，CAV1在乳腺癌和结肠癌细胞中的高表达已被证明可减少肿瘤在体内和培养系统中的形成[34]。这些研究结果表明，CAV1作为致癌基因或肿瘤抑制因子的功能可能取决于其表达的细胞环境。这些作用的完整机制仍不清楚，需要进一步研究。

越来越多的证据表明，免疫细胞浸润与患者预后之间存在密切联系。肿瘤细胞中异常的代谢活动所带来的代谢压力会损害抗肿瘤免疫反应，进而影响浸润肿瘤的免疫细胞[35]。因此，为了进一步评估免疫细胞浸润对NSCLC的影响，我们使用CIBERSORT算法分析了患者免疫浸润与诊断标志物之间的联系。值得注意的是，四个关键基因的表达均在不同程度与免疫细胞相关，这些免疫细胞与肿瘤细胞相互作用，创造出一种高度免疫抑制的环境，降低了免疫疗法清除肿瘤细胞的效果，并助长了肿瘤的进展[36]。因此，这四种诊断生物标志物可能在NSCLC肿瘤免疫微环境中发挥不同的作用，并与疾病进程相关。

尽管本研究成功筛选出NSCLC中潜在的脂质代谢相关标志物，但仍存在一定的局限性。首先，由于缺乏详细的临床信息，如患者的年龄、性别、肿瘤分期等，无法对这些标志物临床价值的全面评估。未来研究可应用临床样本，并结合长期随访数据，以验证这些标志物在NSCLC诊断、预后预测及治疗反应评估中的实际应用潜力。其次，本研究采用CIBERSORT算法推断肿瘤微环境中的免疫细胞组成，但该方法的准确性高度依赖于参考基因集的完整性和表达数据的质量。此外，CIBERSORT仅能提供相对丰度信息，无法精确量化特定免疫细胞亚群的绝对数量。未来研究可结合单细胞RNA测序(scRNA-seq)等实验技术，进一步验证免疫细胞浸润模式，并探索关键基因与免疫微环境相互作用的分子机制。

5. 结论

本研究利用两种机器学习算法确定了与NSCLC脂质代谢异常相关的4个生物标志物：DPEP2、ACADL、BDH2和CAV1。通过ROC曲线、验证集分析、生存分析和qPCR证实了这四个关键基因作为诊断特征的强大预测能力。此外，研究还发现这四个关键基因与各种免疫细胞类型相关，这表明其可能在NSCLC的肿瘤微环境中起着重要的作用。我们的研究有助于加深对NSCLC脂质代谢异常这一复杂过程的理解，但要证实我们的发现还需要进一步的研究。

基金项目

广西自然科学基金青年科学基金项目(2023GXNSFBA026040)；广西医科大学第二附属医院基金项目(hbrc202104)。

NOTES

^*通讯作者。