1. 引言
代谢功能障碍相关脂肪性肝病(Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease, MASLD)，是一种以肝脏脂肪异常堆积为特征的代谢性疾病。随着肝脏单纯性脂肪病变的发生，将会进一步产生炎症反应及肝纤维化，疾病逐渐发展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎(Metabolic Dysfunction-Associated Steatohepatitis, MASH)，最终进展为肝硬化和肝癌[1]。MASLD已经成为全球范围内的重大公共卫生挑战，影响了全球约三分之一的成年人口[2]。在MASLD的早期阶段，可以通过生活方式的调节(包括饮食结构及体育锻炼)缓解甚至逆转病情。然而，一旦疾病进展至MASH阶段，药物干预则成为治疗的必须手段。目前，MASH的治疗药物较为有限，仅一款药物经美国食品药品监督管理局批准用于MASH的治疗，因此亟需新型MASH药物的开发[3]。
脂肪酸合酶(Fatty Acid Synthase, FASN)是脂肪酸合成过程中的关键酶。在MASH的发生发展过程中，FASN的过度激活导致肝细胞内脂肪酸合成显著增强，从而引起肝内脂质沉积、脂毒性损伤、炎症及纤维化反应[4]。FASN抑制剂通过直接干预脂肪酸合成关键酶，显著减少脂肪酸和脂毒性代谢产物的产生，有助于缓解肝脏的氧化应激及炎症反应。因此，FASN抑制剂在MASH的治疗中展现出广阔的应用前景，有望开发为MASH治疗药物。
药物再利用(又称药物重定位)，是一种旨在从现有药物发掘新治疗适应症的策略。相较于从头开始的新药研发，该策略具有开发风险低、安全性高、研发周期短和成本显著降低等多方面优势[5]。本研究旨在对美国食品药品监督管理局已批准通过I期临床试验的药物进行虚拟筛选，以发现潜在靶向FASN并产生MASH治疗作用的候选药物，通过体外细胞实验验证其生物活性。同时，通过分子动力学模拟进一步评估蛋白–配体复合物的结合稳定性。本研究有望通过药物再利用策略，发现具有MASH治疗潜力的新型FASN抑制剂，加速MASH治疗药物的开发进程。
2. 方法
2.1. 蛋白与小分子预处理
FASN蛋白结构(PDB ID: 8ZEV)来源于RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)。使用PyMOL 2.6.0软件将FASN受体蛋白进行修饰，并通过AutoDockTools-1.5.7软件进行分子对接前的预处理操作。FDA批准药物数据来源于Selleck化合物数据库，从中筛选分子量低于1000的药物分子构建小分子药物数据库，并利用Raccoon VS-1.5.7工具对小分子药物数据库进行预处理，最终获得3473个适用于分子对接的小分子配体PDBQT格式文件。
2.2. 基于分子对接的虚拟筛选
使用AutoDockTools-1.5.7软件，以FASN蛋白坐标中心建立边长为40 nm的正方体对接盒子。随后，利用AutoDock Vina软件对预处理后的小分子药物与FASN蛋白进行分子对接，共筛选出37种具有较强结合亲和力的小分子候选药物。进一步筛选出结合能力最强的5个潜在候选药物。利用PyMOL 2.6.0和Discovery Studio 2019软件对上述候选药物的对接结果进行可视化分析，以评估其与FASN蛋白的结合模式。
2.3. MASH细胞模型的构建与活性评价
使用游离脂肪酸(油酸:棕榈酸 = 2:1)诱导HepG2细胞构建MASH体外细胞模型。HepG2细胞购自上海富衡生物科技有限公司；实验所用化学试剂购自上海麦克林生化科技有限公司；细胞培养相关试剂均购自北京兰杰柯生物技术有限公司；用于检测甘油三酯(Triglyceride, TG)和谷草转氨酶(Aspartate Aminotransferase, AST)的生化检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
MASH细胞模型建立：将HepG2细胞以3 × 105个/mL的密度接种于6孔板中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24小时。随后使用1.0 mM浓度的游离脂肪酸溶液进行孵育，同时向药物处理组中分别加入不同的候选药物分子溶液，共孵育12小时。按照生化检测试剂盒说明书进行样品处理、检测及分析。阳性药物选择MASH上市药物Resmetirom，所有实验均至少独立重复进行三次，每组数据的样本量n = 6，使用GraphPad Prism软件进行实验结果统计学分析并绘制柱状图。
2.4. 实时荧光定量PCR
从各组细胞中提取总RNA，经纯化后使用PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) (Takara)逆转录合成cDNA。逆转录反应条件为：37℃反应15分钟，85℃酶失活5秒，随后迅速降温至4℃。使用Takara TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara)进行cDNA的特异性扩增。引物序列见表1，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用全自动医学PCR分析系统(天隆科技)进行实时监测。qRT-PCR反应程序如下：95℃预变性30秒；随后进行40个循环，包括95℃变性5秒、60℃退火34秒。扩增结束后，使用PCR系统的自动温控程序进行熔解曲线分析。所有实验均至少独立重复进行三次，每组数据的样本量n = 6，实验数据使用GraphPad Prism软件进行统计学分析并绘制柱状图。
Table 1. qRT-PCR primer
表1. qRT-PCR引物
GENE |
Primer (5'-3') |
Human FASN |
Forward |
CAATTCTGCCATAAGCCCTGTCCTC |
Reverse |
ACTTGGTGTTGCTGGTGAGTGTG |
Human ACC |
Forward |
TGTCCTTCTCCTCCAACCTCAACC |
Reverse |
CTGCCAGCCTGTCATCCTCAATATC |
Human SREBP1 |
Forward |
TACCACCAGCGTCTACCATAGCC |
Reverse |
CTTGCGATGCCTCCAGAAGTACAC |
Human CPT1A |
Forward |
TCCAGTTGGCTTATCGTGGTG |
Reverse |
TCCAGAGTCCGATTGATTTTTGC |
Human ACOX1 |
Forward |
CCGCCTGGAACTTGGAGATCATTG |
Reverse |
GGTCCCGATTTCACGAATAGGTACG |
Human FABP1 |
Forward |
TCGGAAATCGTGCAGAATGGGAAG |
Reverse |
TGGTGATTATGTCGCCGTTGAGTTC |
Human GAPDH |
Forward |
CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT |
Reverse |
AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC |
2.5. 分子动力学模拟
使用GROMACS 2024.1软件进行分子动力学(Molecular Dynamics, MD)模拟[6]。通过pdb2gmx工具生成蛋白质拓扑结构，并选用CHARMM36力场构建水模型，蛋白质末端进行“
”和“COO−”处理。配体拓扑结构通过CGenFF工具(https://app.cgenff.com/)生成，构建蛋白–配体复合物后，生成系统拓扑文件，并定义边界为1 nm的模拟盒，随后加入水分子，并添加Na⁺或Cl−以中和系统电荷。
完成系统构建后，首先进行能量最小化以确保体系稳定收敛，随后依次进行NVT和NPT平衡模拟。分子动力学模拟持续100 ns，模拟过程中每2 ps记录一次轨迹，生成轨迹文件。利用GROMACS内置工具对轨迹文件进行分析。最终采用QtGrace v0.2.6软件绘图，以全面评估复合物的结构稳定性。
3. 结果与讨论
3.1. 潜在FASN受体抑制剂的虚拟筛选
采用AutoDock Vina软件对小分子药物数据库与FASN蛋白进行分子对接，共筛选出37种具有较强结合能力的候选化合物(结合能 < −9.0 kcal/mol)，其中有2个药物分子的结合能低于−10 kcal/mol。通过PyMOL 2.6.0与Discovery Studio 2019对结合能力最优的前5个候选药物分子及临床试验中的FASN抑制剂地尼法司他(Denifanstat)的对接结果进行可视化分析发现，目标药物分子与FASN蛋白具有较强的结合亲和力，并且形成较多的氢键(图1)，具有潜在的FASN抑制活性(见表2)。
Table 2. System resulting data of standard experiment
表2. 标准试验系统结果数据
Name |
Structure |
Affinity (kcal/mol) |
H-bonds |
Sennoside B |
|
−10.5 |
TYR874 LYS897 HIS1004 LYS1023 ASN1025 SER1028 |
Sennoside A |
|
−10.1 |
SER893 LEU908 HIS1004 LYS1023 ASN1025 VAL1027 ARG1063 |
Simeprevir |
|
−9.9 |
TYR874 LYS897 VAL1027 |
β-NAD |
|
−9.7 |
TYR874 SER893 ASN1025 TRP1026 |
Lisaftoclax |
|
−9.7 |
TYR874 SER893 ASN1025 |
Denifanstat |
|
−8.2 |
TYR874 |
Figure 1. Visualization of molecular docking
图1. 分子对接可视化图
3.2. 番泻苷B显著改善MASH细胞模型TG与AST水平
TG是肝脏中主要的脂质储存形式，其在肝细胞内的过度积聚是MASH的典型特征之一[7]。TG水平升高不仅反映肝细胞的脂质过载，还与胰岛素抵抗和炎症反应密切相关。因此，TG含量是评估MASH进展的重要生物学指标。在本研究中，通过游离脂肪酸诱导HepG2细胞构建MASH体外细胞模型，结果显示模型组细胞内TG含量显著高于阴性对照组。在相同浓度处理下，经五种筛选化合物孵育后，模型细胞内TG水平显著下降，表明这些候选化合物可有效降低肝细胞内脂质积聚(图2(a))。
AST主要分布于肝细胞的胞质和线粒体中。在肝脏发生炎症时，线粒体损伤导致AST释放，其酶活水平升高。在MASH的病理过程中，由于脂质过氧化和炎症反应造成肝细胞损伤，AST水平显著升高，因此AST是广泛用于反映肝脏炎症损伤的生化标志物[8]。实验结果显示，五种候选化合物均可显著降低MASH模型中AST水平，其中番泻苷B的效果优于临床药物Resmetirom (图2(b))。番泻苷B是一种口服活性血小板衍生生长因子(PDGF)抑制剂。有研究报道，番泻苷能够通过靶向VDAC1保护线粒体结构和功能，以改善高脂肪饮食诱导的肝脂肪变性。在体外实验中，番泻苷B显著改善MASH细胞模型中TG和AST水平，值得进一步探究其作用机制。
Figure 2. Effects of the virtual screening compounds on TG and AST levels in the FFAs-Induced MASH HepG2 cell model. (n = 6; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001)
图2. 虚拟筛选化合物对FFAs诱导的MASH HepG2细胞模型中TG和AST水平的影响。(n = 6; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001)
3.3. 番泻苷B通过调控SREBP1和FASN抑制脂质生成
脂肪酸合成是MASH发病过程中的关键环节。固醇调节元件结合蛋白1 (Sterol Regulatory Element-Binding Protein 1, SREBP1)作为调控脂质代谢的重要转录因子，直接调控脂肪酸合成的关键酶：FASN及乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoA Carboxylase, ACC)的表达[9]。肝脏中SREBP1的过度激活是MASH的重要病理特征，导致肝脏脂肪酸合成及脂质沉积的增加。qRT-PCR结果显示，番泻苷B显著下调SREBP1的mRNA表达水平，进而抑制FASN和ACC的表达(图3(a))，表现出对FASN受体的抑制作用。上述结果提示，番泻苷B可能通过直接及间接调控机制发挥FASN抑制效应，从而降低脂质的合成。
3.4. 番泻苷B通过调控CPT1A、ACOX1和FABP1影响脂肪酸代谢
脂肪酸代谢同样是调控MASH进展的关键环节，代谢失调可导致脂质在肝细胞中的异常积累[10]。脂肪酸代谢的关键调控因子包括肉碱棕榈酰转移酶1A (Carnitine Palmitoyltansferase 1A, CPT1A)、乙酰辅酶A氧化酶1 (Acyl-CoA Oxidase, ACOX1)和脂肪酸结合蛋白1 (Fatty Acid-Binding Protein 1, FABP1)，其表达及活性受多种因素调控，FASN在其中亦发挥重要作用。qRT-PCR分析结果显示，番泻苷B处理后显著上调MASH细胞模型中与脂肪酸氧化相关基因CPT1A、ACOX1及FABP1的mRNA表达水平(图3(b))。上述结果表明，番泻苷B通过调节CPT1A、ACOX1和FABP1等脂肪酸代谢关键调控因子的表达，促进脂肪酸的氧化代谢，进而减少肝细胞内脂质积累。
Figure 3. Regulatory effects of sennoside b on lipid metabolism-related gene expression in the cell model of MASH. (n = 6; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001)
图3. 番泻苷B对MASH细胞模型中脂质代谢相关基因表达的调控作用。(n = 6; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001)
3.5. 分子动力学模拟
3.5.1. 均方根偏差(Root Mean Square Deviation, RMSD)分析
RMSD用于量化原子位置的平均位移，能够反映蛋白质结构的稳定性。在为期100 ns的分子动力学模拟过程中，番泻苷B与FASN蛋白复合物表现出较高的稳定性(图4)。复合物的RMSD波动保持稳定，明显优于单独FASN蛋白的波动水平，表明番泻苷B结合FASN蛋白后，在模拟过程中未发生显著构象变化，从而维持了稳定的结合构象。
Figure 4. RMSD analysis of the protein-ligand complex during 100 ns molecular dynamics simulations
图4. 蛋白–配体复合物在100 ns分子动力学模拟过程中的RMSD分析
3.5.2. 氢键分析
氢键在蛋白–配体相互作用中起着关键作用。100 ns分子动力学模拟过程中，番泻苷B-FASN蛋白复合物表现出较为稳定的氢键状态。整个模拟过程中，氢键数量主要波动在1至3个之间，表明番泻苷B的整体构象保持相对稳定。氢键数量的相对稳定性意味着番泻苷B能够在模拟条件下与FASN蛋白维持较为稳定的三维构型，有利于番泻苷B与FASN蛋白之间形成稳定的相互作用，从而促进其生物功能的发挥(图5)。
Figure 5. H-bonds analysis of the protein-ligand complex during 100 ns molecular dynamics simulations
图5. 蛋白–配体复合物在100 ns分子动力学模拟过程中的氢键分析
3.5.3. 回转半径(Radius of Gyration, Rg)分析
Rg是描述蛋白整体紧密度及结构完整性的关键指标。对番泻苷B-FASN蛋白复合物在分子动力学模拟过程中Rg变化的分析，为复合物的稳定性提供了重要信息。结果显示，番泻苷B-FASN复合物的Rg值在整个100 ns模拟期间保持相对稳定(图6)，且随着模拟的进行始终保持稳定的波动。该结果表明，番泻苷B能够与FASN蛋白形成稳定且高亲和力的相互作用，这是复合物在生物学功能中有效发挥作用的重要前提。
Figure 6. Rg analysis of the protein-ligand complex during 100 ns molecular dynamics simulations
图6. 蛋白–配体复合物在100 ns分子动力学模拟过程中的Rg分析
3.5.4. 溶剂可及表面积(Solvent Accessible Surface Area, SASA)分析
SASA反映蛋白分子与周围溶剂的相互作用。对番泻苷B-FASN复合物SASA随时间变化的分析表明，在整个模拟过程中，SASA值始终保持在较窄范围内的稳定波动(图7)。SASA值的稳定表明复合物与周围溶剂环境的相互作用保持一致，未发生显著的结构重排，因而暴露表面积基本保持不变。该结果进一步验证了番泻苷B-FASN复合物在模拟条件下的整体稳定性和结构完整性。
Figure 7. SASA analysis of the protein-ligand complex during 100 ns molecular dynamics simulations
图7. 蛋白–配体复合物在100 ns分子动力学模拟过程中的SASA分析
4. 结论
本研究通过虚拟筛选与分子动力学模拟，成功筛选出潜在的FASN受体抑制剂。进一步利用游离脂肪酸诱导的体外MASH细胞模型，对所选化合物的抗MASH活性进行了验证，测定细胞内甘油三酯及谷草转氨酶水平，最终筛选出具有较好抗MASH活性的候选化合物番泻苷B。qRT-PCR实验结果表明，番泻苷B显著下调脂肪酸合成相关基因SREBP1、FASN及ACC的表达，同时上调脂肪酸氧化相关基因CPT1A、ACOX1及FABP1的表达。因此，番泻苷B可能通过抑制FASN受体，抑制脂肪酸合成并促进脂肪酸氧化，从而减少肝细胞内脂质积累。综上所述，所有结果均表明番泻苷B具有作为FASN抑制剂调节脂质合成与代谢的潜力，从而发挥MASH治疗作用，有待进一步开发为新型MASH药物。
NOTES
*通讯作者。